Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Katherine Roberts'a axolotl kolonisine baktığı için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışmanın finansmanı Connecticut Innovations Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu (15RMA-YALE-09 ve 15-RMB-YALE-01) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (Bireysel Doktora Sonrası Burs F32HD086942).

Bu protokolde kullanılan deneysel prosedürler Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC, 2017-10557) tarafından onaylanmış ve omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin tüm federal politika ve yönergelere uygun olarak uygulanmaktadır. Tüm hayvan deneyleri Ambystoma mexicanum (aksiyotl) üzerinde Yale Üniversitesi'ndeki tesislerde yapılmıştır.
1. Diploid Embriyo Üretimi
<ol><li>Bir veya iki gfp ebeveyn24k...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Haploid-diploid kimeralar üretmek için protokolümüzde, işletme teknisyeninin tutarlı aşılama sonuçları için göz önünde bulundurması gereken birkaç kritik adım vardır.
Haploid neslin başarısız olmasının en olası nedeni in vitro aktivasyon koşullarının zayıf olmasıdır. Hareketli sperm uygun miktarlarda yumurta etkinleştirmek için kullanılmalıdır. Hareketliliği uzatmak için sperm örnekleri her zaman 4 °C'de muhafaza edilmelidir. Yumurtalara herhangi bir sper...

Tarihsel olarak, amfibiler embriyonik doku greftleme gelişim biyolojisi ve rejenerasyon temel mekanizmaları keşfetmek için önemli bir teknik olmuştur. Semender bir tür olan aksolotl, yaralanma veya ampütasyon dan sonra dokuları ve uzuvlar ve organlar gibi karmaşık yapıları yenilemek için etkileyici bir yeteneğe sahiptir. Benzer şekilde etkileyici, onlar alabilirsiniz, reddi olmadan, embriyonik diğer bireylerden doku greftleri, juvenil, ve yetişkin aşamaları1,2,3. Uzuvlar, kuyruklar, gözler ve kafalar gibi bütün yapıları üreten embriyo bölgeleri ve nöroektoderm ve somitler gibi daha spesifik dokular, şeymerik hayvanlar üretmek için embriyolar arasında aşılanabilir1,2,4,5,6. Yaklaşık bir yüzyıl boyunca, bu tür şemerik hayvanların çalışmaları rejenerasyon içine önemli anlayışlar sağlamıştır, doku farklılaşması, boyut kontrolü, ve desenleme1,7,8.
Son on yılda, dokuların çok sayıda transkripsiyonel çalışmalar salamander rejenerasyon9,10,11,12,13altında yatan genetik programlar içine anlayışlar üretti . Bu çalışmalar, bugüne kadar, büyük ölçüde rejenerasyon bağlamında karakterize edilmeyen aday genlerin genişleyen bir listeye ekledik. CRISPR / Cas gibi Hedefmutage teknikleri, şimdi bu tür genlerin araştırılmasına izin, ve bu tür genetik yaklaşımlar büyük ölçüde son sıralama ve büyük axolotl genom14,15,16montaj tarafından kolaylaştırılır .
Klasik gelişim biyolojisini yeni genetik teknolojiyle birleştirerek yenilenme mekanizmalarını incelemek amacıyla teknikler geliştirmeye çalıştık. Axolotls ve diğer semenderler haploid embriyolar oluşturmak için yöntemler on yıllardır kurulmuştur17. Bu teknikler uzun genetik model organizmalar olarak semenderlerin avantajları olduğu belirtilmiştiriken 18, birkaç sonraki genetik çalışmalar haploid hayvanlar dahil var. Biz19aşılama için doku donör olarak hizmet haploid embriyolar üretmek için axolotl in vitro aktivasyon kullanın. Floresan genetik belirteçler taşıyan embriyolar kullanarak, neredeyse tamamen donör dokulardan elde edilen uzuvlar üretmek için güvenilir yöntemler tasarladık(Şekil 1A). Bu iki tekniği birleştirerek, haploidile ilişkili geç embriyonik öldürücülüğü atladık, tam gelişmiş, aşılı haploid ekstremitelerin üretimine izin verdik (Şekil 1B, Şekil 1B've Şekil 2).
Mutant haploid ekstremiteler ile şimerik aksokolotls oluşturmak için aşılama dan önce haploid embriyolarda CRISPR/Cas aracılı mutagenez yaparak, özellikle ekstremite gelişimi ve rejenerasyonu bağlamında gen fonksiyonlarını inceleyebiliriz. Bu potansiyel embriyonik öldürücü mutant fenotiplerden uzuvların kurtarılmasını sağlar. CRISPR / Cas mikroenjeksiyon son derece mutant hayvanlar üretebilir iken, bu tür hayvanlar genellikle son derece mozaik, yabani tür alel tutma bir dereceye kadar ve hedeflenen sitelerde farklı mutasyonlar çeşitli14,20. Haploid hücrelerde CRISPR tabanlı mutagenez, tutulan yabani tip aleller tarafından maskelenemedikleri için tek alel kaybı-fonksiyon mutasyonlarının penetrasyonunu artırır. Bu nedenle, haploid hücre hatlarında CRISPR tabanlı tarama giderek birçok hücresel süreçlerin genetik temelini araştırmak için kullanılır21,22,23. Bizim haploid ekstremite tomurcuk aşılama protokolleri ile CRISPR tabanlı soy izleme birleştirerek, burada açıklanan yaklaşım canlı hayvanlarda haploid genetik ekranlar için bir platform olarak hizmet verebilir20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Genetik teknikler ve kaynaklar büyüyen bir dizi araştırmacılar semender bazı türlerin moleküler kökenleri araştırmak için izin, aksitolar gibi, yetişkin olarak tüm uzuvları yeniden. Burada, gen fonksiyonunu ve ekstremite rejenerasyonunun sadakatini keşfetmek için kullanılabilecek Cas9-mutajenizeize haploid forelimbs ile şimerik axolotls oluşturmak için kullanılan teknikleri anahat. İn vitro aktivasyon yoluyla haploid üretimi, CRISPR/Cas9 mutagenezi ve doku greftleme gibi çeşitli embriyolojik ve genetik teknikleri birleştirerek yenilenmenin model organizmasında haploid genetik tarama için benzersiz bir sistem üretiyoruz. Bu strateji, ekstremite rejenerasyonundaki genlerin fonksiyonel analizi için gerekli olan hayvan, alan ve zaman sayısını azaltır. Bu aynı zamanda organogenez, doku morfogenezi ve diğer temel embriyonik süreçler gibi diğer temel süreçler için gerekli olabilecek genlerin rejenerasyona özgü fonksiyonlarının araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan yöntem bir omurgalı model sisteminde haploid genetik tarama yapmak için benzersiz bir platformdur.

Gelişmekte olan haploid embriyolar diploid embriyolardan 'haploid sendrom' fenotip29ile ayırt edilebilir. Greft aşamasında, haploid embriyolar anterior-posterior ekseni boyunca azaltılmış eğrilik ve sarısı fişinin eksik muhafazası sergilerler(Şekil 3A). Bir floresan mikroskop haploid embriyolar baba kaynaklı GFP ekspresyonu ücretsiz olduğundan emin olmak için kullanılabilir (Şeki...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Bu protokol axolotl genetik tarama için kullanılabilecek mutajenize haploid ekstremite üretimine izin verir. Haploidlerde, düşük seviyeli mutagenez bile hücrelerde fonksiyon fenotiplerinin kaybına neden olabilir. Bu aşılama tekniği de embriyonik ölümcül fenotipleri kurtarmak için kullanılabilir.Bu yöntem in vitro fertilizasyon ve greftleme için uygun olan herhangi bir amfibi türünde rejenerasyon çalışması için kullanılabilir. Donör olarak haploid embriyoları kullanmadan önce, GFP pozitif ve negatif diploid embriyolar arasındaki greftlerin başarısını uygulamanızı ve onaylamanızı öneririz. Kadın gamet donör hazırlık için, gamet donör olarak hizmet etmek için bir cinsel olgun beyaz veya beyaz RFP kadın aksitotik.Ağrı simülasyonuna yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, arka ekstremite kas dorsal içine 0.15 mililitre insan koryonik gonadotropin enjekte etmek için 30 gauge insülin şırınga kullanın. Omurilikle temas tan kaçınmak için şırıngayı orta hatta 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Enjekte edilen hayvanı taze %40 Holtfreter çözeltisine yerleştirin ve axolotl'ı 48 saat boyunca 8 ila 12 derece lik bir buzdolabına aktarın.Sonra oda sıcaklığına kadın geri dönün. Dişi yumurtlarken, diseksiyon mikroskobu altında nemli kağıt havlular üzerinde supine pozisyonda tamamen anestezili bir erkek yerleştirin ve baskın el ile cloaca tabanında bir P1000 pipet ucu konum. Diğer işaret parmağı ve başparmak iki ila üç santimetre leğen kemiğine rostral yerleştirin ve yavaşça yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine her örnek toplama spermik idrar örnekleri dışarı floş için arka bacaklara doğru parmakları hareket ederken hayvan sıkmak.Daha sonra her örnekten beş mikrolitreyi bir Petri kabına aktarın ve ters bir mikroskop kullanarak spermin kalitesini kontrol edin. Saydıktan sonra, 0.1X steril MMR mililitre başına dördüncü hücrelere sekiz kez 10 konsantrasyonsperm seyreltmek ve yeni bir Petri kabına yumurta başına sperm hücrelerinin 0.5 mikrolitre transfer. Daha sonra süspansiyonu bir milimetre kalınlığında bir katmana yaymak için pipet ucunu kullanın ve numuneyi 254 nanometrelik bir crosslinker'ın ampullerinden miliradyasyon için dört santimetre lik bir alana yerleştirmek için plastik bir asansör kullanın.Sağlıklı bir sperm örneği topladıktan sonra, nemli kağıt havlu bir yığın üzerinde supine pozisyonda kadın yerleştirin ve dişi axolotl döllenmemiş yumurta ayıklamak için benzer bir yıkama hareketi kullanın. Sonra 10 santimetre Petri çanak içine yumurta aktarmak için ıslak forceps kullanın. Toplama dan 15 dakika içinde, 0,25 ila 0,5 mikrolitre inaktive sperm ile her yumurta kaplama döllenmemiş yumurta üzerine ışınlanmış sperm dağıtmak için bir P10 pipet kullanın.Yumurtaların oda sıcaklığında 30 dakika oturmasına izin vererek, yumurtaları 0,1 X MMR ile doldurun. Hidrasyondan 30 dakika sonra, yumurtaları jölelemek için keskin forsepsler kullanın ve yumurtaları 7 saat içinde mikroenjeksiyon için 18 derecede yerleştirin. Bir haploid-diploid kimera oluşturmak için, bir veya iki aşamalı gfp pozitif diploid konak embriyolar ile sağlıklı bir haploid donör yerleştirin önceden soğutulmuş bir işletim çanak yalak içinde 10 derece santigrat veya daha düşük soğutma aşamasında cerrahi ortam içeren.Tüm ekstremite tomurcuk ve çevreleyen ektoderm ve mezoderm doku katmanları kaldırmak ve konak doku kenara koymak için iki ultra ince otoklavlı düz uç forceps kullanın. Haploid donörden eşit büyüklüktebir doku kılıfı çıkarın ve haploid donör doku kılıfını konak embriyonun ilgili bölgesine yerleştirin. Ezilmiş bir mikroskop coverglass bir otoklavlı dikdörtgen cam kırık ile doku güvenli ve yavaşça konak embriyo vücuduna doku basın.Camın kapak camı parçasını soymak için forseps kullanmadan önce kaymadığını doğrulamak için her 20 dakikada bir 60-75 dakika boyunca çapayı yerinde bırakın. Engrafted embriyolar taze cerrahi ortama transfer onları 12 veya 24-well plakaları tek tek engrafted embriyolar konut önce bir gecede sekiz ila 12 santigrat derece iyileşmek için izin. Yumurtaların %38.7'si normal olarak gelişmiş haploid embriyolara dönüşmemiştir.Greft aşamasında, haploid embriyolar anterior-posterior ekseni boyunca azaltılmış eğrilik ve sarısı fişi eksik bir muhafaza sergilerler. Buna ek olarak, bir floresan mikroskop haploid embriyolar baba kaynaklı GFP ifade ücretsiz olduğunu doğrulamak için kullanılabilir. Başarısız ve saf olmayan greftler çeşitli fenotipler üretir.Greftler temiz ve normal olarak geliştirildiğinde, GFP ekspresyonu öncelikle brakiyal pleksus ile sınırlandırılmalıdır, konak omurilikten elde edilen sinir ağı. Punctate GFP ekspresyonu, gelişmekte olan ekstremiteiçine göç eden kan kaynaklı konak hücrelerde duyusal nöronlar gibi görünen tek hücrelerde de mevcuttur. RFP pozitif donörler kullanıldığında, haploid greft uzuvları RFP evrensel bir ifade sergiler.Gelişim boyunca, non-mutajenize olmayan haploid ekstremiteler şimerik hayvanlarda karşıt diploid forelimbs önemli ölçüde daha kısadır. Non-mutajenize haploid uzuvlar tamamen yenilenir, onlar diploidler ile karşılaştırıldığında dijital büyüme aşamasına ulaşmada hafif bir gecikme göstermek rağmen. Steril tekniği kullanmayı unutmayın ve tamamen kaldırmak ve temiz aşılanmış ekstremite üretmek için embriyonik konak tam mezoderm ve ektoderm doku katmanları değiştirin.Mutant ekstremiteler kesilebilir ve rejenerasyon fenotipleri için puanlandı. Mutant aleller yeni nesil sıralama ile ölçülebilir. CRISPR-Cas9 mutagenezi ile birlikte aşılama tekniğimiz haploid ekstremitelerin yenilenmesinde hedeflenen genlerin negatif seçim taramasını yapmamızı sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Genetik

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Floresan protein füzyonları üretilmesi<em&gt; Candida</em&gt; Türler

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...