Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Dessa studier stöddes av bidrag från naturvetenskap och teknik forskningrådet (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), och Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), och ALS Canada-hjärna Kanada Arthur J. Hudson Translational team Grant (JK, HM).

Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella föreskrifter och handledning för vård och användning av försöksdjur från det kanadensiska rådet för djuromsorg och har godkänts av lokala myndigheter ("den Bannatyne Campus djuromsorg Kommittén "). Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som använts och deras lidande. Tillräckligt djup av anestesi bekräftades genom att Observera att det inte fanns någon förändring i andningsfrekvens i samband med manipulation och tå nypa elle...

<ol>
	<li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).</li><li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines.">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).</li><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Check+your+cultures!+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines.">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+cycle:+the+neuron+itself+and+its+circumstances.">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+a+breakthrough+in+vivo.">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).</li><li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly.">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li><li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice.">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li><li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Migration+During+Development+of+the+Cerebellum.">Neuronal Migration During Development of the Cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).</li><li>Buffo, A., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+lineage+and+function+of+cerebellar+glia.">Origin, lineage and function of cerebellar glia.</a> Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Precursor+Cells+from+the+Rhombic+Lip+Are+Specified+to+a+Cerebellar+Granule+Neuron+Identity.">Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indispensable+Roles+of+Microglia+and+Astrocytes+during+Brain+Development.">The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).</li><li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research.">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li><li>Tabata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+for+culture+of+dissociated+mouse+cerebellar+cells+enriched+for+Purkinje+neurons.">A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li><li>Schaller, K. L., Caldwell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+sodium+channels+in+the+cerebellum.">Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum.</a> Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity.">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>van der Valk, J., Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS)+-+A+pain+in+the+dish.">Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).</li><li>Froud, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+benefits+and+disadvantages+of+serum-free+media.">The development, benefits and disadvantages of serum-free media.</a> Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).</li><li>Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+passage+number+on+osteogenic+and+adipogenic+characteristics+of+D1+cells.">The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).</li><li>Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+culture:+the+base+of+biotechnology.">Cell and tissue culture: the base of biotechnology.</a> Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).</li><li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thimerosal+and+autism.">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li></ol>

Användningen av primär kulturer är en välkänd metod som gäller för alla typer av nervceller17,18,19. I det presenterade protokollet, förklarar vi hur man isolerar cerebellär neuroner och bibehålla sin livskraft med optimal överlevnad in vitro i högst 3 veckor. Primärkulturen i cerebellär celler, som isolerades på E15 − E18, bekräftar insamlingen av tre klasser av stora nervceller: PCs, Golgi celler, och CNs. Ce...

I flera decennier har cellinjer använts flitigt som ett högt genomflöde verktyg i prekliniska studier och biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, snabb tillväxt och minskad användning av levande djur är några fördelar med att använda dessa celler. Emellertid, genetiska förändringar och fenotypiska förändringar ackumuleras efter flera passager in vitro-1. Felidentifiering av cellinjer och genetisk dissimilaritet från primära celler kan leda till irreproducerbara experiment och falska slutsatser2,3,4,5. Därför, trots vissa likheter med differentierade celler såsom nervceller (t. ex., signalsubstanser, jonkanaler, receptorer, och andra neuron-specifika proteiner), neuronala cellinjer kan inte replikera hela fenotyp av nervceller. Använda mogna nervceller är ett annat alternativ; dessa celler är dock icke-skiljande postmitotiska celler som är svåra att sprida i kulturen. Dessutom kan återinträde i cellcykeln utlösa apoptos6.
Tredimensionell (3D) cellkultur, organotypic slice kulturer, och Organoid kulturer har utvecklats för att ge en miljö där celler kan ordna i en 3D-form som härmar in vivo inställning. Således, cell-till-cellkommunikation, migration, invasion av tumörceller i omgivande vävnader, och angiogenes kan studeras7. Men ytterligare kostnader för att använda extra cellulära Matrix (ECM) proteiner eller syntetiska hydrogeler som ett strö, svårigheter att avbilda, och kompatibilitet med hög kapacitet screening instrument är betydande nackdelar med 3D-cellodling. En stor nackdel med organotypic vävnad slice kultur är användningen av ett stort antal djur och de negativa effekterna av axotomi, vilket leder till otillgänglighet av mål och tillväxtfaktorer för axoner, och därmed neuronala död8.
Därför är en alternativ metod, som undviker problem med cellinjer, svårigheten att växa mogna celler, och komplexiteten i vävnader, in vitro-mognad av omogna primära celler. Primär cellerna härstammar direkt från vävnad från människa eller djur och separeras med hjälp av enzymatiska och/eller mekaniska metoder9. De viktigaste principerna för isolering, sådd och underhåll i odlingssubstrat är likartade oavsett vävnads källa. Emellertid, de trofiska faktorer som krävs för att främja spridning och mognad är mycket cellspecifika6.
Att känna till "födelsedatum" för varje cerebellär celltyp är en förutsättning för att utforma en primär kultur experiment. I allmänhet, Purkinje celler (PCs) och nervceller i lillhjärnan kärnor (CN), är födda före de mindre cellerna, inklusive interneuroner (t. ex., korg, stellate celler) och granule celler. Hos möss uppstår datorer mellan embryonala dagen (E) 10 – E13, medan KN-neuroner vid cirka E9 – E1210.
Andra cerebellär nervceller föds mycket senare. Till exempel, hos möss, den Golgi subpopulation av interneuroner genereras från VZ på (~ E14 − E18) och de återstående interneuroner (korg cell och stellate celler) som ligger i det molekylära skiktet dyka upp från att dividera stamceller i den vita substansen mellan tidig postnatal (P) 0 – P711. Granule celler genereras från den yttre avelsmaterial Zone (egz), en sekundär avelsmaterial zon som härrör från rostralt rhombic läpp och går igenom terminalen Division efter födseln. Men innan deras prekursorer uppstår från rhombic läpp från E13-E16, cellerna har redan migrerat rostrally längs Pia ytan för att göra ett tunt lager av celler på rygg ytan av lillhjärnan Anlage. Nonneuronala makrogliala celler som astrocyter och oligodendrocyter, som härstammar från det ventrikulära neuroepitelet, är födda vid e 13,5 − P0 och P0 − P7 respektive11,12,13,14 ,15. Microglia härstammar från gula-SAC primitiva myeloida stamceller mellan E8-E10 och efter invasionen i centralanervsystemet kan upptäckas i mushjärna av E916.
Den metod som presenteras i denna artikel är baserad på den som ursprungligen utvecklades av Furuya et al. och Tabata et al.17,18, som var optimerad för primär odling av Purkinje celler som härrör från Wistar råtta cerebella. Vi har nu anpassat denna metod och noggrant modifierade den för att studera tillväxten av mus cerebellär neuroner19. Till skillnad från i vårt nya protokoll, är kallt dissektion medium den huvudsakliga tvättbuffert som används under dissektion och dissociation steg innan du lägger sådd medium i Furuya protokoll17. Denna buffert saknar näring, tillväxtfaktorer, och hormoner (alla i Dulbecco modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F-12 [DMEM/F12]) som är nödvändiga för att stödja celltillväxt och överlevnad under de ovan nämnda stegen. Dessutom, baserat på vår långa erfarenhet med murina primära cerebellär kulturer, vi har använt 500 μl av odlingssubstrat i varje brunn (i stället för 1 ml) och ökade tri-iodothyronine koncentrationen till 0,5 ng/ml, vilket förbättrar tillväxten av neuronala celler, i särskilt de med en Purkinje cell fenotyp, och främjar utväxt av dendritiska grenar i kulturen. Den huvudsakliga metoden i denna artikel kan i stor utsträckning tillämpas på andra små gnagare (t. ex. ekorrar och hamstrar) under embryonal utveckling och kan användas för att studera cerebellär neurogenes och differentiering i de olika embryonala stadierna, som olika arter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

Användningen av primära cellkulturer har blivit ett av de viktigaste verktygen för att studera nervsystemet in vitro. Det slutgiltiga målet med att använda detta förenklade modellsystem är att ge en kontrollerad mikromiljö och bibehålla den höga överlevnaden och de naturliga dragen hos dissocierade neuronala och nonneuronala celler så mycket som möjligt under in vitro-betingelser. I denna artikel, vi visar en metod för att isolera primära nervceller från att utveckla mus cerebellum, placera dem i en in vitro-miljö, etablera sin tillväxt, och övervaka deras lönsamhet och differentiering i flera veckor. Denna metod är tillämplig på embryonala neuroner separerade från lillhjärnan mellan embryonala dagar 12 – 18.

Baserat på de olika födelsedatum för neuronala subtyper i lillhjärnan, kulturer från E12 − E18 mus embryon gav olika celltyper. Stora projektion nervceller, såsom CN neuroner (E9 − E12) och PCs (E10 − E13), dök upp tidigt under cerebellär utveckling. Hos möss uppstod granule-och Golgiceller mellan ~ E13 – E18 och genomgick terminala divisioner upp till postnatal vecka 4.
Byta gamla medium i med färsk kultur medium II på dagar in vitro (DIV) 7 kommer så småningom att förhi...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Att utföra in vitro-experiment för att återspegla in vivo-förhållanden så väl som möjligt är inte en lätt uppgift. Användningen av primära cellkulturer är ett viktigt steg mot att förstå cellbiologi i en hel organism. Den medföljande protokollet beskriver hur man framgångsrikt växa och kultur embryonala mus cerebellär nervceller.

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Primär neuronal cell kultur är en idealisk modell system för att studera dissociated nervceller in vitro-kultur. Fördelen med att använda denna metod är att kunna upprätthålla de cellulära funktionerna hos dissocierade celler, såsom mekanismer, funktioner och morfologi in vitro-villkor för ett par veckor så nära som möjligt till in vivo villkor. Sätt den runda luckan glider i en 24-brunnsplatta under biosäkerhetsskåpet.Lägg till 90 mikroliter av poly-L-ornitin på varje täcksli. Stäng locket och placera försiktigt plattan i 37 graders inkubator i två dagar. Förbered odlingsmediet och såddmediet och håll dem vid fyra grader Celsius.Förbered arbets trypsinlösningen i DMEM/F12 och håll den på fyra grader. Placera odlingsmediet och såddmediet i inkubatorn på 37 grader. Ta ut 24-brunnsplattan ur inkubatorn.Tvätta överdraget glider tre gånger med dubbelt destillerat vatten. Låt täcklocket halkigt i minst två timmar för att torka helt. Förbered tre Petri rätter fyllda med kall PBS, tre Petri rätter fyllda med kalla HBSS, och fem Petri rätter fyllda med kall dissektion medium på is.Punktskatt livmoderhornen och tvätta dem i kallt PBS tre gånger på is. Härifrån bör alla steg utföras på is för att minimera vävnadsskador. Efter det sista tvättsteget, separera ungarna från livmodern i HBSS och överför dem till det kalla dissektionsmediet.I dissektionsmedium halshugger du ungarna med sax. Öppna calvarium från foramen magnum till sämre gränsen av omloppsbanor hålighet. Med hjälp av ett par fina trökårer, ta bort skallbasen och skala skallen bort från hjärnan.Avlägsna noggrant hjärnhinnan i lillhjärnan med början från den laterala ytan av den mellersta cerebellarpedunkel och pons. Skär både cerebellar pedunlers och separera lillhjärnan från resten av hjärnan. Placera omedelbart den uppsamlade cerebellen i ett sterilt 15-mL koniskt rör fyllt med DMEM/F12 på is.Centrifugera röret vid 1, 000 g vid fyra grader under en minut i DMEM/F12. Upprepa detta tre gånger, varje gång försiktigt ta bort supernatanten med en pipett och åter uppskjuta pelleten i färsk DMEM/F12. Tillsätt två milliliter för varm trypsin och försiktigt pipettera för att blanda ihop dem.Placera röret i en 37 graders vattenbad i 12 minuter. Efter inkubationen, föra röret till säkerhetsskåpet och tillsätt 10 mLs DMEM/F12 för att inaktivera trypsin. Centrifugera blandningen vid 1, 200 g's i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend i färskt medium följt av centrifugeringen tre gånger. Förväp en steril plastpipett med DMEM/F2. Tillsätt 3,5 milliliter DNAse arbetslösning till samma rör.Triturate vävnaden med en pipett flera gånger tills vätskan når fram till en homogen mjölkaktig färg. Tillsätt 10 mL kall DMEM/F12 till blandningen och fortsätt till centrifugen. Centrifugera provet vid 1, 200 g vid fyra grader i fem minuter.Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Ta bort såddmediet från inkubatorn. Tillsätt 500 mikroliter av förvärmda sådd medium och blanda det väl med hjälp av pipetten.Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Späd cellupphängningen med såddmedium till en densitet på 500, 000 celler per milliliter. Tillsätt 90 mikroliter av blandningen till varje brunn i mitten av täcket.Placera plattan i inkubatorn på 37 grader i tre till fyra timmar. Efter inkubation, tillsätt 500 mikroliter av förvärmda odlingsmedium i varje brunn. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn vid 37 grader.Efter sju dagar, ersätta det gamla mediet med färskt odlingsmedium II.Förbered en separat 24-brunnsplatta med motsvarande numerisk organisation och tillsätt 100 mikroliter pfa 4%till varje brunn. Efter de önskade dagarna i kulturen, försiktigt bort locket glider från brunnarna i den ursprungliga odlingsplattan och placera dem i motsvarande brunnar av PFA plattan beskrivs i föregående steg. Lägg PFA till brunnarna för att helt sänka ner täcksliorna.Håll PFA-plattan på fyra grader i 30 till 120 minuter. Efter inkubationen återställer du plattan till rumstemperatur. Tvätta locket glider försiktigt med PBS i fem minuter tre gånger.Figur två i texten visar cerebellar cellkulturen börjar vid E18. Immunofluorescens för calbindin visar Purkinje nervceller med axonal förlängningar med tre dagar in vitro. Med sju till 10 dagar in vitro är dendritiska processer uppenbara.Vid 21 dagar är komplexa dendritiska grenar närvarande. Figur tre i texten visar cerebellar cellkulturer som börjar vid olika embryonala dagar. immunofluorescens påvisande av calbindin visar Purkinje nervceller med tidiga axons först efter 18 dagar in vitro.Purkinje neuron kulturer startade vid E14 och E15 kommer att utveckla dendrites, men aldrig så komplexa som de som utvecklas när E18 är utgångspunkten. Bild fyra i texten visar att olika celltyper utvecklas från E18-kulturer efter 21 dagar in vitro. Calbindin grön immunofluorescens visar Purkinje nervceller.Röd immunofluorescens för parvalbumin i B och C visar hämmande interneurons. Röd immunofluorescens för natriumspänning-gated kanal i E och F visar granulat nervceller. Det föreliggande protokollet är kostnadseffektivt och lätt att föra.I slutet av denna video, kommer du att kunna samla in och kultur cerebellar nervceller och fixa dem vid önskad DIVs.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lektin-baserade isolering och odling av mus Embryonala Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ett<em&gt; In-vitro</em&gt; Beredning av isolerade Enteriska neuroner och glia från plexus myentericus av vuxen mus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generering av Neurosfärer från blandade primära hippocampal och kortikala neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...