Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
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우리는 축색동 식민지의 그녀의 배려에 대한 캐서린 로버츠에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 기금은 코네티컷 혁신 재생 의학 연구 기금 (15RMA-YALE-09 및 15-RMB-YALE-01)과 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (개별 박사 후 박사 과정)에 의해 제공되었습니다. 펠로우십 F32HD086942).

이 프로토콜에 사용된 실험 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, 2017-10557)에 의해 승인되었으며 척추 동물의 사용을 규제하는 모든 연방 정책 및 지침에 따라있었습니다. 모든 동물 실험은 예일 대학의 시설에서 암비스토마 멕시카눔(악소로트)에서 수행되었다.
1. 디플로이드 배아 생성
<ol><li>하나 또는 두 개의 gfp 부모24를사용하여 ...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

운영 기술자가 일관된 접목 결과를 위해 고려해야 할 haploid-diploid 키메라를 생성하기 위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
haploid 생성이 실패하는 가장 가능성이 높은 이유는 시험관 내 활성화 조건이 좋지 기 때문입니다. 운동성 정자의 적당한 양은 계란을 활성화하기 위하여 이용되어야 합니다. 운동성을 연장하기 위해 정자 샘플은 항상 4 °C에서 유지되어야...

역사적으로, 양서류에 있는 배아 조직 이식은 발달 생물학 및 재생의 근본적인 기계장치를 탐구하기 위한 중요한 기술이었습니다. 도롱뇽 의 종 인 액소로틀은 부상이나 절단 후 사지 및 장기와 같은 조직과 복잡한 구조를 재생하는 인상적인 능력을 가지고 있습니다. 마찬가지로 인상적으로, 그들은 배아, 청소년 및 성인 단계1,2,3에서다른 개인으로부터 거부, 조직 이식을받지 않고받을 수 있습니다. 사지, 꼬리, 눈 및 머리와 같은 전체 구조를 생성하는 배아의 영역, 신경 외피 및 소미트와 같은 보다 구체적인 조직은 키메라 동물을 생산하기 위해 배아 사이에 이식 될 수 있습니다1,2,4,5,6. 거의 한 세기 동안, 이러한 키메라 동물의 연구는 재생에 중요한 통찰력을 제공하고있다, 조직 분화, 크기 제어, 및 패터닝1,7,8.
지난 10 년 동안, 재생 조직의 수많은 전사 연구는 도롱뇽 재생9,10,11,12,13의기본 유전 프로그램에 대한 통찰력을 생산하고있다. 이 연구 결과는, 현재까지, 재생의 맥락에서 크게 특성화되지 않은 후보 유전자의 확장 목록에 추가했습니다. CRISPR/Cas와 같은 표적 돌연변이 유발 기술은 이제 이러한 유전자의 조사를 허용하고, 이러한 유전적 접근법은 최근 큰 액소로틀 게놈14,15,16의시퀀싱 및 조립에 의해 크게 촉진된다.
우리는 재생의 기계장치를 해부하기 위한 목적으로 고전적인 발달 생물학을 새로운 유전 기술과 결합하는 기술을 개발하고자 했습니다. 액소로톨 및 기타 도롱뇽의 하플로이드 배아를 생성하는 방법은 수십 년 동안17년동안 확립되어 왔다. 이러한 기술은 오랫동안 유전 모델유기체18로도롱뇽의 장점으로 지적되었지만, 몇 가지 후속 유전 연구는 haploid 동물을 통합했다. 우리는이식19를위한 조직 기증자역할을 하는 haploid 배아를 생성하기 위하여 axolotl에 있는 시험관 내 활성화를 이용합니다. 형광 유전 마커를 운반하는 배아를 사용하여, 우리는 기증자 조직에서 거의 전적으로 파생된 사지를 생성하기 위한 믿을 수 있는 방법을 고안했습니다(그림 1A). 이 두 기술을 결합해서, 우리는 haploidy와 관련되었던 늦은 배아 치사성을 우회하여, 완전히 개발된, 이식된 haploid 사지의 생산을 허용합니다(그림 1B, 그림 1B'및 그림 2).
돌연변이 haploid 사지를 가진 키메라 axolotls를 만들기 위하여 이식하기 전에 haploid 태아에 있는 CRISPR/Cas 중재한 돌연변이 발생을 수행해서, 우리는 사지 발달 과 재생의 문맥 내의 유전자 기능을 구체적으로 조사할 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 배아 치명적인 돌연변이 표현형에서 사지의 구출을 허용합니다. CRISPR/Cas 미세주사는 매우 돌연변이가 높은 동물을 생성할 수 있지만, 이러한 동물은 전형적으로 매우 모자이크이며, 어느 정도의 야생형 대두류및 표적 부위에서의 다양한 뚜렷한돌연변이를가진다.4,20. haploid 세포에 있는 CRISPR 기지를 둔 돌연변이 발생은 유지된 야생형 eeles에 의해 마스크될 수 없기 때문에, 기능의 단 하나 대문자 손실 돌연변이의 침투를 증가합니다. 이러한 이유로, 하플로이드 세포주에서 CRISPR 기반 스크리닝은 많은 세포 과정의 유전적 기초를 조사하기 위해 점점 더 많이 사용되고있다 21,22,23. CRISPR 기반 계보 추적과 우리의 haploid 사지 싹 접목 프로토콜을 결합함으로써, 여기에 설명된 접근법은 살아있는 동물20에서haploid 유전 스크린을 위한 플랫폼으로 작용할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

유전 기술과 자원의 성장 세트는 연구원이 성인으로 전체 사지를 재생하는 축색꽃과 같은 도롱뇽의 일부 종의 능력의 분자 기원을 탐구 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 유전자 기능 및 사지 재생의 충실도를 탐구하기 위하여 이용될 수 있는 Cas9 돌연변이 화한 haploid 앞다리를 가진 키메라 axolotls를 생성하는 데 이용된 기술을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관 내 활성화, CRISPR/Cas9 돌연변이 발생, 조직 이식을 통해 여러 배아 및 유전 적 기술을 결합하여 재생의 모델 유기체에서 haploid 유전 스크리닝을위한 독특한 시스템을 생산합니다. 이 전략은 사지 재생에서 유전자의 기능 적 분석에 필요한 동물, 공간 및 시간의 수를 감소시킨다. 이것은 또한 유기 발생 조직 형성, 조직 형태 형성 및 그밖 필수 배아 프로세스와 같은 그밖 필수 프로세스를 위해 요구될 수 있는 유전자의 재생 특정 기능의 조사를 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 척추동물 모델 시스템에서 haploid 유전자 스크리닝을 수행하기위한 독특한 플랫폼입니다.

발달하는 haploid 배아는 그들의 'haploid 증후군' 표현형29에의해 이형 배아와 구별될 수 있습니다. 이식 단계에서, haploid 배아는 노른자 플러그의 전방 후방 축 및 불완전한 인클로저를 따라 감소 된 곡률을 나타낸다(그림 3A). 형광 현미경은 haploid 배아가 친자 유래 GFP 발현의 자유롭다는 것을 확인하기 위하여 이용될 수 있...

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Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

이 프로토콜은 축소로텔에서 유전 검열에 사용될 수 있는 돌연변이된 haploid 사지의 생산을 허용합니다. haploids에서, 심지어 낮은 수준의 돌연변이 발생은 세포 내의 기능 표현형의 손실을 생성할 수 있습니다. 이 접목 기술은 또한 배아 치명적인 표현형을 구출하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 방법은 체외 수정 및 접목에 순종하는 모든 양용 종에서 재생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. haploid 배아를 기증자로 사용하기 전에 GFP 양성 및 부정적인 디플로이드 배아 사이의 이식의 성공을 연습하고 확인하는 것이 좋습니다. 여성 게이머 기증자 준비를 위해, 성적으로 성숙한 흰색 또는 흰색 RFP 여성 axolotl을 마취하여 gamete 기증자로 봉사합니다.통증 시뮬레이션에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 인간의 융기 생식선 인 성 생식샘을 뒷다리에 근육 에 0.15 밀리리터를 주입하십시오. 척수와의 접촉을 피하기 위해 주사기를 중간라인에 45도 각도로 삽입합니다. 주입된 동물을 신선한 40% Holtfreter용용으로 넣고 액졸로틀을 섭씨 8~12도의 냉장고로 48시간 동안 옮겨놓습니다.그런 다음 여성을 실온으로 되돌려 보입니다. 암컷이 알을 낳는 동안, 해부 현미경 아래 젖은 종이 타월에 완전히 마취 된 남성을 배치하고 지배적 인 손으로 클로카의 기지에 P1000 파이펫의 끝을 배치합니다. 다른 에이핑거와 엄지손가락 2~3센티미터 로스트랄을 골반에 놓고 손가락을 뒷다리쪽으로 움직이면서 동물을 부드럽게 짜서 각 샘플을 새로운 미세원심심분리기 튜브로 채취한 정자 소변 샘플을 씻어냅니다.그런 다음 각 샘플에서 5개의 마이크로리터를 페트리 접시로 옮겨 반전된 현미경을 사용하여 정자의 품질을 검사합니다. 카운트 후, 0.1X 멸균 MMR에서 밀리리터 당 네 번째 세포에 8 배 10의 농도로 정자를 희석하고 새로운 페트리 접시에 계란 당 정자 세포의 0.5 마이크로 리터를 전송. 그런 다음 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 1mm 두께층으로 확산시키고 플라스틱 리프트를 사용하여 254 나노미터 크로스링커의 전구에서 4센티미터 떨어진 샘플을 밀리미터 제곱당 8회 10번에서 제곱당 5마이크로줄로 조사합니다.건강한 정자 샘플을 수집 한 후, 젖은 종이 타월의 스택에 supine 위치에 여성을 배치하고 여성 axolotl에서 수정되지 않은 계란을 추출하는 유사한 홍조 운동을 사용합니다. 그런 다음 젖은 집게를 사용하여 계란을 10센티미터 페트리 접시로 옮기습니다. 수집 15 분 이내에 P10 파이펫을 사용하여 각 계란을 0.25 ~ 0.5 마이크로 리터의 불활성화 된 정자로 코팅하는 수정되지 않은 계란에 조사 된 정자를 분배하십시오.계란이 30 분 동안 실온에 앉을 수 있게 한 후 계란을 0.1X MMR로 범람하십시오. 수분 후 30 분, 계란을 데젤리하 고 7 시간 이내에 미세 주입에 대 한 18 섭씨에 계란을 배치 날카로운 집게를 사용 하 여. haploid-diploid chimera를 생성하려면, 10섭씨 이하 의 수술 매체를 포함하는 사전 냉장 작동 접시의 트로프 안에 GFP 양성 디플로이드 호스트 배아와 하나 또는 두 개의 단계 일치한 1개의 건강한 haploid 기증자를 놓습니다.두 개의 초미세 오토클레이브 스트레이트 팁 집게를 사용하여 사지 전체와 주변 외장 및 중피 조직 층을 제거하고 호스트 조직을 따로 둡니다. haploid 기증자에서 동등한 크기의 조직 칼집을 제거하고 호스트 태아의 해당 영역에 haploid 기증자 조직 칼집을 놓습니다. 분쇄 된 현미경 커버 글래스에서 자동 직사각형 유리 조각으로 조직을 고정하고 조직을 숙주 배아 몸으로 부드럽게 누릅니다.덮개 유리 조각을 벗겨 포셉을 사용하기 전에 유리가 미끄러지지 않은지 확인하기 위해 20 분마다 60 ~ 75 분 동안 앵커를 둡니다. 이식된 배아를 신선한 수술 매체로 옮기면 12또는 24웰 플레이트에 개별적으로 이식된 배아를 수용하기 전에 하룻밤 사이에 섭씨 8~12도에서 치유할 수 있습니다. 38.7%의 난모세포가 정상적으로 발달된 haploid 배아로 발전했습니다.접목 단계에서, haploid 배아는 전방 후방 축및 노른자 플러그의 불완전한 인클로저를 따라 감소된 곡률을 나타낸다. 또한, 형광 현미경은 haploid 배아가 친자 유래 GFP 발현이 없는지 확인하기 위해 사용될 수 있다. 실패하고 불순한 이식편은 다양한 표현형을 생성합니다.이식편이 깨끗하고 일반적으로 개발될 때, GFP 발현은 주로 상반신 신경총, 숙주 척수에서 파생된 신경망으로 제한되어야 합니다. Punctate GFP 발현은 또한 개발 사지로 이동하는 혈액 유래 숙주 세포에 있는 감각 뉴런으로 나타나는 단 하나 세포에서 존재합니다. RFP 양성 기증자가 사용될 때, haploid 접목 사지는 RFP의 보편적인 표현을 전시합니다.개발 전반에 걸쳐, 비 돌연변이 된 haploid 사지는 키메라 동물의 반대 디플로이드 앞다리보다 상당히 짧습니다. 비 돌연변이 된 haploid 사지는 완전히 재생, 비록 그들은 디플로이드에 비해 디지털 성장 단계에 도달에 약간의 지연을 보여줍니다. 멸균 기술을 사용하고 완전히 제거하고 깨끗하게 접목 된 사지를 생산하기 위해 배아 호스트에서 전체 중피 및 자궁 조직 층을 교체하는 것을 기억하십시오.돌연변이 사지는 절단하고 재생 표현형을 위해 득점될 수 있습니다. 돌연변이 진상제는 차세대 시퀀싱으로 정량화될 수 있습니다. CRISPR-Cas9 돌연변이 발생과 결합하여, 우리의 이식 기술은 우리가 haploid 사지를 재생에 표적 유전자의 부정적인 선택 화면을 수행 할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

연구

유전학

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...