Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
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Nous tenons à remercier Katherine Roberts pour son soin de la colonie d'axolotl. Le financement de ces travaux a été fourni par le Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 et 15-RMB-YALE-01) et le Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Bourse F32HD086942).

Les procédures expérimentales utilisées dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Yale (IACUC, 2017-10557) et étaient conformes à toutes les politiques et lignes directrices fédérales régissant l'utilisation des animaux vertébrés. Toutes les expériences animales ont été menées sur Ambystoma mexicanum (axolotls) dans des installations de l'Université Yale.
1. Génération d'embryons diploïd...

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	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Il y a quelques étapes critiques dans notre protocole pour produire des chimères haploïdes-diploïdes que le technicien d'opération devrait considérer pour des résultats cohérents de greffe.
La raison la plus probable de l'échec de la génération d'haploïdes est due à de mauvaises conditions d'activation in vitro. Les quantités appropriées de sperme motile doivent être utilisées pour activer les œufs. Pour prolonger la motilité, les échantillons de sperme doivent toujours êt...

Historiquement, la greffe de tissu embryonnaire chez les amphibiens a été une technique importante pour explorer les mécanismes fondamentaux de la biologie du développement et de la régénération. L'axolotl, une espèce de salamandre, possède une capacité impressionnante à régénérer les tissus et les structures complexes telles que les membres et les organes après une blessure ou une amputation. De même, ils peuvent recevoir, sans rejet, des greffes de tissus d'autres individus aux stades embryonnaires, juvéniles et adultes1,2,3. Les régions d'embryons qui produisent des structures entières telles que les membres, la queue, les yeux et les têtes, et des tissus plus spécifiques, tels que le neuroectoderm et les somites, peuvent être greffés entre les embryons pour produire des animaux chimériques1,2,4,5,6. Pendant près d'un siècle, les études de ces animaux chimériques ont fourni des aperçus cruciaux dans la régénération, la différenciation de tissu, le contrôle de taille, et le modelage1,7,8.
Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études transcriptionnelles sur les tissus régénérants ont permis de mieux comprendre les programmes génétiques sous-jacents à la régénération de la salamandre9,10,11,12,13. Ces études ont ajouté à une liste croissante de gènes candidats qui, à ce jour, sont en grande partie non caractérisés dans le contexte de la régénération. Les techniques ciblées de mutagénèse, telles que CRISPR/Cas, permettent maintenant l'étude de tels gènes, et de telles approches génétiques sont grandement facilitées par le séquençage et l'assemblage récents du grand génome d'axolotl14,15,16.
Nous avons cherché à développer des techniques qui associait la biologie du développement classique à une nouvelle technologie génétique dans le but de disséquer les mécanismes de régénération. Des méthodes pour produire des embryons d'axolotls et d'autres salamandres sont établies depuis des décennies17. Bien que ces techniques aient longtemps été considérées comme des avantages des salamandres en tant qu'organismes modèles génétiques18, peu d'études génétiques ultérieures ont incorporé des animaux haploïdes. Nous utilisons l'activation in vitro dans l'axolotl pour produire des embryons haploïdes qui servent de donneurs de tissus pour la greffe19. À l'aide d'embryons porteurs de marqueurs génétiques fluorescents, nous avons mis au point des méthodes fiables pour générer des membres provenant presque entièrement de tissus donneurs (figure 1A). En combinant ces deux techniques, nous avons contourné la létalité embryonnaire tardive associée à l'héloïdie, permettant la production de membres haploïdes entièrement développés et greffés(figure 1B, Figure 1B', et Figure 2).
En menant la mutagénèse CRISPR/Cas-négociée dans les embryons haploïdes avant la greffe pour créer des axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants, nous pouvons étudier la fonction de gène spécifiquement dans le contexte du développement et de la régénération de membre. Cela permet de sauver les membres de phénotypes mutants potentiellement embryonnaires-létaux. Tandis que la microinjection de CRISPR/Cas peut produire des animaux qui sont fortement mutants, de tels animaux sont typiquement fortement mosaïque, avec un certain degré de conservation des alloues sauvages de type et une série de mutations distinctes aux emplacements visés14,20. La mutagénèse basée sur CRISPR dans les cellules haploïdes augmente la pénétration des mutations de perte de fonction d'allèle simple, car elles ne peuvent pas être masquées par les allèles de type sauvage retenus. Pour cette raison, le dépistage à base de CRISPR dans les lignées de cellules haploïdes est de plus en plus utilisé pour étudier la base génétique de nombreux processus cellulaires21,22,23. En combinant la lignée à base de CRISPR traçant avec nos protocoles de greffe de bourgeons de membres haploïdes, l'approche décrite ici peut servir de plate-forme pour les écrans génétiques haploïdes chez les animaux vivants20.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Un ensemble croissant de techniques et de ressources génétiques permet aux chercheurs de sonder les origines moléculaires de la capacité de certaines espèces de salamandres, comme les axolotls, à régénérer des membres entiers à l'âge adulte. Ici, nous dénoncons les techniques utilisées pour générer des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes mutagérisés Cas9 qui peuvent être utilisés pour explorer la fonction génique et la fidélité de la régénération des membres. Nous combinons plusieurs techniques embryologiques et génétiques, y compris la génération d'haploïdes par l'activation in vitro, la mutagénèse DE CRISPR/Cas9, et la greffe de tissu dans un protocole pour produire un système unique pour le criblage génétique d'haploid dans un organisme modèle de régénération. Cette stratégie réduit le nombre d'animaux, l'espace et le temps requis pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans la régénération des membres. Ceci permet également l'étude des fonctions spécifiques de régénération des gènes qui peuvent être exigées pour d'autres processus essentiels, tels que l'organogenèse, la morphogenèse de tissu, et d'autres processus embryonnaires essentiels. La méthode décrite ici est une plate-forme unique pour effectuer le dépistage génétique des haploïdes dans un système de modèle vertébré.

Le développement d'embryons haploïdes peut être distingué des embryons diploïdes par leur phénotype29du « syndrome haploïde ». Au stade de la greffe, les embryons haploïdes présentent une courbure réduite le long de l'axe antérieur-postérieur et une enclos incomplet du bouchon jaune (Figure 3A). Un microscope fluorescent peut être utilisé pour s'assurer que les embryons d'haploïdes sont exempts d'expre...

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Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Cet objectif de ce protocole est de produire des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes dérivés du tissu donneur cas9-mutagérisé utilisant des techniques embryonnaires de greffe de tissu.

Génération d'axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants par le biais de greffeembryonnaire

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Ce protocole permet la production de membres haploïdes mutagenisés qui peuvent être utilisés pour le dépistage génétique dans l’axolotl. Chez les haploïdes, même la mutagenèse de bas niveau peut produire une perte de phénotypes de fonction dans les cellules. Cette technique de greffage peut également être utilisée pour sauver les phénotypes mortels embryonnaires.Cette méthode peut être utilisée pour étudier la régénération de toutes les espèces d’amphibiens qui peuvent être fécondées et greffées in vitro. Avant d’utiliser des embryons haploïdes comme donneurs, nous recommandons de pratiquer et de confirmer le succès des greffes entre les embryons diploïdes positifs et négatifs du GFP. Pour la préparation des donneurs de gibier féminins, anesthésier un axolotl femelle blanc ou blanc sexuellement mature pour servir de donneur de gamete.Après avoir confirmé un manque de réponse à la simulation de douleur, utilisez une seringue d’insuline de calibre 30 pour injecter 0,15 millilitres de gonadotropine chorionique humaine dans le dorsale musculature du membre postérieur. Insérez la seringue à un angle de 45 degrés à la ligne médiane pour éviter tout contact avec la moelle épinière. Placez l’animal injecté dans la solution fraîche de Holtfreter à 40 % et transférez l’axolotl dans un réfrigérateur de 8 à 12 degrés Celsius pendant 48 heures.Puis remettre la femelle à température ambiante. Pendant que la femelle pond des œufs, placez un mâle entièrement anesthésié en position supine sur des serviettes en papier humide sous un microscope disséquant et placez la pointe d’une pipette P1000 à la base du cloaque avec la main dominante. Placez l’autre index et le pouce de deux à trois centimètres rostral au bassin et pressez doucement l’animal tout en déplaçant les doigts vers les pattes postérieures pour rincer les échantillons d’urine spermique recueillant chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.Ensuite, transférez cinq microlitres de chaque échantillon dans une boîte de Pétri pour inspecter la qualité du sperme à l’aide d’un microscope inversé. Après compter, diluer le sperme à une concentration de huit fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans 0,1X RRO stérile et transférer 0,5 microlitres de spermatozoïdes par ovule à une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, utilisez la pointe pipette pour étendre la suspension à une couche d’un millimètre d’épaisseur et utilisez un ascenseur en plastique pour placer l’échantillon de quatre centimètres des ampoules d’un croisement de 254 nanomètres pour l’irradiation à huit fois 10 à la cinquième microjoules par millimètre au carré.Après avoir prélevé un échantillon de sperme sain, placez la femelle en position supine sur une pile de serviettes en papier humide et utilisez un mouvement de rinçage similaire pour extraire les œufs non fécondés de l’axolotl femelle. Ensuite, utilisez des forceps humides pour transférer les œufs dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Dans les 15 minutes qui ont pris la collecte, utilisez une pipette P10 pour distribuer le sperme irradié sur les ovules non fécondés enduisant chaque ovule de 0,25 à 0,5 microlitres de sperme inactivé.Après avoir laissé les œufs reposer à température ambiante pendant 30 minutes, inonder les œufs de 0,1 X MMR. Trente minutes après l’hydratation, utiliser des forceps tranchants pour dejelly les oeufs et placer les oeufs à 18 degrés Celsius pour la microinjection dans les sept heures. Pour générer une chimère haploïde-diploïde, placez un donneur haploïde en bonne santé avec un ou deux embryons d’hôtes diploïdes positifs GFP assortis à l’intérieur de l’auge d’un plat d’opération pré-réfrigéré contenant un milieu chirurgical à un stade de refroidissement de 10 degrés Celsius ou inférieur.Utilisez deux forceps droits autoclavés ultra fins pour enlever l’ensemble du bourgeon du membre et les couches de tissu ectoderm et mésodérme environnantes et mettre de côté le tissu hôte. Retirer une gaine tissulaire de taille équivalente du donneur d’haploïdes et placer la gaine de tissu haploïde sur la région correspondante de l’embryon hôte. Fixez le tissu à l’aide d’un éclat de verre rectangulaire autoclavé à partir d’un verre de couverture de microscope écrasé et pressez doucement le tissu dans le corps embryonnaire hôte.Laissez l’ancre en place pendant 60 à 75 minutes en vérifiant toutes les 20 minutes pour confirmer que le verre n’a pas glissé avant d’utiliser les forceps pour décoller le fragment de verre de couverture. Transférer les embryons greffés dans un milieu chirurgical frais leur permettant de guérir à 8 à 12 degrés Celsius pendant la nuit avant de loger les embryons greffés individuellement dans des plaques de 12 ou 24 puits. 38,7 % des ovocytes se sont développés en embryons haploïdes normalement développés.Au stade de la greffe, les embryons haploïdes présentent une courbure réduite le long de l’axe antérieur-postérieur et une enceinte incomplète de la prise de jaune. En outre, un microscope fluorescent peut être utilisé pour confirmer que les embryons haploïdes sont exempts d’expression GFP dérivée paternellement. Les greffes échouées et impures produisent une variété de phénotypes.Lorsque les greffes sont propres et normalement développées, l’expression GFP doit être limitée principalement au plexus brachial, le réseau neuronal dérivé de la moelle épinière hôte. L’expression punctate GFP est également présente dans les cellules individuelles qui semblent être des neurones sensoriels dans les cellules hôtes dérivées du sang qui migrent dans le membre en développement. Lorsque des donneurs positifs à la DP sont utilisés, les membres haploïdes de greffe présentent une expression universelle de la DP.Tout au long du développement, les membres haploïdes non mutagenisés sont significativement plus courts que les membres antérieurs diploïdes opposés chez les animaux chimériques. Les membres haploïdes non mutagenisés se régénèrent complètement, bien qu’ils démontrent un léger retard dans l’atteinte du stade de l’excroissance numérique par rapport aux diploïdes. N’oubliez pas d’utiliser une technique stérile et d’enlever et de remplacer complètement les couches complètes de tissu mésoderm et ectoderm de l’hôte embryonnaire afin de produire un membre proprement greffé.Les membres mutants peuvent être amputés et marqués pour les phénotypes de régénération. Les allèles mutants peuvent être quantifiés avec le séquençage de prochaine génération. Combinée à la mutagenèse CRISPR-Cas9, notre technique de greffage nous a permis d’effectuer un dépistage négatif des gènes ciblés dans la régénération des membres haploïdes.

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