Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Katherine Roberts por seus cuidados com a colônia de axolotl. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver (Pós-Doutorado Individual Bolsa F32HD086942).

Os procedimentos experimentais utilizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale (IACUC, 2017-10557) e estavam de acordo com todas as políticas e diretrizes federais que regem o uso de animais vertebrados. Todos os experimentos em animais foram realizados em Ambystoma mexicanum (axolotls) em instalações da Universidade de Yale.
1. Geração de embriões diploidedos
<ol><li>Obtenha embriões diploides GFP+ pa...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Existem alguns passos críticos em nosso protocolo para gerar quimeras haplóide-ddiploide que o técnico operacional deve considerar para resultados consistentes de enxerto.
A razão mais provável para a geração haploide falhar é devido às más condições de ativação in vitro. As quantidades adequadas de espermatozoides motile devem ser usadas para ativar óvulos. Para prolongar a motilidade, as amostras de esperma devem ser sempre mantidas a 4 °C. Antes de aplicar qualquer amostra d...

Historicamente, o enxerto de tecido embrionário em anfíbios tem sido uma técnica importante para explorar mecanismos fundamentais de biologia e regeneração do desenvolvimento. O axolotl, uma espécie de salamandra, possui uma impressionante capacidade de regenerar tecidos e estruturas complexas, como membros e órgãos após lesões ou amputação. Da mesma forma impressionante, eles podem receber, sem rejeição, enxertos teciduais de outros indivíduos nos estágios embrionário, juvenil e adulto1,2,3. Regiões de embriões que produzem estruturas inteiras como membros, caudas, olhos e cabeças, e tecidos mais específicos, como neuroectoderme e somitas, podem ser enxertados entre embriões para produzir animais quiméricos1,2,4,5,6. Por quase um século, estudos desses animais quiméricos têm proporcionado insights cruciais sobre regeneração, diferenciação tecidual, controle de tamanho e padronização1,7,8.
Na última década, inúmeros estudos transcricionais de tecidos regeneradores produziram insights sobre os programas genéticos subjacentes à regeneração da salamandra9,10,11,12,13. Esses estudos se somaram a uma lista crescente de genes candidatos que, até o momento, são em grande parte descaracterizados no contexto da regeneração. Técnicas de mutagênese direcionadas, como crispr/cas, agora permitem a investigação de tais genes, e tais abordagens genéticas são muito facilitadas pelo sequenciamento recente e montagem do grande genoma axolotl14,15,16.
Buscamos desenvolver técnicas que acoplassem biologia clássica ao desenvolvimento com novas tecnologias genéticas com o objetivo de dissecar os mecanismos de regeneração. Métodos para gerar embriões haploides de axolotis e outros salamandras foram estabelecidos há décadas17. Embora essas técnicas tenham sido apontadas há muito tempo como vantagens dos salamandras como organismos modelo genéticos18, poucos estudos genéticos subsequentes incorporaram animais haploides. Usamos ativação in vitro no axolotl para produzir embriões haploides que servem como doadores de tecidos para enxerto19. Usando embriões que carregam marcadores genéticos fluorescentes, criamos métodos confiáveis para gerar membros derivados quase inteiramente de tecidos doadores(Figura 1A). Ao combinar essas duas técnicas, contornamos a letalidade embrionária tardia associada à haploide, permitindo a produção de membros heplóides totalmente desenvolvidos e enxertados(Figura1B, Figura 1Be Figura 2).
Ao conduzir a mutagênese mediada crispr/cas em embriões haploides antes do enxerto para criar axolotos quiméricos com membros haploides mutantes, podemos investigar a função genética especificamente dentro do contexto de desenvolvimento e regeneração dos membros. Isso permite o resgate de membros de fenótipos mutantes potencialmente embrionários-letais. Enquanto a microinjeção CRISPR/Cas pode gerar animais altamente mutantes, esses animais são tipicamente altamente mosaicos, com algum grau de retenção de alelos de tipo selvagem e uma variedade de mutações distintas em locais alvo14,20. A mutagênese à base de CRISPR em células haploides aumenta a penetração de mutações de perda de função de alelo único, pois não podem ser mascaradas por alelos do tipo selvagem retidos. Por essa razão, o rastreamento à base de CRISPR em linhas de células haploides é cada vez mais usado para investigar a base genética de muitos processos celulares21,22,23. Combinando rastreamento de linhagem à base de CRISPR com nossos protocolos de enxerto de bud alheio haploide, a abordagem descrita aqui pode servir como uma plataforma para telas genéticas haploides em animais vivos20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Um conjunto crescente de técnicas e recursos genéticos permite aos pesquisadores sondar as origens moleculares da capacidade de algumas espécies de salamandras, como axolotlas, de regenerar membros inteiros como adultos. Aqui, delineamos técnicas usadas para gerar axolotas quiméricas com membros dianteiros haploides haploides mutagenizados cas9 que podem ser usados para explorar a função genética e a fidelidade da regeneração dos membros. Combinamos várias técnicas embrionárias e genéticas, incluindo geração haploide via ativação in vitro, mutagênese CRISPR/Cas9 e enxerto de tecido em um protocolo para produzir um sistema único para triagem genética haploide em um organismo modelo de regeneração. Essa estratégia reduz o número de animais, espaço e tempo necessários para a análise funcional dos genes na regeneração dos membros. Isso também permite a investigação de funções específicas de regeneração de genes que podem ser necessárias para outros processos essenciais, como organogênese, morfose tecidual e outros processos embrionários essenciais. O método descrito aqui é uma plataforma única para a realização de triagem genética haploide em um sistema de modelo vertebrado.

O desenvolvimento de embriões haploides pode ser distinguido de embriões diploides pelo fenótipo29da sua "síndrome haploide". Em estágio de enxerto, os embriões haploides exibem curvatura reduzida ao longo do eixo anterior-posterior e cerco incompleto do plugue de gema (Figura 3A). Um microscópio fluorescente pode ser usado para garantir que os embriões haploides estejam livres de expressão gfp paternalmente d...

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Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Este protocolo permite a produção de membros haploides mutagenizados que podem ser usados para triagem genética no axolotl. Em haploides, mesmo mutagênese de baixo nível pode produzir perda de fenótipos de função dentro das células. Esta técnica de enxerto também pode ser usada para resgatar fenótipos letais embrionários.Este método pode ser usado para estudar a regeneração em qualquer espécie anfíbia que seja amenável à fertilização in vitro e enxerto. Antes de usar embriões haploides como doadores, recomendamos praticar e confirmar o sucesso dos enxertos entre os embriões diploides positivos e negativos. Para a preparação do doador de gameta feminino, anestesiar uma axolotl feminina RFP branca ou branca sexualmente madura para servir como doadora de gameta.Após confirmar a falta de resposta à simulação da dor, use uma seringa de insulina calibre 30 para injetar 0,15 mililitros de gonadotropina coriônica humana na musculatura dorsal para o membro traseiro. Insira a seringa em um ângulo de 45 graus até a linha média para evitar o contato com a medula espinhal. Coloque o animal injetado na solução fresca de 40% holtfreter e transfira o axolotl para uma geladeira de 8 a 12 graus Celsius por 48 horas.Em seguida, volte a fêmea à temperatura ambiente. Enquanto a fêmea está colocando ovos, coloque um macho totalmente anestesiado na posição supina em toalhas de papel úmido sob um microscópio dissecando e posicione a ponta de uma pipeta P1000 na base da cloaca com a mão dominante. Coloque o outro indicador e o polegar de dois a três centímetros rostral para a pelve e aperte suavemente o animal enquanto move os dedos em direção às pernas traseiras para liberar as amostras de urina espergênicas coletando cada amostra em um novo tubo de microcentrifuuge.Em seguida, transfira cinco microlitros de cada amostra para uma placa de Petri para inspecionar a qualidade do esperma usando um microscópio invertido. Após a contagem, dilui o esperma para uma concentração de oito vezes 10 para a quarta célula por mililitro em 0,1X mmr estéril e transferir 0,5 microliters de células espermatozoides por óvulo para uma nova placa de Petri. Em seguida, use a ponta da pipeta para espalhar a suspensão para uma camada de um milímetro de espessura e use um elevador plástico para colocar a amostra a quatro centímetros das lâmpadas de um crosslinker de 254 nanômetros para irradiação em oito vezes 10 para o quinto microjoules por milímetro quadrado.Depois de coletar uma amostra saudável de esperma, coloque a fêmea na posição supina em uma pilha de toalhas de papel úmidas e use um movimento de descarga semelhante para extrair óvulos não fertilizados da axolotl fêmea. Em seguida, use fórceps molhados para transferir os ovos para uma placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de 15 minutos após a coleta, use uma pipeta P10 para distribuir o esperma irradiado sobre os óvulos não fertilizados que cobrem cada óvulo com 0,25 a 0,5 microliters de esperma inativado.Depois de permitir que os ovos fiquem em temperatura ambiente por 30 minutos, inunde os ovos com 0,1X MMR. Trinta minutos após a hidratação, use fórceps afiados para desapropriar os ovos e coloque os ovos a 18 graus Celsius para microinjeção dentro de sete horas. Para gerar uma quimera haploide-diploide, coloque um doador haploide saudável com um ou dois estágios combinados GFP embriões diploides diploides positivos dentro do cocho de um prato operacional pré-refrigerado contendo meio cirúrgico em um estágio de resfriamento de 10 graus Celsius ou inferior.Use duas fórceps de ponta reta autoclavadas ultra finas para remover todo o botão do membro e as camadas de tecido ectoderm circundante e mesoderm e reserve o tecido hospedeiro. Remova uma baia de tecido de tamanho equivalente do doador de haploide e coloque a baia de tecido do doador haploide na região correspondente do embrião hospedeiro. Fixar o tecido com um fragmento de vidro retangular autoclaved de um vidro de microscópio esmagado e pressione suavemente o tecido no corpo do embrião hospedeiro.Deixe a âncora no lugar por 60 a 75 minutos verificando a cada 20 minutos para confirmar que o vidro não escorregou antes de usar as fórceps para retirar o fragmento da tampa. Transfira os embriões engrafados para um meio cirúrgico fresco, permitindo que eles se curem a 8 a 12 graus Celsius durante a noite antes de abrigar os embriões engrafados individualmente em placas de 12 ou 24 poços. 38,7% dos oócitos desenvolveram-se em embriões haploides normalmente desenvolvidos.Na fase de enxerto, os embriões haploides exibem uma curvatura reduzida ao longo do eixo anterior-posterior e um gabinete incompleto do plugue de gema. Além disso, um microscópio fluorescente pode ser usado para confirmar que os embriões haploides estão livres da expressão GFP derivada paternamente. Enxertos impuros e falhos produzem uma variedade de fenótipos.Quando os enxertos são limpos e normalmente desenvolvidos, a expressão GFP deve ser limitada principalmente ao plexo braquial, a rede neural derivada da medula espinhal hospedeira. A expressão de GFP pontual também está presente em células únicas que parecem ser neurônios sensoriais em células hospedeiras derivadas do sangue que migram para o membro em desenvolvimento. Quando os doadores positivos de RFP são usados, os membros do enxerto haploide exibem uma expressão universal de RFP.Durante todo o desenvolvimento, membros haploides não mutagenizados são significativamente mais curtos do que os membros dianteiros diploides opostos em animais quiméricos. Membros haploides não mutagenizados se regeneram totalmente, embora demonstrem um pequeno atraso em alcançar o estágio de crescimento digital em comparação com os diploides. Lembre-se de usar técnica estéril e remova e substitua completamente as camadas completas de tecido de mesoderm e ectoderm do hospedeiro embrionário, a fim de produzir um membro limpo mente enxertado.Membros mutantes podem ser amputados e pontuados para fenótipos de regeneração. Alelos mutantes podem ser quantificados com sequenciamento de próxima geração. Combinada com mutagênese CRISPR-Cas9, nossa técnica de enxerto nos permitiu conduzir uma tela de seleção negativa de genes-alvo na regeneração de membros haploides.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Genética

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Produção de fusões de proteína fluorescente em<em&gt; Candida</em&gt; Espécies

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...