Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Vi vil takke Katherine Roberts for hennes omsorg for axolotlkolonien. Støtte til dette arbeidet ble gitt av Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 og 15-RMB-YALE-01) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Stipendiat F32HD086942).

Eksperimentelle prosedyrer som brukes i denne protokollen ble godkjent av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) og var i samsvar med alle føderale retningslinjer og retningslinjer som regulerer bruk av virveldyr dyr. Alle dyreforsøk ble utført på Ambystoma mexicanum (axolotls) i anlegg ved Yale University.
1. Diploid Embryo Generasjon
<ol><li>Få GFP+ diploid embryoer for å tjene som graft verter gjennom naturlig parring ved hjelp av en...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Det er noen kritiske skritt i vår protokoll for å generere haploid-diploid chimeras som driftsteknikeren bør vurdere for konsistente poderesultater.
Den mest sannsynlige årsaken til haploid generasjon å mislykkes skyldes dårlig in vitro aktiveringsforhold. De riktige mengdene av motile sperm må brukes til å aktivere egg. For å forlenge motilitet, bør sædprøver alltid opprettholdes ved 4 °C. Før du påfører noen sædprøve på egg, kontroller levedyktigheten til sæden ved hjelp ...

Historisk har embryonale vevpode i amfibier vært en viktig teknikk for å utforske grunnleggende mekanismer for utviklingsbiologi og regenerering. Axolotl, en art av salamander, har en imponerende evne til å regenerere vev og komplekse strukturer som lemmer og organer etter skade eller amputasjon. Tilsvarende imponerende, de kan motta, uten avvisning, vev grafts fra andre personer på embryonale, juvenile, og voksne stadier1,2,3. Regioner av embryoer som produserer hele strukturer som lemmer, haler, øyne og hoder, og mer spesifikke vev, som neuroectoderm og somitter, kan podes mellom embryoer for å produsere kimeriske dyr1,2,4,5,6. I nesten et århundre har studier av slike kimeriske dyr gitt avgjørende innsikt i regenerering, vevdifferensiering, størrelseskontroll og mønster1,7,8.
I det siste tiåret, mange transkripsjonelle studier av regenererende vev har produsert innsikt i de genetiske programmene underliggende salamander regenerering9,10,11,12,13. Disse studiene har lagt til en voksende liste over kandidatgener som hittil i stor grad er ukarakterisert i sammenheng med regenerering. Målrettede mutagenesis teknikker, som CRISPR / Cas, nå tillate undersøkelse av slike gener, og slike genetiske tilnærminger er sterkt tilrettelagt av den siste sekvensering og montering av den store axolotl genom14,15,16.
Vi forsøkte å utvikle teknikker som kombinerte klassisk utviklingsbiologi med ny genetisk teknologi med det formål å dissekere mekanismene for regenerering. Metoder for å generere haploidembryoer av axolotler og andre salamander har blitt etablert i flere tiår17. Mens disse teknikkene lenge har vært kjent for å være fordeler med salamander som genetiske modell organismer18, få påfølgende genetiske studier har innlemmet haploid dyr. Vi bruker in vitro aktivering i axolotl å produsere haploid embryoer som tjener som vev donorer for pode19. Ved hjelp av embryoer som bærer fluorescerende genetiske markører, har vi utviklet pålitelige metoder for å generere lemmer avledet nesten utelukkende fra donorvev (Figur 1A). Ved å kombinere disse to teknikkene, har vi omgått den sene embryonale dødeligheten forbundet med haploidy, slik at for produksjon av fullt utviklede, transplanterte haploidlemmer (Figur 1B, Figur 1B'og Figur 2).
Ved å gjennomføre CRISPR/Cas-mediert mutagenesis hos haploidembryoer før pode for å skape kimeriske axolotler med muterte haploidlemmer, kan vi undersøke genfunksjon spesielt innenfor rammen av lemutvikling og regenerering. Dette gjør det mulig å redde lemmer fra potensielt embryonale-dødelige muterte fenotyper. Mens CRISPR / Cas mikroinjeksjon kan generere dyr som er svært mutant, slike dyr er vanligvis svært mosaikk, med en viss grad av oppbevaring av wildtype alleles og en rekke forskjellige mutasjoner på målrettede steder14,20. CRISPR-basert mutagenesis i haploidceller øker penetansen til enkelt allele tap av funksjon mutasjoner, da de ikke kan maskeres av beholdt villtype alleler. Av denne grunn brukes CRISPR-basert screening i haploidcellelinjer i økende grad til å undersøke det genetiske grunnlaget for mange cellulære prosesser21,22,23. Ved å kombinere CRISPR-basert avstamning sporing med våre haploid lem knopp pode protokoller, tilnærmingen beskrevet her kan tjene som en plattform for haploid genetiske skjermer i levende dyr20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Et voksende sett med genetiske teknikker og ressurser gjør det mulig for forskere å undersøke den molekylære opprinnelsen til evnen til noen arter av salamander, for eksempel axolotls, å regenerere hele lemmer som voksne. Her skisserer vi teknikker som brukes til å generere kimeriske axolotls med Cas9-mutagenized haploid forben som kan brukes til å utforske genfunksjon og troskap av lem regenerering. Vi kombinerer flere embryologiske og genetiske teknikker, inkludert haploid generasjon via in vitro aktivering, CRISPR / Cas9 mutagenesis, og vev pode i en protokoll for å produsere et unikt system for haploid genetisk screening i en modell organisme av regenerering. Denne strategien reduserer antall dyr, rom og tid som kreves for funksjonell analyse av gener i lemregenerering. Dette tillater også undersøkelse av regenereringsspesifikke funksjoner av gener som kan være nødvendig for andre viktige prosesser, som organogenese, vevmorfose og andre essensielle embryonale prosesser. Metoden som er beskrevet her er en unik plattform for å gjennomføre haploid genetisk screening i et virveldyr modellsystem.

Utvikling av haploidembryoer kan skilles fra difterloid embryoer ved deres 'haploid syndrom' fenotype29. Ved graft-stadium viser haploidembryoer redusert krumning langs den fremre bakre aksen og ufullstendig kabinett av eggeplommepluggen (figur 3A). Et fluorescerende mikroskop kan brukes til å sikre at haploidembryoer er fri for paternalt avledet GFP-uttrykk (figur 3B).</...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Dette målet med denne protokollen er å produsere kimeriske axolotls med haploid forben avledet fra Cas9-mutagenized donor vev ved hjelp av embryonale vev pode teknikker.

Generasjon av kimeriske axolotler med mutant haploid lemmer gjennom embryonisk pode

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Denne protokollen tillater produksjon av mutageniserte haploid lemmer som kan brukes til genetisk screening i axolotl. I haploids, selv lavt nivå mutagenesis kan produsere tap av funksjon fenotyper i celler. Denne podeteknikken kan også brukes til å redde embryonale dødelige fenotyper.Denne metoden kan brukes til å studere regenerering i noen amfibier arter som er mottagelig for in vitro befruktning og pode. Før du bruker haploid embryoer som donorer, anbefaler vi å praktisere og bekrefte suksessen til grafts mellom GFP positive og negative diploid embryoer. For kvinnelige gamete donor forberedelse, bedøve en seksuelt moden hvit eller hvit RFP kvinnelige axolotl å tjene som gamete donor.Etter å ha bekreftet mangel på respons på smertesimulering, bruk en 30 gauge insulinsprøyte til å injisere 0,15 milliliter humant choriongonadotropin i muskulaturdosen til bakbenet. Sett sprøyten i en 45 graders vinkel til midtlinjen for å unngå kontakt med ryggmargen. Plasser det injiserte dyret i fersk 40% Holtfreters løsning og overfør axolotl til et åtte til 12 grader Celsius kjøleskap i 48 timer.Deretter returnerer hunnen til romtemperatur. Mens kvinnen legger egg, legg en fullt bedøvet mann i liggende stilling på fuktige papirhåndklær under et dissekeringsmikroskop og plasser spissen av en P1000 pipette ved foten av cloaca med den dominerende hånden. Plasser den andre pekefingeren og tommelen to til tre centimeter rostral til bekkenet og klem forsiktig dyret mens du beveger fingrene mot bakbenene for å skylle ut spermiske urinprøver som samler hver prøve inn i et nytt mikrocentrifugerør.Deretter overfører du fem mikroliter fra hver prøve til en petriskål for å inspisere kvaliteten på sæden ved hjelp av et omvendt mikroskop. Etter telling, fortynne sperm til en konsentrasjon på åtte ganger 10 til fjerde celler per milliliter i 0,1X steril MMR og overføre 0,5 mikroliter av sædceller per egg til en ny Petri parabolen. Bruk deretter pipettespissen til å spre suspensjonen til et en millimeter tykt lag og bruk en plastheis til å plassere prøven fire centimeter fra pærene til en 254 nanometer crosslinker for bestråling på åtte ganger 10 til den femte mikrojouler per millimeter kvadrert.Etter å ha samlet en sunn spermprøve, legg kvinnen i liggende stilling på en stabel med fuktige papirhåndklær og bruk en lignende spylebevegelse for å trekke ut ubefruktede egg fra den kvinnelige axolotl. Bruk deretter våte tang til å overføre eggene til en 10 centimeter petriskål. Innen 15 minutter etter innsamling, bruk en P10 pipette til å dispensere bestrålt sperm på ubefruktet egg belegg hvert egg med 0,25 til 0,5 mikroliter av inaktivert sperm.Etter å ha tillatt eggene å sitte ved romtemperatur i 30 minutter, oversvømme eggene med 0, 1X MMR. Tretti minutter etter hydrering, bruk skarpe tang for å dejelly eggene og legg eggene på 18 grader Celsius for mikroinjeksjon innen syv timer. For å generere en haploid-diploid chimera, plasser en sunn haploid donor med ett eller to trinn matchet GFP positive diploid vert embryoer inne i trau av en pre-kjølt driftsfat som inneholder kirurgisk medium på en 10 grader Celsius eller lavere kjøletrinn.Bruk to ultra fine autoklavert rett spiss tang for å fjerne hele lem knoppen og de omkringliggende ectoderm og mesoderm vev lag og sette til side verten vev. Fjern en tilsvarende størrelse vevshylse fra den haploid donor og plasser den haploid donor vev hylse på den tilsvarende regionen av verten embryo. Fest vevet med en autoklavet rektangulær glassskår fra et knust mikroskopdekselglass og trykk forsiktig vevet inn i vertsembryokroppen.La ankeret være på plass i 60 til 75 minutter ved å sjekke hvert 20. Overfør de engrafterte embryoene til ferskt kirurgisk medium slik at de kan helbrede ved åtte til 12 grader Celsius over natten før de huser de engrafterte embryoene individuelt i 12 eller 24-brønnplater. 38,7% av oocytes utviklet seg til normalt utviklede haploid embryoer.På podestadiet viser haploid embryoer en redusert krumning langs fremre bakre akse og et ufullstendig kabinett av eggeplommepluggen. I tillegg kan et fluorescerende mikroskop brukes til å bekrefte at de haploide embryoene er fri for paternalt avledet GFP-uttrykk. Mislykkede og urene grafts produserer en rekke fenotyper.Når transplantatene er rene og normalt utviklet, bør GFP-uttrykket begrenses primært til brachial plexus, det nevrale nettverket avledet fra vertsmargen. Punktat GFP-uttrykk er også tilstede i enkeltceller som ser ut til å være sensoriske nevroner i blodavledede vertsceller som migrerer inn i det utviklende lemmet. Når RFP positive givere brukes, viser haploid graft lemmer et universelt uttrykk for RFP.Gjennom utviklingen er ikke-mutageniserte haploid lemmer betydelig kortere enn de motstridende diploid forbenene hos kimeriske dyr. Ikke-mutageniserte haploid lemmer fullt regenerere, selv om de viser en liten forsinkelse i å nå den digitale utvekststadiet sammenlignet med diploids. Husk å bruke steril teknikk og helt fjerne og erstatte hele mesoderm og ectoderm vev lag fra embryonale verten for å produsere en rent podet lem.Muterte lemmer kan amputeres og scores for regenerering fenotyper. Mutant alleler kan kvantifiseres med neste generasjons sekvensering. Kombinert med CRISPR-Cas9 mutagenesis, har vår podeteknikk tillatt oss å gjennomføre en negativ utvalgsskjerm av målrettede gener i regenererende haploid lemmer.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Tolket gjennom Grape Berry Metabolomics og transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av Fluorescent Protein Fusions i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Bruke neste generasjons sekvensering til å identifisere mutasjoner forbundet med reparasjon av et CAS9-indusert dobbeltstrengsbrudd i nærheten av CD4-promotoren

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...