Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Vi vill tacka Katherine Roberts för hennes vård av axolotlkolonin. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 och 15-RMB-YALE-01) och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).

Experimentella förfaranden som används i detta protokoll godkändes av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) och var förenliga med alla federala riktlinjer och riktlinjer för användning av ryggradsdjur. Alla djurförsök utfördes på Ambystoma mexicanum (axolotls) i anläggningar vid Yale University.
1. Diploid Embryo Generation
<ol><li>Få GFP + diploid embryon att fungera som moderplantor värdar genom naturlig parning med en eller...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Det finns några kritiska steg i vårt protokoll för att generera haploid-diploid chimärer som driftteknikerbör överväga för konsekvent ympning resultat.
Den mest sannolika orsaken till haploid generation att misslyckas beror på dåliga in vitro aktiveringsförhållanden. De lämpliga mängderna malsperma måste användas för att aktivera ägg. För att förlänga motiliteten bör spermieprover alltid hållas vid 4 °C. Innan du applicerar spermaprov på ägg, kontrollera spermiernas l...

Historiskt sett har embryonal vävnad ympning i amfibier varit en viktig teknik för att utforska grundläggande mekanismer för utvecklingsbiologi och förnyelse. Axolotl, en art av salamander, har en imponerande förmåga att regenerera vävnader och komplexa strukturer som lemmar och organ efter skada eller amputation. På samma sätt kan de få, utan avslag, vävnadstransplantat från andra individer på embryonala, unga och vuxna stadier1,2,3. Regioner av embryon som producerar hela strukturer såsom lemmar, svansar, ögon och huvuden, och mer specifika vävnader, såsom neuroectoderm och somiter, kan ympas mellan embryon för att producera chimära djur1,2,4,5,6. I nästan ett sekel har studier av sådana chimärdjur gett avgörande insikter i förnyelse, vävnadsdifferentiering, storlekskontroll och mönster1,7,8.
Under det senaste decenniet har många transkriptionsstudier av regenererande vävnader gett insikter i de genetiska program som ligger till grund för salamanderförnyelse9,10,11,12,13. Dessa studier har lagt till en växande lista över kandidatgener som hittills till stor del är okarakteriserade i samband med förnyelse. Riktade mutagenestekniker, såsom CRISPR/Cas, tillåter nu undersökning av sådana gener, och sådana genetiska metoder underlättas i hög grad av den senaste tidens sekvensering och montering av den stora axolotlgenomet 14,15,16.
Vi försökte utveckla tekniker som kopplade klassisk utvecklingsbiologi med ny genetisk teknik i syfte att dissekera mekanismerna för förnyelse. Metoder för att generera haploida embryon från axolotler och andra salamandrar har fastställts i årtionden17. Även om dessa tekniker länge har noterats vara fördelarna med salamandrar som genetiska modellorganismer18,har få efterföljande genetiska studier införlivat haploida djur. Vi använder in vitro aktivering i axolotl att producera haploida embryon som fungerar som vävnadgivare för ympning19. Med hjälp av embryon som transporterar fluorescerande genetiska markörer har vi utarbetat tillförlitliga metoder för att generera lemmar som nästan helt härrör från donatorvävnader(figur 1A). Genom att kombinera dessa två tekniker har vi kringgått den sena embryonala dödligheten i samband med haploidisk, vilket möjliggör produktion av fullt utvecklade, ympade haploida lemmar(figur 1B, figur 1B'och figur 2).
Genom att genomföra CRISPR/Cas-medierad mutagenes i haploida embryon före ympning för att skapa chimära axolotls med mutanta haploid lemmar, kan vi undersöka genfunktion specifikt inom ramen för lem utveckling och förnyelse. Detta gör det möjligt att rädda lemmar från potentiellt embryonala-dödliga mutant fenotyper. Medan CRISPR / Cas microinjection kan generera djur som är mycket mutant, sådana djur är vanligtvis mycket mosaik, med en viss grad av retention av vildtyp alleler och en mängd olika mutationer på riktade platser14,20. CRISPR-baserade mutagenes i haploida celler ökar penetrans av enda allel förlust-of-function mutationer, eftersom de inte kan maskeras av kvar vildtyp alleler. Av denna anledning, CRISPR-baserad screening i haploid cellinjer används alltmer för att undersöka den genetiska grunden för många cellulära processer21,22,23. Genom att kombinera CRISPR-baserade härstamning spårning med våra haploid lem knopp ympning protokoll, den strategi som beskrivs här kan fungera som en plattform för haploid genetiska skärmar hos levande djur20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

En växande uppsättning genetiska tekniker och resurser gör det möjligt för forskare att undersöka de molekylära ursprunget till förmågan hos vissa arter av salamandrar, såsom axolotls, att regenerera hela lemmar som vuxna. Här beskriver vi tekniker som används för att generera chimära axolotls med Cas9-mutagena haploida framben som kan användas för att utforska genfunktion och trohet lem förnyelse. Vi kombinerar flera embryologiska och genetiska tekniker, inklusive haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenesis, och vävnad ympning i ett protokoll för att producera ett unikt system för haploid genetisk screening i en modell organism av förnyelse. Denna strategi minskar antalet djur, utrymme och tid som krävs för funktionell analys av gener i lem förnyelse. Detta gör det också möjligt att undersöka regenereringsspecifika funktioner hos gener som kan krävas för andra viktiga processer, såsom organogenes, vävnadsmorfgenes och andra viktiga embryonala processer. Den metod som beskrivs här är en unik plattform för att genomföra haploid genetisk screening i en ryggradsdjur modellsystem.

Utveckla haploida embryon kan skiljas från diploidembryon genom deras "haploida syndrom" fenotyp29. I transplantatstadiet uppvisar haploida embryon minskad krökning längs den främre posterioraxeln och ofullständig kapsling av äggulans plugg (figur 3A). Ett fluorescerande mikroskop kan användas för att säkerställa att haploida embryon är fria från faderiskt framställda GFP-uttryck(figur...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Detta mål med detta protokoll är att producera chimära axolotls med haploida framben som härrör från Cas9-mutagena givare vävnad med embryonalvävnad ympning tekniker.

Generation av Chimeric Axolotls med Mutant Haploid lemmar genom embryonala Ympning

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Detta protokoll tillåter produktion av mutagenized haploid lemmar som kan användas för genetisk screening i axolotl. I haploider, även låg nivå mutagenesis kan producera förlust av funktion fenotyper inom celler. Denna ympningsteknik kan också användas för att rädda embryonala dödliga fenotyper.Denna metod kan användas för att studera regenerering i någon amfibieart som är mottaglig för in vitro-befruktning och ympning. Innan du använder haploid embryon som givare, rekommenderar vi att öva och bekräfta framgången för ympkvistar mellan GFP positiva och negativa diploid embryon. För kvinnliga gamete givaren förberedelse, bedöva en sexuellt mogen vit eller vit RFP kvinnliga axolotl att fungera som gamete givaren.Efter att ha bekräftat en brist på svar på smärta simulering, använd en 30 gauge insulin spruta för att injicera 0,15 milliliter av mänskliga korion gonadotropin i muskulatur dorsala till bakbenen. Sätt in sprutan i 45 graders vinkel mot mittlinjen för att undvika kontakt med ryggmärgen. Placera det injicerade djuret i färsk 40%Holtfreters lösning och överför axolotlen till ett åtta till 12 graders Celsius kylskåp i 48 timmar.Sedan tillbaka honan till rumstemperatur. Medan honan lägger ägg, placera en helt sövd hane i ryggläge på fuktiga pappershanddukar under ett dissekerande mikroskop och placera spetsen på en P1000-pipett vid basen av kloaka med den dominerande handen. Placera den andra pekfingret och tummen två till tre centimeter rostral till bäckenet och försiktigt pressa djuret samtidigt som fingrarna mot bakbenen för att spola ut de spermiska urinproven samla varje prov i en ny mikrocentrifug röret.Överför sedan fem mikroliter från varje prov till en petriskål för att inspektera spermiernas kvalitet med hjälp av ett inverterat mikroskop. Efter räkning, späd sperma till en koncentration av åtta gånger 10 till fjärde celler per milliliter i 0.1X steril MMR och överföra 0,5 mikroliter av spermier per ägg till en ny Petriskål. Använd sedan pipettspetsen för att sprida fjädringen till ett en millimeter tjockt lager och använd en plastlyft för att placera provet fyra centimeter från lökarna på en 254 nanometer crosslinker för bestrålning vid åtta gånger 10 till de femte mikrojoule per millimeter i kvadrat.Efter att ha samlat ett friskt spermieprov, placera honan i ryggläge på en bunt fuktiga pappershanddukar och använd en liknande spolningsrörelse för att extrahera obefruktade ägg från den kvinnliga axolotlen. Använd sedan våta tynor för att överföra äggen till en 10 centimeter Petriskål. Inom 15 minuter efter insamling, använd en P10 pipetter för att fördela den bestrålade spermier på obefruktade ägg beläggning varje ägg med 0,25 till 0,5 mikroliter av inaktiverad spermier.Efter att äggen har 50 minuter att sitta i rumstemperatur, översvämma äggen med 0,1X MMR. Trettio minuter efter hydrering, använd skarpa tlysrör för att dejelly äggen och placera äggen på 18 grader Celsius för mikroinjektion inom sju timmar. För att generera en haploid-diploid chimär, placera en hälsosam haploid givare med en eller två steg matchade GFP positiva diploida värd embryon inuti tråg av en pre-kyld driftsskålen som innehåller kirurgiska medium på en 10 grader Celsius eller lägre kylning skede.Använd två ultrafina autoklaverade rak spetstångstånger för att ta bort hela lemknoppen och de omgivande ektoderm- och mesodermvävnadslagren och ställ undan värdvävnaden. Avlägsna en likvärdigt storlek vävnadsslät från haploidgivaren och placera den haploida donatorvävnadssläten på motsvarande region i värdembryot. Säkra vävnaden med en autoklaverad rektangulär glasskärva från ett krossat mikroskop-coverglass och tryck försiktigt in vävnaden i värdembryonskroppen.Låt ankaret vara på plats i 60 till 75 minuter och kontrollera var 20:e minut för att bekräfta att glaset inte har halkat innan du använder tärnorna för att skala av täckglasfragmentet. Överför de engrafted embryona in i nytt kirurgiskt medel som låter dem läka på åtta till 12 grader Celsius över natten, innan inhysa de engrafted embryona individuellt i 12 eller 24-brunn pläterar. 38,7%av äggceller utvecklats till normalt utvecklade haploid embryon.På ympkvisten skede, haploid embryon uppvisar en minskad krökning längs den främre-bakre axeln och en ofullständig kapsling av äggula plugg. Dessutom kan ett fluorescerande mikroskop användas för att bekräfta haploid embryon är fria från paternally-härledda GFP uttryck. Misslyckades och orena ympkvistar producerar en mängd olika fenotyper.När ympkvistarna är rena och normalt utvecklas, bör GFP uttryck begränsas främst till brachialis plexus, det neurala nätverket som härrör från värd ryggmärgen. Punktat GFP uttryck är också närvarande i enstaka celler som verkar vara sensoriska nervceller i blod-derived värdceller som migrerar in i den växande delen. När RFP positiva givare används, haploid graft lemmar uppvisar ett universellt uttryck för RFP.Under hela utvecklingen, icke-mutagenized haploid lemmar är betydligt kortare än de motsatta diploida framben i chimeric djur. Icke-mutagenized haploid lemmar regenerera helt, även om de visar en liten fördröjning i att nå den digitala utväxten skede jämfört med diploider. Kom ihåg att använda steril teknik och helt ta bort och ersätta hela mesoderm och ektoderm vävnadsskikt från den embryonala värden för att producera en rent ympade lem.Mutant lemmar kan amputeras och poäng för regenerering fenotyper. Mutant alleler kan kvantifieras med nästa generations sekvensering. I kombination med CRISPR-Cas9 mutagenesis har vår ympningsteknik gjort det möjligt för oss att genomföra en negativ urvalsskärm av riktade gener i regenererande haploida lemmar.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Tolkad genom Grape Berry Metabolomics och transkriptomik

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av fluorescerande protein Fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar jonkanalen uttryck genom inducerbara Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumör Organoider från genetiskt modifierade musmodeller av prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Använda nästa generations sekvensering för att identifiera mutationer associerade med reparation av ett CAS9-inducerat dubbelsträngsbrott nära CD4-promotorn

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...