Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

ويقر المؤلفون بتمويل البحوث التي ترعاها شركه CoA Therapeutics, Inc. ، وهي شركه تابعه لبريدجبيو LLC ، والمعاهد الوطنية للمنح الصحية GM34496 ، والجمعيات الخيرية السورية اللبنانية المرتبطة.

أجريت الإجراءات الحيوانية المشار اليها في هذا البروتوكول وفقا للبروتوكولات 323 و 556 والتي وافقت علي وجه التحديد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانية واستخدامها في مستشفي سانت جود للأطفال.
1-اعداد الحلول
ملاحظه: استخدام المياه نقاء لجميع الحلول وعندما ذكر في...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

هنا نظهر اجراء موثوق به ، خطوه بخطوه لقياس إجمالي CoA في الخلايا والانسجه الحيوانية مع مجموعه واسعه من الكشف الخطي التي يمكن الوصول اليها في العديد من المختبرات التي لديها HPLC مع اما الامتصاص أو فلوري كاشف الإنتاج. وبدلا من ذلك ، فان قياس الطيف الكتلي هو أسلوب شائع لتقييم شهادة الاصاله والتو?...

انزيم A (CoA) هو عامل مساعد أساسي في جميع الكائنات الحية ويتم توليفها من حمض الثنائية ، وتسمي أيضا بانتوثينات (الملح من حمض الثنائي) أو فيتامين B5. CoA هو الناقل الرئيسي داخل الخلايا من الأحماض العضوية ، بما في ذلك الأحماض القصيرة السلسلة مثل خلات والسكينات ، فرع سلسله الأحماض مثل بروبيونات وميثيل مالوناتي ، الأحماض الدهنية طويلة السلسلة مثل بالميتات والأوليات ، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة جدا مثل الأحماض الدهنية غير المشبعة ، و xenobiotics مثل حمض فالبرويك. يشكل الحامض عضويه [ثيوستر] ربط انزيمي مع [CoA] ان يمكن استعماله كركيزة في علي 100 رد فعل في وسيطه أيض1. هي أيضا المنظمين تفارغي والمنشطات الناقلة. هو الآن يقدر2 ان الخلوية إجماليه [CoA] نظمت إمداد تموين3,4; التالي ، يمكن ان يكون الحد من توافر CoA ، وان نقص CoA يمكن ان تكون كارثية ، كما يتمثل في الاضطرابات الوراثية الموروثة التي تؤثر علي التخليق الحيوي CoA5. بانتوثينات كيناز يحفز الخطوة الاولي في التخليق الحيوي CoA (الشكل 1) و بانتوثينات العصبية المرتبطة المقترنة ، ودعا pkan ، هو سبب الطفرات في الجينات PANK2 6. CoA synthase ، المشفرة من قبل جين Coasyn ، يحفز الخطوتين الأخيرتين في التخليق الحيوي coa (الشكل 1) و Coasy البروتين المرتبطة نيوروتنكس ، ودعا copan ، هو سبب طفرة في الجينات coasyn 7. كل من PKAN و CoPAN موروثه الامراض العصبية المرتبطة بتراكم الحديد في الدماغ ونقص CoA بشكل سلبي امراض المرض.
المستويات الخلوية من مجموع CoA تختلف بين الانسجه8 ومجموع coa يمكن زيادة أو نقصان تحت مجموعه متنوعة من الولايات الفسيولوجية والمرضية والدوائية. الكبد الزيادات coa اثناء التبديل الوقود من بنك الاحتياطي الفيدرالي إلى الدولة صام9، ومستويات coa الكبد هي عاليه بشكل غير طبيعي في الفئران البدناء ناقص ليبتين ،10. انخفاض CoA الكبد استجابه لابتلاع الايثانول المزمن11. مستويات CoA الدماغ في نموذج الماوس Pank2 الضربة القاضية هي الاكتئاب خلال فتره ما قبل الولادة ، ولكن في وقت لاحق في الدماغ مرحله الكبار coa المحتوي يعادل مستويات البرية ، مما يدل علي استجابه CoA التكيف اثناء التطوير12. التلاعب في محتوي CoA الانسجه عن طريق التكوين أو الجينات طرق التسليم تؤثر علي وظائف الأيض والعصبية13،14،15. التطوير الإكلينيكي للعلاجات المحتملة لل pkan أو كوبان يتضمن قياسات الخلايا أو الانسجه CoA كمؤشرات للفعالية16،17،18،19،20 . يتطلب تقييم كل هذه الشروط ونتائجها الايضيه أو الوظيفية طريقه كميه لقياس مجموع CoA.
ويعد الفحص الدقيق والموثوق لقياس CoA في العينات البيولوجية تحديا تقنيا في العديد من المختبرات. لسوء الحظ ، لا توجد تحقيقات متاحه لتقييم أو قياس CoA أو CoA ثيوترات في الخلايا السليمة ، علي الرغم من ان النظير من الطبيعية CoA thioesters وقد استخدمت علي نطاق واسع كتحقيقات ميكانيكيه في دراسات CoA استر استخدام الانزيمات21. التحويل من CoA, مع [سلفهيدراريل] حره (-[ش]) [موليتي], إلى [CoA] [ثيوستر] (أو العكس) سريعة في خلايا أو نسيج حيوانيه اثناء انتقال إلى بيئة مختلفه واثناء خليه تحلل. العديد من acyl-CoA synthetases و acyl-CoA thioesterases في الخلايا توسط التحويلات داخل تجمع CoA ، والانزيمات الاضافيه التي تستخدم CoA ثيوترات كما ركائز تبقي نشطه في عينات بيولوجية حتى مروي من قبل الكيميائية أو الفيزيائية يعني. التحميل من acyl-المجموعات من CoA إلى كارنيتين بواسطة المحولات acyl هو مثال واحد داخل شبكه من ردود الفعل التي يمكن ان تغير من CoA/CoA التوزيع thioester. يمكن استخدام المتعقبات المشعة لقياس معدلات توليف CoA في الخلايا. وقد تم استعراض الأساليب الحالية لقياس مشتقات CoA و CoA في العينات البيولوجية22 وتشمل المقايسات الطيفية الانزيميه المقترنة ، والفصل اللوني السائل عالي الضغط والإجراءات القائمة علي الطيف الكتلي. ومع ذلك ، غالبا ما تتركز هذه الأساليب علي الأنواع الجزيئية الخاصة CoA وهي عمياء إلى الاختلاف من تجمع CoA الكلي. الاختبارات الانزيميه المقترنة تتطلب عموما كميات أكبر من مواد الإدخال بسبب الحساسيات الكشف المنخفضة ولها مجموعه محدوده من الخطي.
وقد وضعت لدينا مختبر اجراء موثوق بها للقياس الكمي لمجموع CoA في الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية. وتشمل الاستراتيجية التحلل المائي لجميع ثيوترات CoA لإنتاج CoA الحرة فقط خلال اعداد العينة ، بدلا من بذل الجهود للحفاظ علي وتحليل الطيف بأكمله من الأنواع CoA. هذا الاجراء هو تجميع للأساليب المنشورة الفردية لاعداد العينة ، CoA اشتقاق ، تنقيه وتحديد بعد اللوني السائل عاليه الضغط (HPLC) ، والتقدير الكمي لديريفاتيزيد CoA عن طريق الامتصاص أو الكشف عن الفلورية23،24،25. وقد مكنت القرارات CoA التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الاجراء فهمنا لتنظيم CoA وتطوير نهج علاجي لعلاج نقص CoA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

وقد كشفت البحوث الناشئة ان الانزيم الخلوي A (CoA) العرض يمكن ان تصبح الحد مع تاثير ضار علي النمو, التمثيل الغذائي والبقاء علي قيد الحياة. قياس CoA الخلوية هو التحدي بسبب وفره منخفضه نسبيا والتحويل الديناميكي لل CoA الحرة إلى ثيوترات CoA التي ، بدورها ، والمشاركة في العديد من ردود الفعل الايضيه. يتم وصف الأسلوب الذي يتنقل من خلال المزالق المحتملة اثناء اعداد العينة للحصول علي فحص مع مجموعه خطيه واسعه من الكشف التي هي مناسبه للاستخدام في العديد من المختبرات الطبية الحيوية.

وقد تم تطوير طريقه سريعة وموثوق بها نسبيا للكشف عن مجموع coa في الخلايا والانسجه مثقف من قبل نظر ثيول من coa إلى وكيل الفلورسنت باستخدام mbbr ، ومن ثم تنقيه ديريفاتيزيد coa-bimane باستخدام المرحلة العكسية hplc. يتم إنشاء منحني قياسي لأول مره ، حيث يتم حقن كميات معروفه ومتزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

يصف هذا الأسلوب اعداد العينات من الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية ، واستخراج واشتقاق انزيم A في العينات ، تليها اللوني السائل عاليه الضغط لتنقيه والتقدير الكمي لانزيم ديريفاتيزيد A من قبل الامتصاص أو الكشف عن الفلورية.

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

إنزيم A، يسمى CoA لفترة قصيرة، هو عامل مساعد مهم في التمثيل الغذائي الخلوي. تكشف القياسات الكمية عن التغيرات التي تحدث مع الحالات الغذائية والهرمونية في النماذج الحيوانية. هذه الطريقة كميات كمية إجمالية من CoA الخلوية, بما في ذلك مشتقات COA و COA الحرة, في طريقة بسيطة وموثوق بها.ترتبط عدة أنواع من التنكس العصبي مع تراكم الحديد الدماغ مع الطفرات في جينات مسار COA التركيب الحيوي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام بيولوجي لأن جميع الكائنات الحية تتطلب CoA للبقاء والنمو والوظيفة. قد يعاني الباحث لأول مرة من الخطوات الأولى في إعداد العينات ، حيث من المهم الحفاظ على العينات باردة تمامًا ثم نقلها بسرعة إلى هيدروكسيد البوتاسيوم.الحد من عدد العينات في دفعة قبل نقلها إلى هيدروكسيد البوتاسيوم، وممارسة مع نقل قبل العمل مع العينات التجريبية. العديد من الباحثين لا تعرف على استخراج المرحلة الصلبة في إعداد العينات البيولوجية لتحليل البيوكيميائية في وقت لاحق. لتبدأ، احتضان الأطباق ثقافة ثلاثية في موازاة، اثنان للتحليل الكيميائي الحيوي واحد لتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة.عندما تقترب الثقافة من الكثافات غير ذات القدرة على الوفرة المتأخرة ، على سبيل المثال ، تنمو خلايا HepG2 /C3A البشرية إلى كثافة 6 إلى 8 مرات 10 إلى الخلايا الست أو خلايا HEK 293T التي نمت إلى كثافة حوالي 1.3 مرة 10 إلى سبعة لكل طبق 100 ملليمتر ، حصاد الخلايا الملتزمة في الثقافة. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الماء البارد الجليد إلى طبق الثقافة نفسه. كشط الخلايا في الماء البارد في الطبق، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب اختبار الزجاج التي تحتوي على 400 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 0.25 المولار و 1.5 ملليلتر من الماء لجلب درجة الHH فوق 12.اخلطي التعليق بقوة من خلال الارتفاع لمدة 10 ثوانٍ. ثم تغطية بإحكام مع فيلم البارافين، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون أن تهتز في حمام مائي. ثم، إضافة 160 ميكرولترات من مولر واحد Trizma-هيدروكلوريد حل و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr.مزيج من دوامة على ارتفاع لمدة 10 ثانية. وهذا يجعل درجة حُكّة الـ 8 تقريبًا لدعم رد فعل mBBr مع COA المجاني. تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام ل mBBr للرد مع ثيول من CoA.بعد ساعتين، إضافة 100 ميكرولترات من حمض الخليك، ومزيج من دوامة لمدة 10 ثانية لوقف رد الفعل. تتشكل الأمطار في الأنبوب. بعد ذلك، الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة.لإزالة حطام الخلية المترسبة، نقل وحفظ المابير في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود الاستخراج الصلبة المرحلة. قبل بدء التحليل، أضف ميليتين من هيدروكسيد البوتاسيوم بمليمتر واحد إلى أنبوب اختبار زجاجي مصمم لإدراج مسبار واختلال الأنسجة مع مُتجانس دوار. إبقاء أنبوب على الجليد حتى استخدامها.وزن قطع الأنسجة المجمدة بسرعة، وتسجيل الوزن الرطب لكل عينة. نقل الأنسجة إلى أنبوب زجاجي، وتجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية. تجنب ذوبان الأنسجة بالكامل.إضافة 500 ميكرولترات من 0.25-المولار هيدروكسيد البوتاسيوم. دوامة عالية لمدة 10 ثانية، والحفاظ على الجليد. وهذا يجلب للhH من العينة فوق 12 إلى hydrolyze الثيوقارات COA إلى العائد الإجمالي COA.تغطية أنبوب مع فيلم البارافين. إعداد الخلايا المستزرعة وإعداد الأنسجة هي الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء. من المهم إضافة هيدروكسيد البوتاسيوم العالي بسرعة لمنع تدهور COA.احتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة ساعتين في حمام مائي دون اهتزاز لدعم التحلل المائي. ثم، إضافة 150 ميكرولتردات من واحد المولر تريزما هيدروكلوريد و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr لتحقيق درجة حزو إلى حوالي ثمانية لدعم رد فعل mBBr مع COA الحرة. دوامة عالية لمدة 10 ثوان.تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام لضمان اشتقاق جميع COA مع mBBr. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولترات من حمض الخليك ، ودوة عالية لمدة 10 ثوان لوقف التفاعل. أجهزة الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة لبيدة ترسب الحطام الخلية، ونقل المابير إلى أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود استخراج المرحلة الصلبة.في درجة حرارة الغرفة، توازن كل ملليلتر واحد يمكن التخلص منه 2-2-بيريديل-الإيثيل هلام العمود مع ملليلتر واحد من عازلة غسل لضمان أن مجموعة بيريديل وظيفية هو بروتون وسوف تعمل كمبادل أنيون. ثم، ماصة العينة افرا على العمود، وجمع eluate. غسل العمود مرتين مع ملليلتر واحد من العازلة غسل ومرة واحدة مع ملليلتر واحد من الماء لإزالة أي الأنواع غير المطهرة.بعد ذلك ، في أنبوب اختبار زجاجي منفصل ، قم بغسل العمود مرتين بميليلتر واحد من عازلة elution لجمع CoA-bimane. جفف عينة CoA-bimane في الأنبوب تحت غاز النيتروجين. ختم، وتغطية تماما الأنبوب، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية.عندما تكون جاهزة لتحليل HPLC، قم بإعادة تعليق العينة في 300 ميكرولترات من الماء، واخلط بقوة من خلال الدوامة العالية لمدة 10 ثوانٍ. نقل العينة التي تم إعادة تعليقها إلى فلتر أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي بمعدل 5000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي متعجل. ثم، نقل العينة التي تمت تصفيتها إلى قارورة زجاجية مناسبة لحقن HPLC.في هذه الدراسة، يعرض ملف HPLC التمثيلي وقت الاحتفاظ بمعيار CoA-bimane على عمود HPLC C18. تم حقن كميات متزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي، وتم رسم المناطق الواقعة تحت القمم في الكروماتوغرامات CoA-bimane كدالة لمدخل CoA-bimane. عكس المنحنى القياسي حجم الامتصاص من CoA-bimane في طول موجة من 393 نانومتر.كما انعكس الفلور من CoA-bimane في الطول الموجي إثارة من 393 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 470 نانومتر. ويشار إلى فصل HPLC اللاحقة وملامح الكشف النموذجية عن كبد الماوس أو خلايا C3A البشرية المستزرعة هنا من خلال القمم الحمراء ، مع وقت الاحتفاظ بين 11 و 12 دقيقة باستخدام برنامج elution. إذا كان رد الفعل مع mBBr لا تسفر عن نتائج يمكن الكشف عنها، قد تحتاج كمية من Trizma-HCl إلى تعديل لخفض درجة ح H إلى ما يقرب من ثمانية.من الممكن الكشف عن جزيئات خلوية إضافية تحتوي على sulfhydryl أو ثيوستر مويتيس كمشتقات ثنائية. على سبيل المثال، الجلوتاثيون-bimane يمكن الكشف عن طريقة HPLC. هذه التقنية سوف تسمح للباحثين الآخرين للتحقيق في الدور المحتمل للخلل في التوازن العصبي المرتبطة بالخلل الأيضي، مثل النماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2.يجب على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية عند العمل مع المذيبات العضوية المستخدمة لاستخراج المرحلة الصلبة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...