Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

המחברים מכירים במימון עבור מחקר ממומן שסופק על ידי CoA Therapeutics, Inc., חברת בת של ברידג LLC, המכונים הלאומיים להענקת מענק בריאות GM34496, ו לבנון האמריקאית הקשורים ארגוני צדקה.

נוהל בעלי החיים המכונה בפרוטוקול זה בוצע על פי פרוטוקולים 323 ו 556 ואישר במפורש על ידי בית החולים סנט ג'וד מחקר לילדים ועדת השימוש בעלי חיים מוסדיים.
1. הכנת פתרונות
הערה: השתמש במים אולטרה-טהורים עבור כל הפתרונות וכאשר נקבע בהליכים.
<ol><li>הכינו 1 מ"מ אשלגן הידרוקס...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

כאן אנו מדגימים הליך אמין, צעד אחר צעד כדי לכמת תעודת מקוריות בתאים ורקמות בעלי חיים עם מגוון רחב של זיהוי ליניארי, כי הוא נגיש במעבדות רבות כי יש בדיקות עם ספיגת או מזהה הפלט הפלואורסצנטית. לחילופין, ספקטרומטר מסה היא טכניקה נפוצה להערכת תעודת המקוריות ותעודת המקוריות, אך אינה זמינה באופן ...

Co A (CoA) הוא קופקטור חיוני בכל האורגניזמים החיים, והוא מסונתז מחומצה פנטותימית, המכונה גם פנטוידאט (מלח החומצה הפנטותית) או ויטמין B5. CoA הוא המוביל התאיים העיקרי של חומצות אורגניות, כולל חומצות שרשרת קצרות כגון אצטט ו סוזיטה, הענף חומצות שרשרת כגון propionate ו מתילמאלonate, חומצות שומן ארוכות כגון palmitate והרדוף, חומצות שומן מאוד ארוך שרשרת כגון חומצות שומן בלתי רוויות, ו xenobiotics כגון חומצה ולפרואית. החומצה האורגנית יוצרת הצמדה מבחינה דקדוקית באמצעות CoA כדי לאפשר את השימוש בה כמצע ביותר מ 100 תגובות בחילוף החומרים1. תעודת המקוריות הן גם מחוקקים אלוסטרוקים ומפעילים מפעילי הרכב. כעת מוערך2 כי הספק תעודת המקוריות של הסלולר מוסדר3,4; לפיכך, ניתן להגביל את זמינות ה-CoA ושליקויים בתעודת המקוריות עלולים להיות קטסטרופליים, כפי שניתן למשל בהפרעות גנטיות שעברו בירושה, המשפיעים על תעודת המקוריות של CoA5. פנטופיפיאט קינאז מזרז את הצעד הראשון בביוסינתזה של CoA (איור 1) ופנטופיפיאט קינאז, שנקרא pkan, נגרמת על ידי מוטציות ב- PANK2 gene6. CoA סינתאז, מקודד על ידי הגן Coasyn , מזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה CoA (איור 1) ו Coasy חלבון הקשורים נוירוניוון, נקרא copan, נגרמת על ידי מוטציה ב- coasyn גן7. הן PKAN ו CoPAN עוברות בירושה מחלות ניווניות הקשורים הצטברות ברזל במוח וליקויים CoA באופן בלתי מידי הפתווגיות המחלה.
רמות הסלולר של תעודת המקוריות משתנות בין הרקמות8 והמקוריות הכוללות יכולות להגדיל או להצטמצם תחת מגוון של מצבים פיזיולוגיים, פתולוגיים ופרמקלוגיים. תעודת הכבד מגדילה במהלך מיתוג הדלק מתוך הפדרלילמצבהבית, ורמות coa של הכבד גבוהות באופן חריג בעכברים שמנים לפטין לקויה10. תעודת הכבד מקטינה בתגובה בליעה אתנול כרונית11. רמות CoA של המוח במודל העכבר Pank2 מדוכאים במהלך תקופת הזמן הקצוב, אך מאוחר יותר בתוכן תעודת המקוריות של המוח בשלב מבוגר מקבילה לרמות מסוג פראי, המציינות תגובת CoA מסתגלת במהלך הפיתוח12. מניפולציה של תוכן תעודת הרקמה על ידי טרנסגנזה או שיטות משלוח גנטי משפיע על פונקציות מטבולית ועצביים13,14,15. פיתוח טרום קליני של טיפולים פוטנציאליים pkan או copan כולל תא או מדידות תעודת הרקמה כאינדיקטורים של יעילות16,17,18,19,20 . הערכה של כל התנאים הללו וההשלכות המטבולית או הפונקציונליות שלהם מחייבת שיטה כמותית למדידה של תעודת המקוריות הכוללת.
שיטת מדידה מדויקת ואמינה למדידת תעודת מקוריות בדגימות ביולוגיות היא אתגר טכני במעבדות רבות. למרבה הצער, אין בדיקה זמינים כדי להעריך או לכמת CoA או CoA thioesters בתאים שלמים, למרות האנלוגיות של תעודת מקוריות הטבע השתמשו באופן נרחב כמו בבדיקות מכניסטיות במחקרים של אסתר מקוריות ניצול אנזימים21. ההמרה של תעודת המקוריות, עם הmoiety הסולפקסיל (-SH) ללא תשלום, לתעודת המקוריות (או להיפך) מהירה בתאים או ברקמות בעלי חיים במהלך העברה לסביבה שונה ובמהלך הפירוק התאים. מספר רב של מערכות הפעלה של acyl-CoA ו-acyl-CoA מוחק בתאים מתווך בין המרות בתוך בריכת ה-CoA, ואנזימים נוספים המשתמשים בתעודת המקוריות בחומרים מעורבבים נשארים פעילים בדגימות ביולוגיות עד לאחר התניית על ידי כימיה או פיזית אומר. מחוץ לטעינה של acyl-קבוצות מתוך CoA ל קרניטין על ידי העברת התקן הוא דוגמה אחת בתוך רשת של תגובות שיכולות לשנות את התפלגות תעודת המקוריות/coa. ניתן להשתמש במשדרים רדיואקטיביים כדי למדוד שיעורי סינתזה של CoA בתאים. שיטות נוכחיות למדידת נגזרות CoA ו-CoA בדגימות ביולוגיות נבדקו22 וכוללות מצמידים spectrophotometric מגמטיים, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה ופרוצדורות מבוססות-ספקטרומטר מסה. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות לרוב במינים מולקולריים מסוימים של CoA ועיוורים לווריאציה של בריכת ה-CoA הכוללת. מצמידים אנזימטיים באופן כללי דורשים כמויות גדולות יותר של חומר קלט בשל רגישויות לזיהוי נמוך ויש להם מגוון מוגבל של יניאריות.
המעבדה שלנו פיתחה הליך אמין לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בתאים מתורבתים ורקמות בעלי חיים. האסטרטגיה כוללת הידרוליזה של כל תעודת המקוריות כדי להניב רק תעודת מקוריות במהלך הכנת המדגם, במקום לבצע מאמצים לשמור ולנתח את כל הספקטרום של מינים CoA. ההליך הוא אוסף של שיטות שפורסמו בנפרד לקראת הכנה לדוגמא, תעודת זהות, טיהור וזיהוי בעקבות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), וכימות של תעודת המקוריות על ידי ספיגת המידע או זיהוי של קרינה פלואורסצנטית23,24,25. דטרמינציות ה-CoA המתקבלות באמצעות הליך זה אפשרו את הבנתנו את רגולציה של תעודת המקוריות ואת פיתוח הגישה הטיפולית לטיפול בליקויים בתעודת המקוריות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

המחקר המתעוררים חשף כי הספק הסלולר (CoA) האספקה יכול להיות מגביל עם השפעה מזיקה על צמיחה, חילוף החומרים והישרדות. מדידת תעודת המקוריות הסלולרית היא אתגר בשל השפע הנמוך יחסית וההמרה הדינמית של תעודת המקוריות לתעודת המקוריות, אשר בתורו, משתתפות בתגובות מטבוליות רבות. שיטה מתוארת כי מנווט באמצעות מלכודות פוטנציאליות במהלך הכנת המדגם כדי להניב בדיקות עם טווח ליניארי רחב של זיהוי המתאים לשימוש במעבדות ביו-רפואיים רבים.

שיטה מהירה ואמינה יחסית לאיתור תעודת המקוריות הכוללת בתאים וברקמות שפותחו על-ידי השימוש בשיטת ה-coa לסוכן פלורסנט באמצעות mBBr, ולאחר מכן מטהרת את תעודת הזהות של תעודת הזהות באמצעות היפוך הפאזה. עקומה סטנדרטית נוצרת לראשונה, כאשר הכמויות הידועות והגדלות של תקן ה-CoA-בימרו מוזרקים בנפרד והאזור?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

שיטה זו מתארת הכנה לדוגמא מתאים מתורבתים ומרקמות בעלי חיים, מיצוי והלקות של הקוקוקון A בדגימות, ואחריו כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה לטיהור וכימות של קומית הלגלתית A על ידי ספיגה או גילוי של קרינה פלואורסצנטית.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

קואנזים A, הנקרא CoA בקיצור, הוא גורם חשוב בחילוף החומרים התאי. מדידות כמותיות חושפות שינויים שקורים עם מצבי תזונה והורמונים במודלים של בעלי חיים. שיטה זו מכמתת את הכמות הכוללת של CoA הסלולר, כולל נגזרות CoA ו- CoA חינם, בשיטה פשוטה ואמינה.מספר סוגים של ניוון עצבי עם הצטברות ברזל במוח קשורים עם מוטציות בגנים של המסלול הביוסינתטי CoA. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת ביולוגית מאז כל האורגניזמים דורשים CoA להישרדות, צמיחה, ותפקוד. חוקר בפעם הראשונה עשוי להיאבק עם הצעדים הראשונים בהכנת מדגם, שם חשוב לשמור על הדגימות קר לחלוטין ולאחר מכן להעביר אותם במהירות אשלגן הידרוקסיד.להגביל את מספר הדגימות באצווה לפני העברה אשלגן הידרוקסידי, ולתרגל עם ההעברה לפני העבודה עם דגימות הניסוי. חוקרים רבים אינם מכירים מיצוי בשלב מוצק בהכנת דגימות ביולוגיות לניתוח ביוכימי מאוחר יותר. ראשית, דגירה צלחות תרבות טריליקט במקביל, שניים לניתוח ביוכימי ואחד לקביעת מספר תא קיימא.כאשר התרבות מתקרבת צפיפות תת מודע מאוחר, למשל, תאי HepG2/C3A האנושי גדל לצפיפות של שש עד שמונה פעמים 10 לשישה או HEK 293T תאים גדל לצפיפות של כ 1.3 פעמים 10 כדי שבעה לכל צלחת 100 מילימטר, לקצור את התאים חסידים בתרבות. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מים קרים כקרח לאותה מנה תרבותית. מגרדים תאים למים הקרים בצלחת, ומעבירים את מתלי התא למבחנה מזכוכית המכילה 400 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן ו -1.5 מיליליטר מים כדי להביא את ה- pH מעל 12.מערבבים את ההשעיה במרץ על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. ואז לכסות בחוזקה עם סרט פרפין, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלי לרעוד באמבט מים. לאחר מכן, להוסיף 160 microliters של פתרון אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr.מערבבים על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. זה מביא את ה-pH לשמונה בערך כדי לתמוך בתגובת mBBr עם CoA חינם. מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך עבור mBBr להגיב עם thiol של CoA.לאחר שעתיים, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חומצה אצטית, ומערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. משקעים נוצרים בצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות.כדי להסיר את פסולת התאים המוזרזים, להעביר ולשמור את supernatant במבחנת זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק. לפני תחילת הניתוח, להוסיף שני מיליליטר של אשלגן הידרוקסיד מילימולרי אחד למבחנה זכוכית המיועדת להכנסת בדיקה שיבוש רקמות עם homogenizer רוטור-סטטור. שמור את הצינור על קרח עד השימוש.לשקול את חתיכות רקמה קפואה במהירות, ולתזמן את המשקל הרטוב עבור כל מדגם. מעבירים את הרקמה לצינור הזכוכית, ומעבירים את הרקמה להומוגניזציה למשך 30 שניות. הימנע הפשרה מלאה של הרקמה.מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות, ולשמור על קרח. זה מביא את ה- pH של המדגם מעל 12 כדי הידרוליזה thioesters CoA להניב CoA הכולל.מכסים את הצינור עם סרט פרפין. הכנת תאים מתורבתים והכנת רקמות הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. חשוב להוסיף אשלגן הידרוקסיד גבוה במהירות כדי למנוע השפלה CoA.דגירה הדגימות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמבט מים מבלי לרעוד כדי לתמוך הידרוליזה. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr להביא את ה- pH על שמונה לתמיכה בתגובת mBBr עם CoA חינם. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות.מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך כדי להבטיח את כל CoA נגזר עם mBBr. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חומצה אצטית, ומערבולת על גבוה במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות כדי גלולה פסולת תאים זירז, ולהעביר את supernatant לתוך מבחנה זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק.בטמפרטורת החדר, לצייד כל עמוד ג'ל חד פעמי חד-מיליליטר 2-2-פירידל-אתיל סיליקה עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף כדי להבטיח כי הקבוצה הפונקציונלית פירידל הוא protonated ויתפקד כמחליף אניון. לאחר מכן, פיפטה על-טבעי מדגם על העמודה, ולאסוף את eluate. לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מים כדי להסיר כל מינים נגועים.לאחר מכן, לתוך מבחנה זכוכית נפרדת, לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון כדי לאסוף את CoA-bimane. יבש את דגימת CoA-bimane בצינור תחת גז חנקן. לאטום, לכסות לחלוטין את הצינור, ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.כאשר אתה מוכן לניתוח HPLC, יש למצות את הדגימה ב-300 מיקרוליטרים של מים, ולערבב במרץ על-ידי מערבולת גבוהה למשך 10 שניות. מעבירים את הדגימה המתווסת למסנן צינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי להסיר כל תריס. לאחר מכן, העבר את הדגימה המסוננת לבקבוקון זכוכית המתאים להזרקת HPLC.במחקר זה, פרופיל HPLC מייצג מציג את זמן השמירה של תקן CoA-bimane בעמודה C18 HPLC. כמויות הולכות וגדלות של תקן CoA-bimane הוזרקו בנפרד, ואת האזורים מתחת לפסגות הכרומטוגרמות CoA-bimane היו התווה כפונקציה של CoA-bimane קלט. העקומה הסטנדרטית שיקפה את עוצמת הספיגה של CoA-bimane באורך גל של 393 ננומטר.הפלואורסצנטיות של CoA-bimane באה לידי ביטוי גם באורך גל העירור של 393 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר. הפרדת HPLC עוקבת ופרופילי זיהוי אופייניים עבור כבד עכבר או תאי C3A מתורבתים אנושיים מסומנים כאן על ידי פסגות אדומות, עם זמן שמירה בין 11 ל -12 דקות באמצעות תוכנית האלוטיון. אם התגובה עם mBBr אינה מניבה תוצאות הניתנות לגילוי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כמות Trizma-HCl כדי להוריד את ה- pH לשמונה בקירוב.ניתן לזהות מולקולות תאיות נוספות המכילות מותי סולף-הידרויל או תיואסטר כנגזרות בימאן. לדוגמה, ניתן לזהות גלוטתיון-בימאן בשיטת HPLC. טכניקה זו תאפשר לחוקרים אחרים לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של תפקוד לקוי של CoA הקשורים לחוסר איזון מטבולי, כגון מודלים של בעלי חיים של סוכרת מסוג 2.החוקרים צריכים להשתמש בציוד מגן אישי בעת עבודה עם ממיסים אורגניים המשמשים להפקת שלב מוצק.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...