Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
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저자는 CoA 치료, Inc., BridgeBio LLC의 자회사, 건강 보조금 GM34496의 국립 연구소, 그리고 미국 레바논 시리아 관련 자선 단체에 의해 제공되는 후원 연구에 대한 자금을 인정.

이 프로토콜에 언급 된 동물 절차는 프로토콜 323 및 556에 따라 수행되었으며 세인트 주드 어린이 연구 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 특별히 승인했습니다.
1. 솔루션 준비
참고: 모든 용액과 절차에 명시된 경우 초순수를 사용하십시오.
<ol><li>물에 1 mMM 수산화 칼륨 (KOH)을 준비합니다.</li>
	<li>0.25 M KOH를 물에 준비하십시오.</li>
	<li>물에 1 M Trizma-...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

여기서 우리는 흡수 또는 형광 출력 검출기를 가진 HPLC가 있는 많은 실험실에서 접근할 수 있는 광범위한 선형 검출을 가진 세포 및 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 단계별 절차를 보여줍니다. 양자택일로, 질량 분석법은 CoA와 CoA 티에스테르를 평가하기 위한 일반적인 기술입니다, 그러나 계측의 비용 및 방법론의 발달 및 데이터의 해석을 위해 요구된 전문화한 지식 때문?...

코엔자임 A (CoA)는 모든 살아있는 유기체의 필수 보조 인자이며 판토테네이트 (판토테닉 산의 소금) 또는 비타민 B5라고도하는 판토테산산에서 합성됩니다. CoA는 아세테이트와 숙시네이트와 같은 짧은 사슬 산, 프로피오네이트 및 메틸말로네이트와 같은 분기 사슬 산, 팔미테이트 및 올레테이트와 같은 긴 사슬 지방산, 매우 긴 사슬 지방산과 같은 유기산의 주요 세포 내 담체입니다. 고도 불포화 지방산, 및 valproic 산과 같은 xenobiotics. 유기산은 CoA와 동위적으로 티오에스테르 연계를 형성하여 중간 물질 대사에서 100개 이상의 반응에서 기질로서의 사용을 가능하게 한다1. CoA 티에스터는 또한 알로스테릭 조절제 및 전사 활성제입니다. 그것은 지금 평가2 셀룰러 총 CoA 공급규제3,4; 따라서, CoA 가용성은 제한될 수 있고, CoA 결핍은 CoA생합성5에영향을 미치는 유전적 무질서에 의해 예시된 바와 같이 치명적일 수 있다. 판토테네이트 키나아제는 CoA 생합성의 첫 번째단계(도 1)와판토테네이트 키나아제 관련 신경변성, PKAN이라고 불리며, PANK2 유전자6의돌연변이에 의해 유발된다. COASYN 유전자에 의해 인코딩된 CoA 신타제는 CoASYN 유전자의 마지막 두 단계를촉매(그림 1)및 COASY 단백질 관련 신경 변성이라고 하며, COASYN 유전자7의돌연변이에 의해 유발된다. PKAN과 CoPAN 은 모두 뇌의 철분 축적과 관련된 신경 퇴행성 질환과 CoA 결핍이 질병 병리의 밑에 유전됩니다.
총 CoA의 세포 수준은조직 8및 총 CoA가 다양한 생리학적, 병리학적 및 약리학적 상태 하에서 증가 또는 감소할 수 있다. 간 CoA는 공급 상태에서 급식 상태9로연료 전환 시 증가하고, 간 CoA 수준은 렙틴 결핍 비만 마우스10에서비정상적으로 높다. 간 CoA는 만성 에탄올 섭취에 반응하여감소11. Pank2 녹아웃 마우스 모델에서뇌 CoA 수준은 주산기 동안 우울하지만, 이후 성인 단계에서 뇌 CoA 함량은 야생형 수준과 동일하며, 개발 시 적응형 CoA 반응을 나타낸다12. 유전자 발생 또는 유전자 전달 방법에 의한 조직 CoA 함량의 조작은 대사 및 신경 기능에 영향을 미치는13,14,15. PKAN 또는 CoPAN에 대한 잠재적 치료법의 전임상 개발은 효능16,17,18,19,20의 지표로서 세포 또는 조직 CoA 측정을 포함한다. . 이러한 모든 조건및 이들의 대사 또는 기능적 결과에 대한 평가는 총 CoA의 측정을 위한 정량적 방법을 요구한다.
생물학적 시료에서 CoA를 측정하기 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 분석방법은 많은 실험실에서 기술적 과제입니다. 불행하게도, 천연 CoA 티에스테르의 유사체가 효소21을활용하는 CoA 에스테르의 연구에서 기계론적 프로브로 널리 사용되어 왔지만, 손상되지 않은 세포에서 CoA 또는 CoA 티에스테르를 평가하거나 정량화하는 데 사용할 수 있는 프로브는 없습니다. CoA의 변환, 자유 설피 드릴 (-SH) moiety, CoA 티오 에스터 (또는 그 반대의 경우도 마찬가지)는 다른 환경으로 전송하는 동안 세포 또는 동물 조직에서 신속하고 세포 용해 동안. 세포에 있는 수많은 acyl-CoA 합성및 아실 CoA 티에스테르아제는 CoA 풀 내의 상호 변환을 중재하고, 기질로 CoA 티에스테르를 이용하는 추가 효소는 화학적 또는 물리적으로 담금질될 때까지 생물학 견본에서 활성 상태로 남아 있습니다 의미. 아실 트랜스퍼라제에 의한 CoA에서 카르니틴으로의 아실-그룹의 오프로딩은 CoA/CoA 티오에스테르 분포를 변경할 수 있는 반응 네트워크 내의 한 예입니다. 방사성 추적자는 세포에서 CoA 합성의 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 생물학적 샘플에서 CoA 및 CoA 유도체를 측정하는 현재 의 방법은22를 검토되었으며 결합된 효소 분광광도 분석법, 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 기반 절차를 포함합니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 특정 CoA 분자 종에 초점을 맞추고 전체 CoA 풀의 변화에 장님입니다. 결합된 효소 해석은 일반적으로 낮은 검출 감도로 인해 더 많은 양의 입력 물질을 필요로 하며 선형성이 제한적입니다.
우리의 실험실은 배양 된 세포와 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기위한 신뢰할 수있는 절차를 개발했습니다. 이 전략에는 CoA 종의 전체 스펙트럼을 유지하고 분석하기 위한 노력을 하기보다는 시료 준비 중에 무료 CoA만 을 산출하는 모든 CoA 티에스테르의 가수분해가 포함됩니다. 이 절차는 샘플 준비, CoA 유도화, 고압 액체 크로마그래피(HPLC) 및 흡광도에 의한 유도된 CoA의 정량화에 따른 개별 공표 방법의 편집입니다. 형광 검출23,24,25. 이 절차를 사용하여 얻은 CoA 결정은 CoA 규정의 우리의 이해와 CoA 결핍의 처리를 위한 치료 접근의 발달을 가능하게 했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

신흥 연구는 세포 코엔자임 A (CoA) 공급이 성장, 신진 대사 및 생존에 해로운 영향을 미치는 제한될 수 있음을 밝혔습니다. 세포 CoA의 측정은 상대적으로 낮은 풍부함과 무료 CoA를 CoA 티에스테르로의 동적 변환으로 인해 도전이며, 차례로 수많은 대사 반응에 참여합니다. 많은 생물 의학 실험실에서 사용하기에 적합한 검출의 넓은 선형 범위와 분석법을 산출하기 위해 샘플 준비 동안 잠재적 인 함정을 탐색하는 방법이 설명된다.

배양 된 세포 및 조직에서 총 CoA의 검출을위한 비교적 빠르고 신뢰할 수있는 방법은 mBBr을 사용하여 형광제에 CoA의 티올을 유도한 다음 역상 HPLC를 사용하여 유도 된 CoA-bimane을 정제함으로써 개발되었습니다. 표준 곡선이 먼저 생성되고, 여기서 CoA-bimane 표준의 알려진 양이 개별적으로 주입되고 CoA-bimane 크로마토그램의 피크 아래 영역이 입력 CoA-bimane의 함수로서 플롯됩니다(그림4)...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

이 방법은 배양 된 세포 및 동물 조직에서 샘플 준비를 설명하고, 샘플에서 코엔자임 A의 추출 및 유도체화를 설명하고, 유도된 코엔자임 A의 정제 및 정량화를 위한 고압 액체 크로마토그래피를 흡광도 또는 형광 검출.

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Coa라고 불리는 Coenzyme A는 세포 대사의 중요한 보조 요소입니다. 정량적 측정은 동물 모델의 영양 및 호르몬 상태에서 발생하는 변화를 보여줍니다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수있는 방법으로 CoA 파생 상품 및 무료 CoA를 포함한 셀룰러 CoA의 총 양을 양량.뇌 철 축적과 신경 변성의 여러 유형은 CoA 생합성 경로의 유전자에 있는 돌연변이와 연관됩니다. 이 방법은 모든 유기체가 생존, 성장 및 기능에 대한 CoA를 필요로하기 때문에 모든 생물학적 시스템에 적용 될 수있다. 처음 연구원은 시료를 절대적으로 차갑게 유지하고 수산화 칼륨으로 신속하게 옮기는 것이 중요한 샘플 준비의 첫 번째 단계로 어려움을 겪을 수 있습니다.수산화칼륨으로 옮기기 전에 일괄 처리된 시료수를 제한하고 실험 용 시료로 작업하기 전에 이송과 함께 연습합니다. 많은 연구원은 나중에 생화확적인 분석을 위한 생물학 견본의 준비에 있는 고체 상 추출에 익숙하지 않습니다. 우선, 배양 접시를 병렬로 배양, 생화학 적 분석을 위한 2개, 실행 가능한 세포 수의 측정을 위한 요리인배기를 배양하는 배구를 배양한다.배양이 후기 하위 밀도에 접근할 때, 예를 들어, 인간 HepG2/C3A 세포는 6~8배 의 밀도로 성장하여 6또는 HEK 293T 세포의 밀도로 성장하여 100mm 당 7배 에서 약 1.3배 의 밀도로 성장하여 배양에서 부착세포를 수확한다. 그런 다음, 같은 문화 요리에 얼음 차가운 물 1 밀리리터를 추가합니다. 식기의 차가운 물에 세포를 긁어 내고, 세포 현탁액을 0.25-어금니 칼륨 수산화칼륨과 1.5 밀리리터의 물 400마이크로리터를 포함하는 유리 시험 관으로 이송하여 12 위에 pH를 가져온다.10초 동안 높은 에서 소용돌이를 통해 서스펜션을 적극적으로 섞습니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 단단히 덮고 수조에서 흔들리지 않고 1 시간 동안 섭씨 55도에서 배양하십시오. 그런 다음 1개의 어금니 트리즈마-염산염 용액 160마이크로리터와 100밀리마일러 mBBr의 10마이크로리터를 추가합니다.10초 동안 높은 에서 소용돌이에 섞으세요. 이것은 무료 CoA와 mBBr 반응을 지원하기 위하여 대략 8에 pH를 가져옵니다. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고, mBBr이 CoA의 티올과 반응하기 위해 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양합니다.2시간 후, 아세트산 100마이크로리터를 넣고 10초 동안 소용돌이하여 반응을 멈춥시다. 튜브의 강수량 은 형성됩니다. 다음으로 원심분리기는 2, 000배 g에서 15분간.침전된 세포 이물질을 제거하려면, 고체 위상 추출 컬럼 청소를 위해 유리 시험관에 상체물을 이송하고 저장한다. 분석을 시작하기 전에, 로터 -stator 균질화로 프로브와 조직 중단의 삽입을 위해 설계된 유리 테스트 튜브에 1 밀리머 칼륨 수산화칼륨의 두 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.냉동 조직 조각을 빠르게 계량하고 각 샘플에 대한 젖은 무게를 기록합니다. 조직을 유리 튜브로 옮기고 조직을 30초 동안 균질화합니다. 조직의 완전한 해동을 피하십시오.수산화 칼륨 0.25-마이크로리터 500개추가. 10 초 동안 높은 소용돌이, 얼음에 유지. 이것은 총 CoA를 산출하기 위하여 CoA 티오에스테르를 가수분해하기 위하여 위의 견본의 pH를 12를 가져옵니다.파라핀 필름으로 튜브를 덮습니다. 배양 된 세포의 준비와 조직의 준비는이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. CoA 분해를 방지하기 위해 수산화 칼륨을 신속하게 추가하는 것이 중요합니다.수조에서 2시간 동안 55도의 시료를 배양하여 가수분해를 지원합니다. 그런 다음, 1-m-mBBr 150 마이크로리터와 100밀리머 mBBr의 마이크로리터를 추가하여 무료 CoA로 mBBr 반응을 지원하기 위해 pH를 약 8개에 넣습니다. 10 초 동안 높은 소용돌이.파라핀 필름으로 튜브를 덮고 모든 CoA가 mBBr으로 파생되도록 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양합니다. 그 후, 아세트산의 100 마이크로 리터를 추가하고, 반응을 중지10 초 동안 높은 에 소용돌이. 원심분리기는 15분 동안 2, 000배 g에서 침전된 세포 이물질을 펠릿하고, 상체를 유리 시험관으로 이송하여 고체 상 추출 컬럼 을 정화한다.실온에서, 각 1밀리리터 일회용 2-2-pyridyl-ethyl 실리카 젤 컬럼을 1밀리리터의 세척 버퍼로 평형하여 피리딜 기능성 그룹이 양성되고 음이온 교환기로 작동하도록 합니다. 그런 다음 샘플 상체를 기둥에 피펫하고 용액을 수집합니다. 세탁 버퍼 1밀리리터로 컬럼을 두 번 씻고, 한 번은 1밀리리터의 물로 씻어 유지되지 않은 종을 제거합니다.다음으로, 별도의 유리 테스트 튜브로, CoA-bimane을 수집하기 위해 용출 버퍼 1 밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. 질소 가스 하에서 튜브에서 CoA-bimane 샘플을 건조시. 밀봉하고 튜브를 완전히 덮고 영하 20도에 보관하십시오.HPLC 분석을 위해 준비되면 300 마이크로리터의 물에서 샘플을 다시 중단하고 10초 동안 높은 에서 소용돌이를 통해 적극적으로 섞습니다. 리펜시프튜브 필터로 재중단된 샘플을 옮기고, 원심분리기를 10분 동안 5, 000배 g에서 전달하여 침전제를 제거합니다. 이어서, 여과된 시료를 HPLC 주입에 적합한 유리 유리 바이알로 이송한다.이 연구에서는 대표적인 HPLC 프로파일이 C18 HPLC 열에서 CoA-bimane 표준의 보존 시간을 보여줍니다. CoA-bimane 표준의 증가양은 개별적으로 주입되었고, CoA-bimane 크로마토그램의 피크 아래 영역은 입력 CoA-bimane의 함수로 플롯되었다. 표준 곡선은 393 나노미터의 파장에서 CoA-bimane의 흡광도의 크기를 반영했다.CoA-bimane의 형광은 또한 393 나노미터의 내분 파장 및 470 나노미터의 방출 파장에 반영되었다. 마우스 간 또는 인간 배양 C3A 세포에 대한 후속 HPLC 분리 및 전형적인 검출 프로파일은 용출 프로그램을 사용하여 11 분에서 12 분 사이의 유지 시간으로 빨간색 피크로 여기에 표시됩니다. mBBr과의 반응이 검출 가능한 결과를 산출하지 않으면, Trizma-HCl의 양은 pH를 약 8으로 낮추기 위해 조정되어야 할 수도 있다.비마네 유도체로서 설피드릴 또는 티오에스테르 모이티를 함유하는 추가 세포 분자를 검출할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-비마네는 HPLC 방법으로 검출될 수 있다. 이 기술은 그밖 연구원이 타입-2 당뇨병의 동물 모형과 같은 신진 대사 불균형과 관련되었던 CoA 기능 장애의 잠재적인 역할을 조사하는 것을 허용할 것입니다.연구원은 고체 상 추출에 사용되는 유기 용매로 작업 할 때 개인 보호 장비를 사용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

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RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

연구

생화학

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

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향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

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세포 외 포도당 고갈은 세포 및 조직 Ex vivo 에서 포도당 흡수의 간접적 인 척도로서

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...