Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).

Экспериментальные процедуры, используемые в этом протоколе, были утверждены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных йельского университета (IACUC, 2017-10557) и соответствовали всем федеральным правилам и руководящим принципам, регулирующим использование позвоночны...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.
Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активац...

Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и более конкретные ткани, такие как нейроэктодерм и сомиты, могут быть привиты между эмбрионами для производства химерных животных1,2,4,6. На протяжении почти столетия, исследования таких химерных животных предоставили решающее понимание регенерации, дифференциации тканей, контроля размера, и узор1,7,8.
В последнее десятилетие, многочисленные транскрипционные исследования регенерирующих тканей дали понимание генетических программ, лежащих в основе регенерации саламандры9,10,11,12,13. Эти исследования добавили к расширяющемуся списку генов-кандидатов, которые на сегодняшний день в значительной степени не характерны в контексте регенерации. Целевые методы мутагенеза, такие как CRISPR/ Cas, теперь позволяют исследуют такие гены, и такие генетические подходы в значительной степени облегчаются недавним секвенированием и сборкой большого аксолотла генома14,15,16.
Мы стремились разработать методы, которые соединяли классическую биологию развития с новой генетической технологией с целью вскрытия механизмов регенерации. Методы генерации гаплоидных эмбрионов аксолотлов и других саламандр были созданы на протяжениидесятилетий 17. Хотя эти методы уже давно отмечается, что преимущества саламандры, как генетическая модель организмов18, несколько последующих генетических исследований включили гаплоидных животных. Мы используем интроактивации в аксолотле для производства гаплоидных эмбрионов, которые служат донорами тканей для прививки19. Используя эмбрионы, несущие флуоресцентные генетические маркеры, мы разработали надежные методы генерации конечностей, полученных почти полностью из донорских тканей(рисунок 1А). Объединив эти два метода, мы обошли поздней эмбриональной летальности, связанной с гаплоидией, что позволяет для производства полностью развитых, привитых гаплоидных конечностей(Рисунок 1B, Рисунок 1B', и Рисунок 2).
Проводя CRISPR/Cas-опосредованный мутагенез в гаплоидных эмбрионах до прививки для создания химерных аксолотлов с мутантными гаплоидными конечностями, мы можем исследовать функцию генов конкретно в контексте развития конечностей и регенерации. Это позволяет спасать конечности от потенциально эмбрионально-смертельных фенотипов мутантов. Хотя CRISPR / Cas микроинъекции может генерировать животных, которые являются весьма мутант, такие животные, как правило, очень мозаики, с некоторой степенью удержания аллелей дикого типа и различные различные мутации в целевых местах14,20. Мутагенез на основе CRISPR в гаплоидных клетках увеличивает пенетранс одного аллеля потери функции мутаций, так как они не могут быть замаскированы сохраненными аллелями дикого типа. По этой причине скрининг на основе CRISPR в гаплоидных клеточных линиях все чаще используется для исследования генетической основы многих клеточных процессов21,22,23. Объединив CRISPR основе линии отслеживания с нашими гаплоидных протоколов прививки конечностей, подход, описанный здесь может служить платформой для гаплоидных генетических экранов у живых животных20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.

Развитие гаплоидных эмбрионов можно отличить от диплоидных эмбрионов по их фенотипу «гаплоидного синдрома»29. На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней задней оси и неполным корпусом желтоковой вилки<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.

Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Этот протокол позволяет производство мутагенизированных гаплоидных конечностей, которые могут быть использованы для генетического скрининга в аксолотле. При гаплоидах даже низкоуровневый мутагенез может привести к потере фенотипов функции в клетках. Этот метод прививки также может быть использован для спасения эмбриональных смертельных фенотипов.Этот метод может быть использован для изучения регенерации в любых видах земноводных, которые подменяются экстракорпорального оплодотворения и прививки. Перед использованием гаплоидных эмбрионов в качестве доноров, мы рекомендуем практиковать и подтверждать успех трансплантатов между GFP положительных и отрицательных диплоидных эмбрионов. Для женской подготовки донора gamete, анестезировать сексуально зрелый белый или белый RFP женский аксолотль, чтобы служить в качестве донора gamete.После подтверждения отсутствия реакции на моделирование боли, использовать 30 калибровочный инсулин шприц для введения 0,15 миллилитров человека хорионический гонадотропин в мускулатуру спинной к задней конечности. Вставьте шприц под углом 45 градусов к средней линии, чтобы избежать контакта со спинным мозгом. Поместите инъекционной животных в свежем растворе 40%Holtfreter и передать аксолотль в 8 до 12 градусов по Цельсию холодильник в течение 48 часов.Затем верните самку к комнатной температуре. В то время как самка откладывает яйца, поместите полностью анестезированого самца в положение на спине на влажных бумажных полотенцах под рассекающий микроскоп и располагайте кончик пипетки P1000 у основания клоаки доминирующей рукой. Поместите другой указательный палец и большой палец от двух до трех сантиметров рострального к тазу и осторожно сжать животное при перемещении пальцев к задним ногам, чтобы избавиться от образцов спермы мочи сбора каждого образца в новую трубку микроцентрифуг.Затем перенесите пять микролитров из каждого образца в чашку Петри, чтобы проверить качество спермы с помощью перевернутого микроскопа. После подсчета, разбавить сперму до концентрации восемь раз 10 до четвертого клетки на миллилитр в 0,1X стерильных MMR и передачи 0,5 микролитров сперматозоидов на яйцо в новую чашку Петри. Затем используйте наконечник пипетки, чтобы распространить подвеску на слой толщиной в один миллиметр и использовать пластиковый лифт, чтобы поместить образец в четырех сантиметрах от ламп 254 нанометрового кросслинкера для облучения в восемь раз от 10 до пятого микроджоуля на миллиметр в квадрате.После сбора здорового образца спермы, поместите самку в положение на спине на стопку влажных бумажных полотенец и использовать аналогичные промывки движения для извлечения неоплодотвореных яйцеклеток из женского аксолотля. Затем используйте влажные типсы, чтобы перевести яйца в 10-сантиметровую чашку Петри. В течение 15 минут после сбора, используйте P10 пипетку, чтобы обойтись облученной спермы на неутилизованных яйцеклеток покрытие каждой яйцеклетки с 0,25 до 0,5 микролитров инактивированной спермы.После разрешения яйца сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут, затопить яйца с 0.1X MMR. Тридцать минут после гидратации, использовать острые миппы, чтобы dejelly яйца и место яйца при 18 градусов по Цельсию для микроинъекции в течение семи часов. Для генерации гаплоидно-диплоидной химеры поместите одного здорового гаплоидного донора с одной или двумя стадиями, сопостановившимися с GFP положительными эмбрионами-диплоидными хостами внутри корыта предварительно охлажденной операционной тарелки, содержащей хирургическую среду на 10 градусов по Цельсию или нижней стадии охлаждения.Используйте два ультра тонкой autoclaved прямой кончик тибры, чтобы удалить весь бутон конечностей и окружающих эктодермов и мезодерм слоев ткани и выделить ткани хозяина. Удалите оболочку ткани эквивалентного размера из гаплоидного донора и поместите гаплоидную оболочку донорской ткани на соответствующую область эмбриона хозяина. Закрепить ткань автоклавом прямоугольного стеклянного осколка из измельченного микроскопа крышкой и аккуратно прижимать ткань к телу эмбриона хозяина.Оставьте якорь на месте в течение 60 до 75 минут проверки каждые 20 минут, чтобы подтвердить, что стекло не поскользнулся перед использованием типса, чтобы снять фрагмент стекловолокна. Перенесите присвяченные эмбрионы в свежую хирургическую среду, позволяющую им исцелиться при 8-12 градусах Цельсия за одну ночь до того, как они будут обуславлены эмбрионами индивидуально в 12 или 24-х пластинах. 38,7% яйцеклеток превратились в нормально развитые гаплоидные эмбрионы.На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней-задней оси и неполным корпусом желтковой пробки. Кроме того, флуоресцентный микроскоп может быть использован для подтверждения гаплоидных эмбрионов, свободных от выражения GFP по отцовской линии. Неудачные и нечистые трансплантаты производят различные фенотипы.Когда трансплантаты чисты и нормально разработаны, выражение GFP должно быть ограничено главным образом брахиальным сплетением, нейронной сетью, полученной из спинного мозга хозяина. ПунктаТ GFP выражение также присутствует в одиночных клетках, которые, как представляется, сенсорные нейроны в крови полученных клеток-хозяй, которые мигрируют в развивающейся конечности. Когда RFP положительные доноры используются, гаплоидных трансплантатных конечностей демонстрируют универсальное выражение RFP.На протяжении всего развития, немутагенизированные гаплоидные конечности значительно короче, чем противоположные диплоидные конечности у химерных животных. Немутагенизированные гаплоидные конечности полностью регенерируют, хотя они демонстрируют небольшую задержку в достижении цифровой стадии нарости по сравнению с диплоидами. Не забудьте использовать стерильную технику и полностью удалить и заменить полный мезодерм и эктодерм слоев ткани из эмбрионального хозяина для того, чтобы произвести чисто привитой конечности.Мутант конечностей могут быть ампутированы и забил для регенерации фенотипов. Мутантные аллели можно количественно оценить с помощью последовательности следующего поколения. В сочетании с CRISPR-Cas9 mutagenesis, наша техника прививки позволила нам провести отрицательный экран отбора целевых генов в регенерации гаплоидных конечностей.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Терруар Концепция толкуется через виноградной ягоды метаболомики и транскриптомика

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Поколение флуоресцентных слитых белков в<em&gt; Кандида</em&gt; Виды

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Использование секвенирования следующего поколения для выявления мутаций, связанных с восстановлением CAS9-индуцированного разрыва двойной цепи вблизи промотора CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...