Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
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Gli autori riconoscono i finanziamenti per la ricerca sponsorizzata fornita da CoA Therapeutics, Inc., una filiale di BridgeBio LLC, la sovvenzione national Institutes of Health GM34496 e gli American Lebanese Syrian Associated Charities.

La procedura animale di cui al presente protocollo è stata eseguita secondo i protocolli 323 e 556 e specificamente approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del St. Jude Children's Research Hospital.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Utilizzare acqua ultrapura per tutte le soluzioni e quando indicato nelle procedure.
<ol><li>Preparare 1 mM di idrossido di potassio (KOH) in acqua.</li>
	<li>Preparare 0,25 M KOH in acqua.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Qui dimostriamo una procedura affidabile e graduale per quantificare il CoA totale nelle cellule e nei tessuti animali con un'ampia gamma di rilevamenti lineari accessibili in molti laboratori che hanno un HPLC con un rilevatore di uscita di assorbimento o fluorescenza. In alternativa, la spettrometria di massa è una tecnica comune per la valutazione dei tioesteri CoA e CoA, ma non è ampiamente disponibile a causa del costo della strumentazione e delle conoscenze specialistiche necessarie per lo sviluppo della metodolo...

Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall'acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell'acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l'acido valproico. L'acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo intermedio1. I tioesteri coA sono anche regolatori allosterici e attivatori trascrizionali. Ora è apprezzato2 che la fornitura totale cellulare di CoA è regolata3,4; pertanto, la disponibilità di CoA può essere limitante e le carenze di CoA possono essere catastrofiche, come esemplificato da disturbi genetici ereditari che hanno un impatto sulla biosintesi coa5. Pantothenate chinaase catalizza il primo passo nella biosintesi coa (Figura 1) e Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, chiamato PKAN, è causata da mutazioni nel gene PANK2 6. La sintesi della CoA, codificata dal gene COASYN, catalizza gli ultimi due passaggi nella biosintesi CoA (Figura 1) e nella Neurodegenerazione associata alle proteine COASY, chiamata CoPAN, è causata da una mutazione nel gene COASYN 7. Sia PKAN che CoPAN sono malattie neurodegenerative ereditarie associate all'accumulo di ferro nel cervello e alle carenze di CoA in modo inferiore alle patologie.
I livelli cellulari di CoA totale variano tra i tessuti8 e CoA totale può aumentare o diminuire sotto una varietà di stati fisiologici, patologici e farmacologici. Il CoA del fegato aumenta durante il passaggio del combustibile dallo stato di alimentazione allo stato digiunato9e i livelli di CoA epatica sono anormalmente elevati nei topi obesi carenti di leptina10. Fegato CoA diminuisce in risposta all'ingestione cronica di etanolo11. I livelli di CoA cerebrale nel modello di topo knockout Pank2 sono depressi durante il periodo perinatale, ma più tardi nella fase adulta il contenuto di CoA del cervello è equivalente ai livelli di tipo selvaggio, indicando una risposta CoA adattiva durante lo sviluppo12. Manipolazione del contenuto di CoA dei tessuti mediante transgenesi o metodi di somministrazione genica influisce sulle funzioni metaboliche e neurali13,14,15. Lo sviluppo preclinico di potenziali terapie per PKAN o CoPAN include misurazioni CoA cellulari o tissutali come indicatori di efficacia16,17,18,19,20 . La valutazione di tutte queste condizioni e delle loro conseguenze metaboliche o funzionali richiede un metodo quantitativo per la misurazione del CoA totale.
Un test accurato e affidabile per misurare CoA in campioni biologici è una sfida tecnica in molti laboratori. Purtroppo, non ci sono sonde disponibili per valutare o quantificare i tioesteri CoA o CoA in cellule intatte, anche se analoghi di tioesters CoA naturali sono stati ampiamente utilizzati come sonde meccanicistiche negli studi di CoA ester utilizzando enzimi21. La conversione di CoA, con un solfuro libero (-SH), in un tifoso di CoA (o viceversa) è rapida nelle cellule o nei tessuti animali durante il trasferimento in un ambiente diverso e durante la lisi cellulare. Numerosi sintetasi acyl-CoA e tioesterai di CoA nelle cellule mediano le interconversioni all'interno del pool di CoA, e ulteriori enzimi che utilizzano il tioestro coa come substrati rimangono attivi in campioni biologici fino a quando non vengono spenti da prodotti chimici o fisici mezzo. L'off-loading dei gruppi acili dal CoA alla carnitina da parte dei transferasi di acyl è un esempio all'interno della rete di reazioni che possono alterare la distribuzione di coA/CoA thioester. I traccianti radioattivi possono essere utilizzati per misurare i tassi di sintesi CoA nelle cellule. Gli attuali metodi per misurare i derivati di CoA e CoA in campioni biologici sono stati esaminati22 e includono saggi spettrofotometrici enzimatici accoppiati, cromatografia liquida ad alta pressione e procedure basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, questi metodi sono spesso focalizzati su particolari specie molecolari di CoA e sono ciechi alla variazione della piscina totale di CoA. I saggi enzimatici accoppiati generalmente richiedono grandi quantità di materiale di input a causa di basse sensibilità di rilevamento e hanno una gamma limitata di linearità.
Il nostro laboratorio ha sviluppato una procedura affidabile per la quantificazione del CoA totale nelle cellule coltivate e nei tessuti animali. La strategia include l'idrolisi di tutti i tioesteri CoA per produrre solo CoA gratuito durante la preparazione del campione, piuttosto che fare sforzi per mantenere e analizzare l'intero spettro delle specie CoA. La procedura è una compilazione di singoli metodi pubblicati per la preparazione dei campioni, la derivazione del CoA, la purificazione e l'identificazione a seguito della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e la quantificazione della CoA derivata mediante assorbimento o rilevamento della fluorescenza23,24,25. Le determinazioni CoA ottenute utilizzando questa procedura hanno permesso la nostra comprensione della regolazione CoA e lo sviluppo di un approccio terapeutico per il trattamento delle carenze di CoA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

La ricerca emergente ha rivelato che l'offerta di coenzenzima cellulare A (CoA) può diventare limitante con un impatto negativo sulla crescita, il metabolismo e la sopravvivenza. La misurazione del CoA cellulare è una sfida per la sua relativamente bassa abbondanza e la conversione dinamica di CoA gratuita a CoA thioesters che, a sua volta, partecipano a numerose reazioni metaboliche. Viene descritto un metodo che naviga attraverso potenziali insidie durante la preparazione del campione per produrre un saggio con un'ampia gamma lineare di rilevamento che è adatto per l'uso in molti laboratori biomedici.

Un metodo relativamente veloce e affidabile per il rilevamento del CoA totale nelle cellule e nei tessuti coltivati è stato sviluppato derivando il thiol di CoA a un agente fluorescente utilizzando mBBr, e quindi purificando il CoA-bimane derivata utilizzando la fase inversa HPLC. Viene generata per la prima volta una curva standard, in cui quantità note e crescenti dello standard CoA-bimane vengono iniettate singolarmente e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane vengono tracciate in funzione dell'input Co...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Questo metodo descrive la preparazione del campione da cellule coltivate e tessuti animali, l'estrazione e la derivazione del coenzima A nei campioni, seguita dalla cromatografia liquida ad alta pressione per la purificazione e la quantificazione del coenzima derivato A da rilevamento dell'assorbimento o della fluorescenza.

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Il coenzima A, chiamato CoA in breve, è un importante cofattore nel metabolismo cellulare. Le misurazioni quantitative rivelano cambiamenti che si verificano con stati nutrizionali e ormonali nei modelli animali. Questo metodo quantifica la quantità totale di CoA cellulare, inclusi i derivati CoA e il CoA libero, in un metodo semplice e affidabile.Diversi tipi di neurodegenerazione con accumulo di ferro cerebrale sono associati a mutazioni nei geni della via biosintetica CoA. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema biologico poiché tutti gli organismi richiedono CoA per la sopravvivenza, la crescita e la funzione. Un ricercatore per la prima volta può lottare con i primi passi nella preparazione del campione, dove è importante mantenere i campioni assolutamente freddi e poi trasferirli rapidamente in idrossido di potassio.Limitare il numero di campioni in un lotto prima del trasferimento in idrossido di potassio e esercitarsi con il trasferimento prima di lavorare con i campioni sperimentali. Molti ricercatori non conoscono l'estrazione in fase solida nella preparazione di campioni biologici per successive analisi biochimiche. Per iniziare, incubare i piatti di coltura triplicati in parallelo, due per l'analisi biochimica e uno per la determinazione del numero di cellule vitali.Quando la coltura si avvicina alle densità subconfluenti tardive, ad esempio, le cellule Umane HepG2/C3A coltivate ad una densità da sei a otto volte 10 alle cellule sei o HEK 293T coltivate ad una densità di circa 1,3 per 10 al sette per piatto da 100 millimetri, raccolgono le cellule aderenti nella coltura. Quindi, aggiungere un millilitro di acqua ghiacciata allo stesso piatto di coltura. Raschiare le cellule nell'acqua fredda nel piatto e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di vetro contenente 400 microlitri di idrossido di potassio 0,25 molare e 1,5 millilitri di acqua per portare il pH sopra i 12.Mescolare vigorosamente la sospensione vortice in alto per 10 secondi. Quindi coprire strettamente con pellicola di paraffina e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora senza tremare in un bagno d'acqua. Quindi, aggiungere 160 microlitri di soluzione trizma-cloridrato un molare e 10 microlitri da 100 millimolare mBBr.Mescolare in vortice in alto per 10 secondi. Questo porta il pH a circa otto per supportare la reazione mBBr con CoA libero. Coprire il tubo con pellicola di paraffina e incubare i campioni a temperatura ambiente per due ore al buio affinché l'mBR reagisca con il tiolo di CoA.Dopo due ore, aggiungere 100 microlitri di acido acetico e mescolare vortice per 10 secondi per fermare la reazione. Una precipitazione si forma nel tubo. Quindi, centrifuga a 2.000 volte g per 15 minuti.Per rimuovere i detriti cellulari precipitati, trasferire e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna di estrazione in fase solida. Prima di iniziare l'analisi, aggiungere due millilitri di idrossido di potassio millimolare a una provetta di vetro progettata per l'inserimento di una sonda e interruzione dei tessuti con un omogeneizzatore rotore-statore. Tenere il tubo sul ghiaccio fino all'uso.Pesare rapidamente i pezzi di tessuto congelato e registrare il peso umido per ogni campione. Trasferire il tessuto nel tubo di vetro e omogeneizzare il tessuto per 30 secondi. Evitare lo scongelamento completo del tessuto.Aggiungere 500 microlitri di idrossido di potassio 0,25 molare. Vortice in alto per 10 secondi, e tenere sul ghiaccio. Ciò porta il pH del campione sopra 12 ad idrolizzare i tioestri coa per produrre CoA totale.Coprire il tubo con pellicola di paraffina. La preparazione di cellule coltivate e la preparazione dei tessuti sono i passaggi più critici in questa procedura. È importante aggiungere rapidamente idrossido di potassio alto per prevenire la degradazione della CoA.Incubare i campioni a 55 gradi Celsius per due ore in un bagno d'acqua senza tremare per sostenere l'idrolisi. Quindi, aggiungere 150 microlitri di Trizma-cloridrato di un molare e 10 microlitri di mBBr da 100 millimolari per portare il pH a circa otto per supportare la reazione mBBr con CoA libero. Vortice in alto per 10 secondi.Coprire il tubo con pellicola di paraffina e incubare i campioni a temperatura ambiente per due ore al buio per assicurarsi che tutta la CoA sia derivatizzata con mBBr. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di acido acetico e vortice in alto per 10 secondi per fermare la reazione. Centrifugare a 2.000 volte g per 15 minuti per i detriti cellulari precipitati a pellet e trasferire il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna di estrazione in fase solida.A temperatura ambiente, equilibrare ogni colonna di gel di silice usa e getta da 2-2-piridil-etile con un millilitro di tampone di lavaggio per garantire che il gruppo funzionale pirindilico sia protonato e funzioni come scambiatore di anione. Quindi, pipettare il supernatante campione sulla colonna e raccogliere l'eluato. Lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone di lavaggio e una volta con un millilitro d'acqua per rimuovere eventuali specie non contaminate.Successivamente, in una provetta di vetro separata, lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone di eluizione per raccogliere il CoA-bimane. Asciugare il campione di CoA-bimano nel tubo sotto gas azoto. Sigillare, coprire completamente il tubo e conservare a meno 20 gradi Celsius.Quando è pronto per l'analisi HPLC, rimescolare il campione in 300 microlitri di acqua e mescolare vigorosamente a vortice in alto per 10 secondi. Trasferire il campione rimorsi su un filtro a tubo di centrifuga e centrifugare a 5.000 volte g per 10 minuti per rimuovere qualsiasi precipitante. Quindi, trasferire il campione filtrato su una fiala di vetro adatta all'iniezione HPLC.In questo studio, un profilo HPLC rappresentativo mostra il tempo di conservazione dello standard CoA-bimane sulla colonna HPLC C18. Quantità crescenti dello standard CoA-bimane sono state iniettate singolarmente, e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane sono state tracciate in funzione dell'ingresso CoA-bimane. La curva standard rifletteva la grandezza dell'assorbanza del CoA-bimano ad una lunghezza d'onda di 393 nanometri.La fluorescenza del CoA-bimano è stata riflessa anche alla lunghezza d'onda di eccitazione di 393 nanometri e alla lunghezza d'onda di emissione di 470 nanometri. La successiva separazione HPLC e i profili di rilevamento tipici per il fegato di topo o le cellule C3A coltivate dall'uomo sono indicati qui da picchi rossi, con un tempo di ritenzione compreso tra 11 e 12 minuti utilizzando il programma di eluizione. Se la reazione con mBBr non produce risultati rilevabili, potrebbe essere necessario regolare la quantità di Trizma-HCl per abbassare il pH a circa otto.È possibile rilevare molecole cellulari aggiuntive che contengono moieties sulfhydryl o tioester come derivate bimane. Ad esempio, il glutatione-bimano può essere rilevato con il metodo HPLC. Questa tecnica consentirà ad altri ricercatori di indagare il potenziale ruolo della disfunzione della CoA associata allo squilibrio metabolico, come i modelli animali del diabete di tipo 2.I ricercatori dovrebbero utilizzare dispositivi di protezione individuale quando lavorano con solventi organici utilizzati per l'estrazione in fase solida.

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