Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
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Wir danken Katherine Roberts für ihre Pflege der Axolotl-Kolonie. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 und 15-RMB-YALE-01) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral) bereitgestellt. Stipendium F32HD086942).

Experimentelle Verfahren, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) genehmigt und entsprachen allen Bundesrichtlinien und Richtlinien für die Verwendung von Wirbeltieren. Alle Tierversuche wurden am Ambystoma mexicanum (Axolotls) in Einrichtungen der Yale University durchgeführt.
1. Diploid Embryo Generation
<ol><li>Erhalten Sie GFP+ diploide Embryonen, um als Transplantatwirte durch natü...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Es gibt einige kritische Schritte in unserem Protokoll zur Erzeugung von haploid-diploiden Chimären, die der Betriebstechniker für konsistente Pfropfergebnisse berücksichtigen sollte.
Der wahrscheinlichste Grund für haploid-Generation zu scheitern ist aufgrund schlechter In-vitro-AktivierungBedingungen. Die richtigen Mengen an motilen Spermien müssen verwendet werden, um Eier zu aktivieren. Um die Beweglichkeit zu verlängern, sollten Spermienproben immer bei 4 °C gehalten werden. Bevor ...

Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung1,7,8.
In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration9,10,11,12,13. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms14,15,16erheblich erleichtert.
Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert17. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen18bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen19. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B"und Abbildung 2).
Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Eine wachsende Reihe von genetischen Techniken und Ressourcen ermöglichen es Forschern, die molekularen Ursprünge der Fähigkeit einiger Salamanderarten, wie Axolotls, ganze Gliedmaßen als Erwachsene zu regenerieren, zu erforschen. Hier skizzieren wir Techniken zur Erzeugung von chimerischen Axolotls mit Cas9-mutagenisierten haploiden Vorderbeinen, die zur Erforschung der Genfunktion und der Genauigkeit der Gliedmaßenregeneration verwendet werden können. Wir kombinieren mehrere embryologische und genetische Techniken, einschließlich der haploiden Erzeugung mittels In-vitro-Aktivierung, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gewebetransplantation in einem Protokoll, um ein einzigartiges System für haploidgenetisches Screening in einem Modellorganismus der Regeneration zu produzieren. Diese Strategie reduziert die Anzahl der Tiere, den Raum und den Zeitaufwand für die funktionelle Analyse von Genen bei der Regeneration der Gliedmaßen. Dies ermöglicht auch die Untersuchung von regenerationsspezifischen Funktionen von Genen, die für andere wesentliche Prozesse wie Organogenese, Gewebemorphogenese und andere wesentliche embryonale Prozesse erforderlich sein können. Die hier beschriebene Methode ist eine einzigartige Plattform für die Durchführung haploider genetischer Screenings in einem Wirbeltiermodellsystem.

Die Entwicklung von haploiden Embryonen kann von diploiden Embryonen durch ihren "haploiden Syndrom"-Phänotyp29unterschieden werden. Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf (Abbildung 3A). Ein Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass haploide Embryonen frei von vä...

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Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion von mutagenisierten haploiden Gliedmaßen, die für das genetische Screening im Axolotl verwendet werden können. Bei Haploiden kann selbst eine niedere Mutagenese den Verlust von Funktionsphänotypen innerhalb von Zellen verursachen. Diese Transplantationstechnik kann auch zur Rettung embryonaler tödlicher Phänotypen eingesetzt werden.Diese Methode kann verwendet werden, um die Regeneration bei allen Amphibienarten zu untersuchen, die für In-vitro-Fertilisation und Transplantation geeignet sind. Bevor wir haploide Embryonen als Spender verwenden, empfehlen wir, den Erfolg von Transplantaten zwischen GFP-positiven und negativen diploiden Embryonen zu praktizieren und zu bestätigen. Für die Vorbereitung weiblicher Gamete-Spender, anästhesieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes RFP-Weibchen-Axolotl, um als Gamete-Spender zu dienen.Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Schmerzsimulation bestätigt haben, verwenden Sie eine 30 Gauge Insulinspritze, um 0,15 Milliliter humanes Choriongonadotropin in die Muskulatur dorsal in die Hinterbeinige zu injizieren. Setzen Sie die Spritze in einem 45-Grad-Winkel zur Mittellinie ein, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden. Das injizierte Tier in eine frische 40%Holtfreter-Lösung geben und das Axolotl 48 Stunden lang in einen acht bis zwölf Grad Celsius Kühlschrank geben.Dann kehren Sie das Weibchen auf Raumtemperatur zurück. Während das Weibchen Eier legt, legen Sie ein voll beseelisiertes Männchen in die Rückenlage auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop und positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette an der Basis der Kloake mit der dominanten Hand. Legen Sie den anderen Zeigefinger und Daumen zwei bis drei Zentimeter rostral in das Becken und drücken Sie das Tier sanft, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um die Spermien-Urinproben, die jede Probe sammeln, in ein neues Mikrozentrifugenrohr zu spülen.Dann übertragen Sie fünf Mikroliter aus jeder Probe in eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen. Nach dem Zählen das Sperma auf eine Konzentration von acht mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter in 0,1X sterilem MMR verdünnen und 0,5 Mikroliter Spermien pro Ei in eine neue Petrischale übertragen. Dann verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Suspension auf eine ein Millimeter dicke Schicht zu verteilen und die Probe mit einem Kunststofflift vier Zentimeter von den Glühbirnen eines 254 Nanometer-Verknüppels für die Bestrahlung bei achtmal 10 bis fünf Mikrojoule pro Millimeter quadratisch zu platzieren.Nach dem Sammeln einer gesunden Spermienprobe, legen Sie das Weibchen in der Supine-Position auf einen Stapel von feuchten Papiertüchern und verwenden Sie eine ähnliche Spülbewegung, um unbefruchtete Eier aus dem weiblichen Axolotl zu extrahieren. Dann verwenden Sie nasse Zange, um die Eier in eine 10 Zentimeter Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Entnahme eine P10-Pipette, um das bestrahlte Sperma auf die unbefruchteten Eier zu verteilen, die jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 Mikroliter inaktivierten Spermien beschichten.Nachdem Sie die Eier 30 Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, überfluten Sie die Eier mit 0,1X MMR. Dreißig Minuten nach der Hydratation, verwenden Scharfe Zange, um die Eier zu entjelly und legen Sie die Eier bei 18 Grad Celsius für Mikroinjektion innerhalb von sieben Stunden. Um eine haploid-diploide Chimäre zu erzeugen, platzieren Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei Stufen abgestimmten GFP-positiven diploiden Wirtsembryonen in den Trog einer vorgekühlten Operationsschale, die chirurgisches Medium auf einem 10 Grad Celsius oder niedrigeren Kühlstadium enthält.Verwenden Sie zwei ultrafeine autoklavierte gerade Spitzenzange, um die gesamte Gliedmaßenknospe und die umgebenden Ektoderm- und Mesodermgewebeschichten zu entfernen und das Wirtsgewebe beiseite zu legen. Entfernen Sie eine gleichwertig große Gewebescheide vom haploiden Spender und legen Sie die haploide Spendergewebescheide auf den entsprechenden Bereich des Wirtsembryons. Sichern Sie das Gewebe mit einer autoklavierten rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop-Coverglas und drücken Sie das Gewebe vorsichtig in den Körper des Wirtsembryons.Lassen Sie den Anker für 60 bis 75 Minuten an Ort und Stelle, um alle 20 Minuten zu überprüfen, ob das Glas nicht gerutscht ist, bevor Sie die Zange verwenden, um das Deckglasfragment abzublättern. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen in ein frisches chirurgisches Medium, so dass sie über Nacht bei acht bis 12 Grad Celsius heilen können, bevor sie die transplantierten Embryonen einzeln in 12 oder 24-Well-Platten beherbergen. 38,7 % der Eizellen entwickelten sich zu normal entwickelten haploiden Embryonen.Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf. Darüber hinaus kann ein Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, um zu bestätigen, dass die haploiden Embryonen frei von väterlicher GFP-Expression sind. Gescheiterte und unreine Transplantate produzieren eine Vielzahl von Phänotypen.Wenn die Transplantate sauber und normal entwickelt sind, sollte die GFP-Expression in erster Linie auf den Brachialplexus beschränkt werden, das neuronale Netzwerk, das vom Wirtsrückenmark abgeleitet wird. Punctate GFP-Expression ist auch in einzelnen Zellen vorhanden, die sensorische Neuronen in blutabgeleiteten Wirtszellen zu sein scheinen, die in die sich entwickelnde Gliedmaße wandern. Wenn RFP-positive Spender verwendet werden, weisen haploide Transplantat-Glieder einen universellen Ausdruck von RFP auf.Während der gesamten Entwicklung sind nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen deutlich kürzer als die gegnerischen diploiden Vorderbeine bei chimarischem Tier. Nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen regenerieren sich vollständig, obwohl sie eine leichte Verzögerung beim Erreichen des digitalen Auswuchsstadiums im Vergleich zu Diploiden zeigen. Denken Sie daran, sterile Technik zu verwenden und vollständig entfernen und ersetzen Sie die vollen Mesoderm und Ektoderm Gewebeschichten aus dem embryonalen Wirt, um eine sauber transplantierte Gliedmaße zu produzieren.Mutante Gliedmaßen können amputiert und für Regenerations-Phänotypen bewertet werden. Mutante Allele können mit der Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert werden. In Kombination mit CRISPR-Cas9 Mutagenese hat unsere Pfropftechnik es uns ermöglicht, einen negativen Selektionsschirm von gezielten Genen bei der Regeneration haploider Gliedmaßen durchzuführen.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

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Forschung

Genetik

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

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Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

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Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

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