Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
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Die Autoren würdigen die Finanzierung von gesponserter Forschung, die von CoA Therapeutics, Inc., einer Tochtergesellschaft von BridgeBio LLC, dem National Institutes of Health Grant GM34496 und den American Lebanese Syrian Associated Charities bereitgestellt wird.

Das in diesem Protokoll erwähnte Tierverfahren wurde gemäß den Protokollen 323 und 556 durchgeführt und vom St. Jude Children es Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee speziell genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
HINWEIS: Verwenden Sie Reinstwasser für alle Lösungen und wenn in verfahren angegeben.
<ol><li>1 mM Kaliumhydroxid (KOH) in Wasser vorbereiten.</li>
	<li>0.25 M KOH in Wasser vorbereiten.</li>
	<li>1 M Trizma-HCl in Wasse...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Hier zeigen wir ein zuverlässiges, schrittweises Verfahren zur Quantifizierung von CoA-GesamtcoA in Zellen und tierischen Geweben mit einer breiten Palette linearer Detektion, die in vielen Laboratorien zugänglich ist, die über einen HPLC mit einem Absorptions- oder Fluoreszenz-Ausgangsdetektor verfügen. Alternativ ist die Massenspektrometrie eine gängige Technik zur Bewertung von CoA- und CoA-Thioestern, ist aber aufgrund der Kosten der Instrumentierung und des für die Entwicklung der Methodik und der Interpretati...

Coenzym A (CoA) ist ein wesentlicher Cofaktor in allen lebenden Organismen und wird aus Pantothensäure, auch Pantothenat (das Salz der Pantothensäure) oder Vitamin B5 genannt, synthetisiert. CoA ist der wichtigste intrazelluläre Träger organischer Säuren, einschließlich kurzkettiger Säuren wie Acetat und Succinat, verzweigtkettige Säuren wie Propionat und Methylmalonat, langkettige Fettsäuren wie Palmitat und Oleat, sehr langkettige Fettsäuren wie mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Xenobiotika wie Valproinsäure. Die organische Säure bildet eine Thioester-Verbindung enzymatisch mit CoA, um ihre Verwendung als Substrat bei über 100 Reaktionen im Zwischenstoffwechsel zu ermöglichen1. CoA-Thioester sind auch allosterische Regulatoren und Transkriptionsaktivatoren. Es wird nungeschätzt 2, dass die zelluläre Gesamt-CoA-Versorgung reguliert ist3,4; Daher kann die CoA-Verfügbarkeit begrenzt sein, und dass CoA-Mängel katastrophal sein können, wie vererbte genetische Störungen zeigen, die sich auf die CoA-Biosyntheseauswirken 5. Pantothenatkinase katalysiert den ersten Schritt in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, genannt PKAN, wird durch Mutationen im PANK2-Gen 6verursacht. CoA-Synthase, kodiert durch das COASYN-Gen, katalysiert die letzten beiden Schritte in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und COASY Protein-Associated Neurodegeneration, genannt CoPAN, wird durch eine Mutation im COASYN-Gen verursacht 7. Sowohl PKAN als auch CoPAN sind vererbte neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Eisenakkumulation im Gehirn verbunden sind, und CoA-Mangel unterbewertet die Krankheitspathologien.
Die Zellulären Konzentrationen der gesamten CoA variieren zwischenGeweben 8 und Gesamt-CoA kann unter einer Vielzahl von physiologischen, pathologischen und pharmakologischen Zuständen erhöhen oder abnehmen. Leber CoA erhöht während kraftstoffumstellung von der Fütterung in den gefasteten Zustand9, und Leber CoA-Spiegel sind ungewöhnlich hoch bei Leptin-mangelhafte fettleibige Mäuse10. Leber CoA nimmt als Reaktion auf chronische Ethanol-Aufnahme11ab. Gehirn CoA-Spiegel im Pank2 Knockout-Maus-Modell sind während der perinatalen Periode depressiv, aber später im Erwachsenenstadium Gehirn CoA-Gehalt ist gleich wilde-Typ-Ebenen, was auf eine adaptive CoA-Antwort während der Entwicklung12. Die Manipulation des CoA-Gehalts des Gewebes durch Transgenese oder Genabgabemethoden wirkt sich auf metabolische und neuronale Funktionenaus 13,14,15. Die präklinische Entwicklung potenzieller Therapien für PKAN oder CoPAN umfasst Zell- oder Gewebe-CoA-Messungen als Indikatoren für die Wirksamkeit16,17,18,19,20 . Die Bewertung all dieser Bedingungen und ihrer metabolischen oder funktionellen Folgen erfordert eine quantitative Methode zur Messung der gesamten CoA.
Ein genauer, zuverlässiger Test zur Messung von CoA in biologischen Proben ist in vielen Labors eine technische Herausforderung. Leider gibt es keine Sonden zur Bewertung oder Quantifizierung von CoA- oder CoA-Thioestern in intakten Zellen, obwohl Analoga natürlicher CoA-Thioester weit verbreitet als mechanistische Sonden in Studien mit CoA-Ester unter Verwendung von Enzymen21verwendet wurden. Die Umwandlung von CoA, mit einem freien Sulfhydryl (-SH) Moiety, zu einem CoA-Thioester (oder umgekehrt) ist schnell in Zellen oder tierischen Geweben während der Übertragung in eine andere Umgebung und während der Zelllyse. Zahlreiche Acyl-CoA-Synthetasen und Acyl-CoA-Thioesterasen in Zellen vermitteln die Interkonversionen innerhalb des CoA-Pools, und zusätzliche Enzyme, die CoA-Thioester als Substrate nutzen, bleiben in biologischen Proben aktiv, bis sie durch chemische oder physikalische mittel. Die Auslagerung von Acylgruppen von CoA zu Carnitin durch Acyltransferasen ist ein Beispiel innerhalb des Netzwerks von Reaktionen, die die CoA/CoA-Thioester-Verteilung verändern können. Radioaktive Tracer können verwendet werden, um die CoA-Syntheseraten in Zellen zu messen. Die aktuellen Methoden zur Messung von CoA- und CoA-Derivaten in biologischen Proben wurden22 überprüft und umfassen gekoppelte enzymatische spektrophotometrische Assays, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometriebasierte Verfahren. Diese Methoden konzentrieren sich jedoch häufig auf bestimmte CoA-Molekulararten und sind blind für Variationen des gesamten CoA-Pools. Die gekoppelten enzymatischen Assays erfordern aufgrund geringer Detektionsempfindlichkeiten in der Regel größere Mengen an Eingangsmaterial und weisen einen begrenzten Linearitätsbereich auf.
Unser Labor hat ein zuverlässiges Verfahren zur Quantifizierung des gesamten CoA in kultivierten Zellen und tierischen Geweben entwickelt. Die Strategie umfasst die Hydrolyse aller CoA-Thioester, um während der Probenvorbereitung nur freies CoA zu liefern, anstatt sich um die Erhaltung und Analyse des gesamten Spektrums der CoA-Arten zu bemühen. Das Verfahren ist eine Zusammenstellung einzelner veröffentlichter Methoden zur Probenvorbereitung, CoA-Ableitung, Reinigung und Identifizierung nach Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Quantifizierung des derivatisierten CoA durch Absorption oder Fluoreszenzdetektion23,24,25. Die mit diesem Verfahren gewonnenen CoA-Bestimmungen haben unser Verständnis der CoA-Regulierung und die Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes zur Behandlung von CoA-Mängeln ermöglicht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

Neue Forschungen haben gezeigt, dass die zelluläre Coenzym A (CoA) Versorgung mit nachteiligen Auswirkungen auf Wachstum, Stoffwechsel und Überleben einschränkenkann. Die Messung von zellulärem CoA ist eine Herausforderung aufgrund seiner relativ geringen Häufigkeit und der dynamischen Umwandlung von freiem CoA in CoA-Thioester, die wiederum an zahlreichen Stoffwechselreaktionen teilnehmen. Es wird eine Methode beschrieben, die während der Probenvorbereitung durch mögliche Fallstricke navigiert, um einen Assay mit einem breiten linearen Nachweisbereich zu ergeben, der für den Einsatz in vielen biomedizinischen Laboratorien geeignet ist.

Eine relativ schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis von CoA-Gesamtinkulturzellen und Geweben wurde entwickelt, indem das Thiol von CoA mit mBBr zu einem Fluoreszenzmittel ableitet und dann das derivatisierte CoA-Bimane mit Reverse-Phase-HPLC gereinigt wird. Zunächst wird eine Standardkurve erzeugt, bei der bekannte und steigende Mengen des CoA-Bimane-Standards einzeln injiziert werden und die Bereiche unter den Spitzen in den CoA-Bimane-Chromatogrammen in Abhängigkeit vom Eingang CoA-bimane<strong class="xfig"...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Diese Methode beschreibt die Probenvorbereitung aus kultivierten Zellen und tierischen Geweben, die Extraktion und Derivatisierung von Coenzym A in den Proben, gefolgt von einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zur Reinigung und Quantifizierung des derivatisierten Coenzyms A durch Absorptions- oder Fluoreszenzdetektion.

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Coenzym A, kurz CoA genannt, ist ein wichtiger Cofaktor im Zellstoffwechsel. Quantitative Messungen zeigen Veränderungen, die mit Ernährungs- und Hormonzuständen in Tiermodellen auftreten. Diese Methode quantitiert die Gesamtmenge der zellulären CoA, einschließlich CoA-Derivate und freie CoA, in einer einfachen, zuverlässigen Methode.Mehrere Arten der Neurodegeneration mit Gehirneisenakkumulation sind mit Mutationen in den Genen des biosynthetischen CoA-Signalwegs verbunden. Diese Methode kann auf jedes biologische System angewendet werden, da alle Organismen CoA für Überleben, Wachstum und Funktion benötigen. Ein Erstforscher kann mit den ersten Schritten in der Probenvorbereitung zu kämpfen, wo es wichtig ist, die Proben absolut kalt zu halten und sie dann schnell in Kaliumhydroxid zu übertragen.Beschränken Sie die Anzahl der Proben in einer Charge vor der Übertragung auf Kaliumhydroxid, und üben Sie mit der Übertragung vor der Arbeit mit den experimentellen Proben. Viele Forscher sind nicht mit Festphasenextraktion bei der Herstellung biologischer Proben für spätere biochemische Analysen vertraut. Zunächst dreitduzieren Sie parallel dreifache Kulturgerichte, zwei für die biochemische Analyse und eine zur Bestimmung der lebensfähigen Zellzahl.Wenn sich die Kultur den späten subkonfluenten Dichten nähert, z. B. menschliche HepG2/C3A-Zellen, die auf eine Dichte von sechs bis acht mal 10 zu den sechs oder HEK 293T-Zellen herangewachsen sind, die auf eine Dichte von etwa 1,3 mal 10 bis zu den sieben pro 100-Millimeter-Schale angewachsen sind, ernten sie die anhaftenden Zellen in der Kultur. Dann fügen Sie ein Milliliter eiskaltes Wasser in das gleiche Kulturgericht. Verschrotten Sie Zellen in das kalte Wasser in der Schale, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Glas-Reagenzglas mit 400 Mikrolitern 0,25-Molar-Kaliumhydroxid und 1,5 Milliliter Wasser, um den pH-Wert über 12 zu bringen.Mischen Sie die Federung kräftig, indem Sie 10 Sekunden lang hoch wirbeln. Dann fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 55 Grad Celsius eine Stunde lang bebrüten, ohne im Wasserbad zu zittern. Dann fügen Sie 160 Mikroliter ein-Molar Trizma-Hydrochlorid-Lösung und 10 Mikroliter von 100-Millimolar mBBr.Mischen Sie durch Wirbel auf hoch für 10 Sekunden. Dadurch erhöht sich der pH-Wert auf etwa acht, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Bedecken Sie das Rohr mit Paraffinfolie, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei Stunden im Dunkeln, damit das mBBr mit dem Thiol von CoA reagiert.Nach zwei Stunden 100 Mikroliter Essigsäure hinzufügen und durch Wirbeln 10 Sekunden mischen, um die Reaktion zu stoppen. In der Röhre bildet sich ein Niederschlag. Als nächstes Zentrifuge bei 2.000 mal g für 15 Minuten.Um die gefällten Zellablagerungen zu entfernen, übertragen und speichern Sie den Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die Vollphasen-Extraktionssäulenreinigung. Vor Beginn der Analyse zwei Milliliter Kaliumhydroxid mit einem Millimolaren in ein Glas-Reagenzglas geben, das für das Einsetzen einer Sonde und Gewebestörungen mit einem Rotor-Stator-Homogenisator entwickelt wurde. Halten Sie die Röhre auf Eis, bis sie verwendet wird.Wiegen Sie die gefrorenen Gewebestücke schnell und notieren Sie das Nassgewicht für jede Probe. Übertragen Sie das Gewebe in das Glasrohr und homogenisieren Sie das Gewebe für 30 Sekunden. Vermeiden Sie ein vollständiges Auftauen des Gewebes.500 Mikroliter 0,25-molares Kaliumhydroxid hinzufügen. Wirbel auf hoch für 10 Sekunden, und auf Eis zu halten. Dies bringt den pH-Wert der Probe über 12, um die CoA-Thioester zu hydrolysieren, um insgesamt CoA zu liefern.Bedecken Sie die Röhre mit Paraffinfolie. Die Herstellung von kultivierten Zellen und die Herstellung von Geweben sind die wichtigsten Schritte in diesem Verfahren. Es ist wichtig, schnell hohe Kaliumhydroxid hinzufügen, um CoA Abbau zu verhindern.Inkubieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Wasserbad, ohne zu schütteln, um die Hydrolyse zu unterstützen. Fügen Sie dann 150 Mikroliter ein-Molar-Trizma-Hydrochlorid und 10 Mikroliter 100-Millimolar mBBr hinzu, um den pH-Wert auf etwa acht zu bringen, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Wirbel auf hoch für 10 Sekunden.Bedecken Sie das Rohr mit Paraffinfolie, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei Stunden im Dunkeln, um sicherzustellen, dass alle CoA mit mBBr abgeführt werden. Danach 100 Mikroliter Essigsäure hinzufügen und 10 Sekunden lang hoch wirbeln, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 2.000 mal g für 15 Minuten, um ausgefällten Zellschutt zu pelleten und den Überstand in ein Glas-Reagenzglas für die Festphasen-Extraktionssäulenreinigung zu übertragen.Bei Raumtemperatur gleichziehen Sie jede Einweg-2-2-Pyridyl-Ethyl-Kieselgelsäule mit einem Milliliter Waschpuffer, um sicherzustellen, dass die Pyridylfunktionsgruppe protoniert ist und als Anionenaustauscher fungiert. Dann pipette die Probe Überstand auf die Säule, und sammeln Sie das Eluat. Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer und einmal mit einem Milliliter Wasser, um alle nicht zurückgehaltenen Arten zu entfernen.Als nächstes, in ein separates Glas-Reagenzglas, waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Elutionspuffer, um das CoA-Bimane zu sammeln. Trocknen Sie die CoA-Bimane-Probe im Rohr unter Stickstoffgas. Versiegeln, das Rohr vollständig abdecken und bei minus 20 Grad Celsius lagern.Wenn Sie für die HPLC-Analyse bereit sind, setzen Sie die Probe in 300 Mikroliter Wasser wieder auf und mischen Sie sie kräftig, indem Sie 10 Sekunden lang hoch wirbeln. Die resuspendierte Probe in einen Zentrifugenrohrfilter und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang 5.000 mal g, um einen Niederschlag zu entfernen. Übertragen Sie dann die gefilterte Probe in eine Glasdurchstechflasche, die für die HPLC-Injektion geeignet ist.In dieser Studie zeigt ein repräsentatives HPLC-Profil die Retentionszeit des CoA-Bimane-Standards auf der C18 HPLC-Säule. Immer größere Mengen des CoA-Bimane-Standards wurden einzeln injiziert, und die Bereiche unter den Spitzen der CoA-Bimane-Chromatogramme wurden in Abhängigkeit vom Eingang CoA-Bimane dargestellt. Die Standardkurve spiegelte die Größe der Absorption von CoA-Bimane bei einer Wellenlänge von 393 Nanometern wider.Die Fluoreszenz von CoA-Bimane wurde auch bei der Anregungswellenlänge von 393 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 470 Nanometern reflektiert. Nachfolgende HPLC-Trennung und typische Detektionsprofile für Mausleber oder humankultivierte C3A-Zellen werden hier durch rote Peaks mit einer Retentionszeit zwischen 11 und 12 Minuten mit dem Elutionsprogramm angezeigt. Wenn die Reaktion mit mBBr keine nachweisbaren Ergebnisse liefert, muss die Menge an Trizma-HCl möglicherweise angepasst werden, um den pH-Wert auf etwa acht zu senken.Es ist möglich, zusätzliche zelluläre Moleküle zu erkennen, die Sulfhydryl- oder Thioester-Moieties als Bimane-Derivate enthalten. Beispielsweise kann Glutathion-Bimane mit der HPLC-Methode erkannt werden. Diese Technik wird es anderen Forschern ermöglichen, die potenzielle Rolle von CoA-Dysfunktion im Zusammenhang mit metabolischen Ungleichgewichten zu untersuchen, wie Tiermodelle von Typ-2-Diabetes.Bei der Arbeit mit organischen Lösungsmitteln, die für die Festphasenextraktion verwendet werden, sollten die Forscher persönliche Schutzausrüstungen verwenden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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