Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
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Nos gustaría agradecer a Katherine Roberts por su cuidado de la colonia de axolotl. La financiación de este trabajo fue proporcionada por el Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 y 15-RMB-YALE-01) y el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Beca F32HD086942).

Los procedimientos experimentales utilizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC, 2017-10557) y estaban de acuerdo con todas las políticas y directrices federales que rigen el uso de animales vertebrados. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en Ambystoma mexicanum (axolotls) en instalaciones de la Universidad de Yale.
1. Generación de embriones diploides
<ol><li>Obtener embr...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Hay algunos pasos críticos en nuestro protocolo para generar quimeras haploide-diploides que el técnico operativo debe considerar para obtener resultados consistentes de injerto.
La razón más probable para que la generación de haploides falle es debido a las malas condiciones de activación in vitro. Se deben utilizar las cantidades adecuadas de espermatozoides móviles para activar los óvulos. Para prolongar la motilidad, las muestras de espermatozoides deben mantenerse siempre a 4 oC. ...

Históricamente, el injerto de tejido embrionario en anfibios ha sido una técnica importante para explorar los mecanismos fundamentales de la biología del desarrollo y la regeneración. El axolotl, una especie de salamandra, posee una impresionante capacidad para regenerar tejidos y estructuras complejas como extremidades y órganos después de una lesión o amputación. Del mismo modo, pueden recibir, sin rechazo, injertos de tejido de otros individuos en etapas embrionarias, juveniles y adultas1,2,3. Las regiones de embriones que producen estructuras enteras como extremidades, colas, ojos y cabezas, y tejidos más específicos, como neuroectoderm y somitas, pueden ser injertadas entre embriones para producir animales quiméricos1,2,4,5,6. Durante casi un siglo, los estudios de estos animales quiméricos han proporcionado información crucial sobre la regeneración, diferenciación de tejidos, control de tamaño, y el patrón1,7,8.
En la última década, numerosos estudios transcripcionales de tejidos regeneradores han producido información sobre los programas genéticos subyacentes a la regeneración de salamandras9,10,11,12,13. Estos estudios se han sumado a una lista en expansión de genes candidatos que, hasta la fecha, no se caracterizan en gran medida en el contexto de la regeneración. Las técnicas de mutagénesis dirigidas, como CRISPR/Cas, ahora permiten la investigación de estos genes, y tales enfoques genéticosse ven muy facilitados por la reciente secuenciación y montaje del gran genoma del axololo1,15,16.
Buscamos desarrollar técnicas que combinaran la biología clásica del desarrollo con la nueva tecnología genética con el propósito de disuadar los mecanismos de regeneración. Durante décadas17se han establecido métodos para generar embriones haploides de axolotls y otras salamandras. Si bien estas técnicas se han observado durante mucho tiempo como ventajas de las salamandras como organismos modelo genéticos18, pocos estudios genéticos posteriores han incorporado animales haploides. Utilizamos la activación in vitro en el axolotl para producir embriones haploides que sirven como donantes de tejido para el injerto19. Utilizando embriones portadores de marcadores genéticos fluorescentes, hemos ideado métodos fiables para generar extremidades derivadas casi en su totalidad de tejidos de donantes(Figura 1A). Mediante la combinación de estas dos técnicas, hemos evitado la letalidad embrionaria tardía asociada con la haploidy, permitiendo la producción de extremidades haploides completamente desarrolladas e injertadas(Figura 1B, Figura 1B'y Figura 2).
Mediante la realización de mutagénesis mediada por CRISPR/Cas en embriones haploides antes del injerto para crear axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes, podemos investigar la función génica específicamente en el contexto del desarrollo y la regeneración de las extremidades. Esto permite el rescate de las extremidades de fenotipos mutantes potencialmente embrionarios-letales. Mientras que la microinyección CRISPR/Cas puede generar animales altamente mutantes, estos animales son típicamente altamente mosaicos, con cierto grado de retención de alelos de tipo salvaje y una variedad de mutaciones distintas en los sitios objetivo14,20. La mutagénesis basada en CRISPR en células haploides aumenta la penetración de mutaciones de pérdida de función de alelos únicos, ya que no pueden enmascararse con alelos de tipo salvaje retenidos. Por esta razón, el cribado basado en CRISPR en líneas celulares haploides se utiliza cada vez más para investigar la base genética de muchos procesos celulares21,22,23. Mediante la combinación de trazas de linaje basadas en CRISPR con nuestros protocolos de injerto de cogollos de extremidades haploides, el enfoque descrito aquí puede servir como una plataforma para pantallas genéticas haploides en animales vivos20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Un creciente conjunto de técnicas y recursos genéticos permite a los investigadores sondear los orígenes moleculares de la capacidad de algunas especies de salamandras, como los axolotls, para regenerar extremidades enteras como adultos. Aquí, delineamos las técnicas utilizadas para generar axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides mutagenizadas cas9 que se pueden utilizar para explorar la función génica y la fidelidad de la regeneración de las extremidades. Combinamos varias técnicas embrionarias y genéticas, incluyendo la generación de haploides a través de activación in vitro, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de tejido en un solo protocolo para producir un sistema único para el cribado genético haploide en un organismo modelo de regeneración. Esta estrategia reduce el número de animales, el espacio y el tiempo necesario para el análisis funcional de genes en la regeneración de extremidades. Esto también permite la investigación de funciones específicas de regeneración de genes que pueden ser necesarias para otros procesos esenciales, como la organogénesis, la morfogénesis tisular y otros procesos embrionarios esenciales. El método descrito aquí es una plataforma única para llevar a cabo análisis genéticos haploides en un sistema modelo de vertebrados.

El desarrollo de embriones haploides puede distinguirse de los embriones diploides por su fenotipo29del "síndrome haploide". En la etapa del injerto, los embriones haploides presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un encieimiento incompleto del tapón de la yema(Figura 3A). Se puede utilizar un microscopio fluorescente para garantizar que los embriones haploides estén libres de expres...

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Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Este protocolo permite la producción de extremidades haploides mutagenizadas que se pueden utilizar para el cribado genético en el axolotl. En los haploides, incluso la mutagénesis de bajo nivel puede producir pérdida de fenotipos de función dentro de las células. Esta técnica de injerto también se puede utilizar para rescatar fenotipos letales embrionarios.Este método se puede utilizar para estudiar la regeneración en cualquier especie de anfibio que sea susceptible de fertilización in vitro e injerto. Antes de utilizar embriones haploide como donantes, recomendamos practicar y confirmar el éxito de los injertos entre embriones diploide positivos de la GFP y los embriones diploides negativos. Para la preparación de donantes de gametos femeninos, anestesia una a axolotl hembra RFP blanca o blanca sexualmente madura para que sirva como donante de gametos.Después de confirmar una falta de respuesta a la simulación del dolor, utilice una jeringa de insulina de calibre 30 para inyectar 0,15 mililitros de gonadotropina coriónica humana en la musculatura dorsal a la extremidad posterior. Inserte la jeringa en un ángulo de 45 grados en la línea media para evitar el contacto con la médula espinal. Coloque el animal inyectado en una solución fresca de 40%Holtfreter y transfiera el axolotl a un refrigerador de ocho a 12 grados Celsius durante 48 horas.A continuación, vuelva a la hembra a temperatura ambiente. Mientras la hembra pone huevos, coloque a un macho completamente anestesiado en la posición supina sobre toallas de papel húmedas bajo un microscopio diseccionado y coloque la punta de una pipeta P1000 en la base de la cloaca con la mano dominante. Coloque el otro dedo índice y el pulgar de dos a tres centímetros rosados a la pelvis y apriete suavemente al animal mientras mueve los dedos hacia las patas traseras para eliminar las muestras de orina espermáticas que recogen cada muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga.Luego transfiera cinco microlitros de cada muestra a una placa Petri para inspeccionar la calidad de los espermatozoides usando un microscopio invertido. Después de contar, diluir el espermatozoide a una concentración de ocho veces 10 a las cuartas células por mililitro en MMR estéril 0.1X y transferir 0,5 microlitros de espermatozoides por óvulo a un nuevo plato de Petri. A continuación, utilice la punta de la pipeta para extender la suspensión a una capa de un milímetro de espesor y utilice un elevador de plástico para colocar la muestra a cuatro centímetros de las bombillas de un reticulador de 254 nanómetros para irradiación a ocho veces 10 a la quinta microjulios por milímetro cuadrado.Después de recoger una muestra de espermatozoides saludable, coloque la hembra en la posición supina en una pila de toallas de papel húmedas y use un movimiento de lavado similar para extraer óvulos no fecables del axolotl hembra. Luego usa fórceps húmedos para transferir los huevos a un plato de Petri de 10 centímetros. Dentro de los 15 minutos de la recolección, utilice una pipeta P10 para dispensar el esperma irradiado en los óvulos no fecados que recubren cada óvulo con 0,25 a 0,5 microlitros de espermatozoides inactivados.Después de permitir que los huevos se sienten a temperatura ambiente durante 30 minutos, inunde los huevos con 0.1X MMR. Treinta minutos después de la hidratación, use fórceps afilados para dejar de los huevos y coloque los huevos a 18 grados Celsius para la microinyección dentro de siete horas. Para generar una quimera haploide-diploide, coloque un donante haploides sano con uno o dos embriones de host diploide positivoS de GFP emparejados dentro de la vaguada de un plato de operación pre-enfriado que contenga un medio quirúrgico en una etapa de enfriamiento de 10 grados Celsius o menor.Utilice dos fórceps rectos autoclaves ultra finos para extraer toda la yema de la extremidad y las capas circundantes de tejido de ectodermo y mesodermo y deje a un lado el tejido huésped. Retire una vaina de tejido de tamaño equivalente del donante de haploide y coloque la vaina de tejido del donante haploide en la región correspondiente del embrión huésped. Asegure el tejido con un fragmento de vidrio rectangular autoclavizado de un vidrio de cubierta de microscopio triturado y presione suavemente el tejido en el cuerpo del embrión huésped.Deje el anclaje en su lugar durante 60 a 75 minutos comprobando cada 20 minutos para confirmar que el vidrio no se ha deslizado antes de usar los fórceps para despegar el fragmento de la cubierta. Transfiera los embriones injertados a un medio quirúrgico fresco, lo que les permite sanar a ocho a 12 grados centígrados durante la noche antes de albergar los embriones injertados individualmente en placas de 12 o 24 pozos. El 38,7% de los ovocitos se convirtieron en embriones haploide normalmente desarrollados.En la etapa del injerto, los embriones haploide presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un recinto incompleto del tapón de la yema. Además, se puede utilizar un microscopio fluorescente para confirmar que los embriones haploide están libres de expresión de GFP derivada paternally. Los injertos fallidos e impuros producen una variedad de fenotipos.Cuando los injertos están limpios y normalmente desarrollados, la expresión de GFP debe limitarse principalmente al plexo braquial, la red neuronal derivada de la médula espinal del huésped. La expresión punctato de LA GFP también está presente en células individuales que parecen ser neuronas sensoriales en las células huésped derivadas de la sangre que migran a la extremidad en desarrollo. Cuando se utilizan donantes positivos de RFP, las extremidades del injerto de haploide exhiben una expresión universal de RFP.A lo largo del desarrollo, las extremidades haploides no mutagenizadas son significativamente más cortas que las extremidades anteriores del diploide opuestos en animales quiméricos. Las extremidades haploides no mutagenizadas se regeneran por completo, aunque demuestran un ligero retraso en llegar a la etapa de crecimiento digital en comparación con los diploides. Recuerde utilizar la técnica estéril y eliminar y reemplazar completamente las capas completas de mesodermo y tejido de ectoderm del huésped embrionario con el fin de producir una extremidad injertada limpiamente.Las extremidades mutantes se pueden amputar y puntuar para fenotipos de regeneración. Los alelos mutantes se pueden cuantificar con la secuenciación de próxima generación. En combinación con la mutagénesis CRISPR-Cas9, nuestra técnica de injerto nos ha permitido realizar una pantalla de selección negativa de genes específicos en extremidades heploide regeneradoras.

Research

JoVE Journal

Genetics

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El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Investigación

Genética

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Generación de fusiones de proteínas fluorescentes en<em&gt; Candida</em&gt; Especies

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

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