Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

We willen Katherine Roberts bedanken voor haar zorg voor de axolotl kolonie. Financiering voor dit werk werd verstrekt door de Connecticut Innovations Regeneratieve Geneeskunde Research Fund (15RMA-YALE-09 en 15-RMB-YALE-01) en de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individuele Postdoctorale Fellowship F32HD086942).

Experimentele procedures die in dit protocol werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) en waren in overeenstemming met alle federale beleidslijnen en richtlijnen voor het gebruik van gewervelde dieren. Alle dierproeven werden uitgevoerd op Ambystoma mexicanum (axolotls) in faciliteiten aan de Yale University.
1. Diploïde Embryo Generatie
<ol><li>Verkrijg GFP+ diploïde embryo's om te dienen als graft...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Er zijn een paar kritische stappen in ons protocol voor het genereren van haploid-diploïde chimaera's die de operationele technicus moet overwegen voor consistente enting resultaten.
De meest waarschijnlijke reden voor haploïde generatie te mislukken is te wijten aan slechte in vitro activering voorwaarden. De juiste hoeveelheden motile sperma moeten worden gebruikt om eieren te activeren. Om de beweeglijkheid te verlengen, moeten spermamonsters altijd bij 4 °C worden gehouden. Controleer v...

Historisch gezien is embryonale weefseltransplantatie bij amfibieën een belangrijke techniek geweest voor het verkennen van fundamentele mechanismen van ontwikkelingsbiologie en regeneratie. De axolotl, een soort salamander, beschikt over een indrukwekkend vermogen om weefsels en complexe structuren zoals ledematen en organen na letsel of amputatie te regenereren. Op dezelfde manier indrukwekkend, kunnen ze ontvangen, zonder afwijzing, weefselgrafts van andere individuen in embryonale, jeugdige, en volwassen stadia1,2,3. Gebieden van embryo's die hele structuren produceren, zoals ledematen, staarten, ogen en koppen, en meer specifieke weefsels, zoals neuroectoderm en somites, kunnen tussen embryo's worden geënt om chimerische dieren te produceren1,2,4,5,6. Al bijna een eeuw hebben studies van dergelijke chimerische dieren cruciale inzichten opgeleverd in regeneratie, weefseldifferentiatie, groottecontrole en patronen1,7,8.
In het laatste decennium hebben talrijke transcriptiestudies van regenererende weefsels inzichten opgeleverd in de genetische programma's die ten grondslag liggen aan salamanderregeneratie9,10,11,12,13. Deze studies hebben toegevoegd aan een groeiende lijst van kandidaat-genen die tot op heden grotendeels niet worden gekarakteriseerd in de context van regeneratie. Gerichte mutagenesetechnieken, zoals CRISPR/Cas, maken het nu mogelijk om dergelijke genen te onderzoeken, en dergelijke genetische benaderingen worden sterk vergemakkelijkt door de recente volgorde en assemblage van het grote axolotlgenoom14,15,16.
We zochten naar technieken die klassieke ontwikkelingsbiologie koppelen aan nieuwe genetische technologie met het oog op het ontleden van de mechanismen van regeneratie. Methoden voor het genereren van haploïde embryo's van axolotls en andere salamanders zijn vastgesteld voor decennia17. Hoewel deze technieken al lang worden opgemerkt als voordelen van salamanders als genetisch model organismen18, weinig latere genetische studies hebben opgenomen haploïde dieren. We gebruiken in vitro activatie in de axolotl om haploïde embryo's te produceren die dienen als weefseldonoren voor het entenvan 19. Met behulp van embryo's met fluorescerende genetische markers hebben we betrouwbare methoden ontwikkeld voor het genereren van ledematen die bijna volledig afkomstig zijn van donorweefsels(figuur 1A). Door deze twee technieken te combineren, hebben we de late embryonale letaliteit die gepaard gaat met haploidy omzeild, waardoor volledig ontwikkelde, geënte haploïde ledematen(figuur 1B, figuur 1B'en figuur 2) kunnen worden aangenomen.
Door CRISPR/Cas-gemedieerde mutagenese in haploïde embryo's uit te voeren voordat we worden geënt om chimerische axolotls met gemuteerde haploïde ledematen te maken, kunnen we de genfunctie specifiek onderzoeken in de context van de ontwikkeling en regeneratie van ledematen. Dit maakt het mogelijk om ledematen te redden van potentieel embryonaal-dodelijke mutanten. Hoewel CRISPR/Cas micro-injectie dieren kan genereren die zeer mutant zijn, zijn dergelijke dieren meestal zeer mozaïek, met een zekere mate van behoud van wildtype allelen en een verscheidenheid aan verschillende mutaties op gerichte locaties14,20. CRISPR-gebaseerde mutagenese in haploïde cellen verhoogt de penetrance van enkel allele verlies-van-functie mutaties, omdat ze niet kunnen worden gemaskeerd door behouden wildtype allelen. Om deze reden wordt crispr-gebaseerde screening in haploïde cellijnen steeds vaker gebruikt om de genetische basis van veel cellulaire processen te onderzoeken21,22,23. Door crispr-gebaseerde afstamming tracering te combineren met onze haploïde ledematen knop entandprotocollen, kan de hier beschreven aanpak dienen als een platform voor haploïde genetische schermen bij levende dieren20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Een groeiende reeks van genetische technieken en middelen stellen onderzoekers in staat om de moleculaire oorsprong van het vermogen van sommige soorten salamanders, zoals axolotls, te onderzoeken om hele ledematen als volwassenen te regenereren. Hier schetsen we technieken die worden gebruikt om chimerische axolotls te genereren met Cas9-mutagenized haploïde voorpoten die kunnen worden gebruikt voor het verkennen van de genfunctie en de getrouwheid van de regeneratie van ledematen. We combineren verschillende embryologische en genetische technieken, waaronder haploïde generatie via in vitro activatie, CRISPR/Cas9 mutagenese en weefseltransplantatie in één protocol om een uniek systeem voor haploïde genetische screening te produceren in een modelorganisme van regeneratie. Deze strategie vermindert het aantal dieren, ruimte en tijd die nodig is voor de functionele analyse van genen in de regeneratie van ledematen. Dit maakt het ook mogelijk om regeneratiespecifieke functies van genen te onderzoeken die nodig kunnen zijn voor andere essentiële processen, zoals organogenese, weefselmorfogenese en andere essentiële embryonale processen. De hier beschreven methode is een uniek platform voor het uitvoeren van haploïde genetische screening in een gewerveld modelsysteem.

Het ontwikkelen van haploïde embryo's kan worden onderscheiden van diploïde embryo's door hun 'haploïde syndroom' fenotype29. In het graft-stadium vertonen haploïde embryo's een verminderde kromming langs de voorste-achterste as en onvolledige behuizing van de dooierplug (figuur 3A). Een fluorescerende microscoop kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat haploïde embryo's vrij zijn van vaderlijk afgeleide GFP-ex...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Dit doel van dit protocol is het produceren van chimerische axolotls met haploïde voorpoten afgeleid van Cas9-mutagenized donorweefsel met behulp van embryonale weefsel enten technieken.

Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Dit protocol maakt de productie van mutagenized haploid ledematen die kunnen worden gebruikt voor genetische screening in de axolotl. Bij haploïden kan zelfs mutagenese op laag niveau verlies van functiefenotypen in cellen veroorzaken. Deze enting techniek kan ook worden gebruikt om embryonale dodelijke fenotypes te redden.Deze methode kan worden gebruikt om regeneratie te bestuderen bij amfibiesoorten die vatbaar zijn voor in vitro bevruchting en enting. Alvorens haploïde embryo's als donor te gebruiken, raden we aan om het succes van grafts tussen GFP-positieve en negatieve diploïde embryo's te oefenen en te bevestigen. Voor vrouwelijke gamete donor voorbereiding, verdoven een seksueel volwassen witte of witte RFP vrouwelijke axolotl om te dienen als de gamete donor.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pijnsimulatie, gebruik een 30-meter insulinespuit om 0,15 milliliter menselijke chorionic gonadotropin in de spierstelselrug in de achterste ledemaat te injecteren. Plaats de spuit in een hoek van 45 graden naar de middellijn om contact met het ruggenmerg te voorkomen. Plaats het geïnjecteerde dier in verse 40%Holtfreter's oplossing en breng de axolotl gedurende 48 uur over naar een koelkast van acht tot 12 graden Celsius.Breng het vrouwtje terug naar kamertemperatuur. Terwijl het vrouwtje eieren legt, plaats een volledig verdoofd mannetje in de supinepositie op vochtige papieren handdoeken onder een ontledende microscoop en plaats de punt van een P1000 pipet aan de basis van de cloaca met de dominante hand. Plaats de andere wijsvinger en duim twee tot drie centimeter rostral aan het bekken en knijp het dier terwijl u de vingers naar de achterpoten beweegt om de zaadcellen van de zaadcellen die elk monster in een nieuwe microcentrifugebuis verzamelen, uit te spoelen.Breng vervolgens vijf microliter van elk monster over in een petrischaaltje om de kwaliteit van het sperma te inspecteren met behulp van een omgekeerde microscoop. Verdun na het tellen het sperma tot een concentratie van acht keer 10 tot de vierde cel per milliliter in 0,1X steriele MMR en breng 0,5 microliter spermacellen per ei naar een nieuw petrischaaltje. Gebruik vervolgens de pipetpunt om de ophanging te verspreiden naar een een millimeter dikke laag en gebruik een plastic lift om het monster vier centimeter van de bollen van een 254 nanometer crosslinker te plaatsen voor bestraling op acht keer 10 tot de vijfde microjoule per vierkante meter.Na het verzamelen van een gezond spermamonster, plaats het vrouwtje in de supine positie op een stapel vochtige papieren handdoeken en gebruik een soortgelijke spoelbeweging om onbevruchte eieren uit de vrouwelijke axolotl te halen. Gebruik vervolgens natte tangen om de eieren over te brengen in een petrischaal van 10 centimeter. Gebruik binnen 15 minuten na het verzamelen een P10 pipet om het bestraalde sperma op de onbevruchte eieren te geven die elk ei met 0,25 tot 0,5 microliter geïnactiveerd sperma coaten.Nadat de eieren 30 minuten op kamertemperatuur zijn laten zitten, overspoelt u de eieren met 0,1 X MMR. Dertig minuten na de hydratatie, gebruik scherpe tangen om de eieren dejelly en plaats de eieren op 18 graden Celsius voor microinjectie binnen zeven uur. Voor het genereren van een haploïde-diploïde chimera, plaats een gezonde haploïde donor met een of twee fase overeenkomende GFP positieve diploïde gastheer embryo's in de trog van een voorgekoelde werkschaal met chirurgisch medium op een 10 graden Celsius of lagere koeling stadium.Gebruik twee ultra fijne autoclaved rechte tip tangen om de hele ledemaat knop en de omliggende ectoderm en mesoderm weefsel lagen te verwijderen en opzij te zetten het gastheerweefsel. Verwijder een weefselschede van gelijke grootte van de haploïde donor en plaats de haploïde donorweefselschede op het overeenkomstige gebied van het gastembryo. Bevestig het weefsel met een autoclaved rechthoekige glasscherf uit een geplette microscoop coverglass en druk het weefsel voorzichtig in het lichaam van het gastheerembryo.Laat het anker 60 tot 75 minuten controleren om de 20 minuten om te bevestigen dat het glas niet is uitgegleden voordat u de tangen gebruikt om het coverglass-fragment af te pellen. Breng de geïngrafeerde embryo's in verse chirurgische medium waardoor ze te genezen op acht tot 12 graden Celsius 's nachts voor de huisvesting van de geënteerde embryo's individueel in 12 of 24-well platen. 38,7% van de eicellen ontwikkelde zich tot normaal ontwikkelde haploïde embryo's.In het transplantaat vertonen haploïde embryo's een verminderde kromming langs de voorste achterste as en een onvolledige behuizing van de dooierplug. Bovendien kan een fluorescerende microscoop worden gebruikt om te bevestigen dat de haploïde embryo's vrij zijn van paternally-afgeleide GFP-expressie. Mislukte en onzuivere grafts produceren een verscheidenheid aan fenotypes.Wanneer de grafts schoon zijn en normaal ontwikkeld, moet GFP-expressie voornamelijk worden beperkt tot de brachial plexus, het neurale netwerk dat is afgeleid van het ruggenmerg van de gastheer. Punctate GFP expressie is ook aanwezig in enkele cellen die lijken te zijn zintuiglijke neuronen in bloed-afgeleide gastheercellen die migreren naar de zich ontwikkelende ledemaat. Wanneer RFP positieve donoren worden gebruikt, vertonen haploïde graftledematen een universele expressie van RFP.Gedurende de ontwikkeling zijn niet-gemuteerde haploidlede ledematen aanzienlijk korter dan de tegengestelde diploïde voorpoten bij chimerische dieren. Niet-mutagenized haploid ledematen volledig regenereren, hoewel ze een lichte vertraging in het bereiken van de digitale uitgroei fase in vergelijking met diploïden. Vergeet niet om steriele techniek te gebruiken en volledig te verwijderen en te vervangen de volledige mesoderm en ectoderm weefsel lagen van de embryonale gastheer om een schoon geënte ledemaat te produceren.Mutantledematen kunnen worden geamputeerd en gescoord voor regeneratie fenotypes. Mutant allelen kunnen worden gekwantificeerd met de volgende generatie sequencing. In combinatie met CRISPR-Cas9 mutagenesis heeft onze entingstechniek ons in staat gesteld om een negatief selectiescherm van gerichte genen uit te voeren bij het regenereren van haploid ledematen.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generatie Fluorescent Protein Fusies<em&gt; Candida</em&gt; Species

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...