Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
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Os autores reconhecem o financiamento para a pesquisa patrocinada fornecida pela CoA Therapeutics, Inc., uma subsidiária da BridgeBio LLC, a concessão nacional dos institutos de saúde GM34496, e as instituições de caridade associadas sírias americanas libanesas.

O procedimento animal referido neste protocolo foi realizado de acordo com os protocolos 323 e 556 e especificamente aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais do hospital de pesquisa infantil St. Jude.
1. preparação de soluções
Nota: Use água ultrapura para todas as soluções e quando indicado nos procedimentos.
<ol><li>Prepare 1 mM de hidróxido de potássio (KOH) em água.</li>
	<li>Prepare 0,25 M KOH na água.</li>
	<li>Prepare 1 M...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Aqui nós demonstramos um procedimento de confiança, passo a passo para quantificar o CoA total nas pilhas e nos tecidos animais com uma escala larga da deteção linear que seja acessível em muitos laboratórios que têm um HPLC com uma absorvência ou um detector da saída da fluorescência. Alternativamente, a espectrometria de massas é uma técnica comum para a avaliação de tioésteres de CoA e CoA, mas não está amplamente disponível devido ao custo da instrumentação e ao conhecimento especializado exigido ...

Coenzima A (COA) é um cofator essencial em todos os organismos vivos e é sintetizada a partir de ácido pantotênico, também chamado pantotenato (o sal do ácido pantotênico) ou vitamina B5. O CoA é o principal portador intracelular de ácidos orgânicos, incluindo ácidos de cadeia curta, como acetato e succinato, ácidos de cadeia ramificada, como propionato e metilmalonato, ácidos graxos de cadeia longa, como palmitato e oleato, ácidos graxos de cadeia muito longa, como ácidos graxos poliinsaturados e xenobióticos, como o ácido valproico. O ácido orgânico dá forma a um enlace do Tioéster enzymaticamente com o COA para permitir seu uso como um substrato em mais de 100 reações no metabolismo intermediário1. Os tioésteres de COA são também reguladores alostérico e activators transcricional. É apreciado agora2 que a fonte total celular do COA é regulada3,4; assim, a disponibilidade de CoA pode ser limitante, e que as deficiências de CoA podem ser catastróficas, como exemplificada por desordens genéticas herdadas que impactam o biossynthesis5do COA. A quinase de pantothenate catalisa a primeira etapa na biossíntese de CoA (Figura 1) e a neurodegeneração associada Pantothenate da quinase, chamada pkan, é causada por mutações no gene PANK2 6. A enzima CoA sintase, codificada pelo gene Coasyn , catalisa os dois últimos passos na biossíntese de COA (Figura 1) e a neurodegeneração associada à proteína Coasy, denominada Copan, é causada por uma mutação no gene da coasyn 7. Ambos pkan e Copan são doenças neurodegenerativas herdadas associadas com a acumulação do ferro nas deficiências do cérebro e do COA Underly as patologias da doença.
Os níveis celulares do CoA total variam entre os tecidos8 e o COA total pode aumentar ou diminuir uma variedade de Estados fisiológicos, patológicos e farmacológicos. O CoA do fígado aumenta durante o switching do combustível do FED ao estado jejuado9, e os níveis do COA do fígado são anormalmente elevados em ratos obesos leptin-deficientes10. O CoA do fígado diminui em resposta à ingestão crônica do etanol11. Os níveis do CoA do cérebro no modelo do rato do Knockout Pank2 são deprimidos durante o período perinatal, mas mais tarde no índice adulto do COA do cérebro do estágio são equivalentes aos níveis do selvagem-tipo, indicando uma resposta adaptativa do COA durante o desenvolvimento12. A manipulação do conteúdo de COA tecidual por métodos de transgênese ou de entrega gênica impacta as funções metabólicas e neurais13,14,15. O desenvolvimento pré-clínico de terapias potenciais para pkan ou Copan inclui medidas da célula ou do tecido COA como indicadores da eficácia16,17,18,19,20 . A avaliação de todas estas condições e suas conseqüências metabólicas ou funcionais exige um método quantitativo para a medida do CoA total.
Um ensaio preciso e fiável para a medição de CoA em amostras biológicas é um desafio técnico em muitos laboratórios. Infelizmente, não há sondas disponíveis para avaliar ou quantificar tioésteres de COA ou CoA em células intactas, embora os análogos de tioésteres de CoA natural tenham sido amplamente utilizados como sondas mecanísticas em estudos de éster CoA utilizando enzimas21. A conversão do COA, com uma fração livre do sulfidrila (-SH), a um Tioéster de COA (ou reciprocamente) é rápida nas pilhas ou nos tecidos animais durante a transferência a um ambiente diferente e durante o lysis da pilha. Numerosas sinthetases de acilo-CoA e tioesterases de acilo-CoA nas células mediam as interconversões dentro da piscina CoA, e enzimas adicionais que utilizam tioésteres de CoA como substratos permanecem ativas em amostras biológicas até serem extinto por substâncias químicas ou físicas Significa. O off-loading de Acyl-grupos do COA à carnitina por Acyl-transferases é um exemplo dentro da rede das reações que podem alterar a distribuição do Tioéster de COA/COA. Os traçadores radioativos podem ser usados para medir as taxas de síntese de CoA nas células. Os métodos atuais para a medição de derivados de CoA e CoA em amostras biológicas foram revisados22 e incluem ensaios espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografia líquida de alta pressão e procedimentos baseados em espectrometria de massas. Entretanto, estes métodos são centrados frequentemente em espécies moleculars específicas do CoA e são cegos à variação da associação total do CoA. Os ensaios enzimáticos acoplados geralmente exigem maiores quantidades de material de entrada devido a baixas sensibilidades de detecção e têm uma faixa limitada de linearidade.
Nosso laboratório desenvolveu um procedimento de confiança para a quantificação do CoA total em pilhas cultivadas e em tecidos animais. A estratégia inclui a hidrólise de todos os tioésteres de COA para render somente o COA livre durante a preparação da amostra, um pouco do que fazendo esforços para manter e analisar o espectro inteiro de espécies de COA. O procedimento é uma compilação de métodos publicados individuais para a preparação da amostra, a derivação do COA, a purificação e a identificação depois da cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), e a quantificação do COA derivatizado pela absorvência ou detecção de fluorescência23,24,25. As determinações do CoA obtidas usando este procedimento permitiram nossa compreensão da regulação do CoA e o desenvolvimento de uma aproximação terapêutica para o tratamento de deficiências de CoA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

A pesquisa emergente revelou que a fonte celular da coenzima A (CoA) pode tornar-se limitando com um impacto prejudicial no crescimento, no metabolismo e na sobrevivência. A medida do COA celular é um desafio devido a sua abundância relativamente baixa e à conversão dinâmica de COA livre aos tioésteres de COA que, por sua vez, participam em reações metabólicas numerosas. Um método é descrito que navega através das armadilhas potenciais durante a preparação da amostra para render um ensaio com uma escala linear larga da deteção que seja apropriada para o uso em muitos laboratórios biomédicos.

Um método relativamente rápido e de confiança para a deteção do COA total em pilhas e em tecidos cultivados foi desenvolvido derivatização o tiol do COA a um agente fluorescente usando o mbbr, e então purificante o COA-bimane derivatizado usando a HPLC da fase reversa. Uma curva padrão é gerada pela primeira vez, onde as quantidades conhecidas e crescentes da norma CoA-bimana são injetadas individualmente e as áreas os picos dos cromatogramas CoA-bimane são plotadas em função da entrada CoA-bimana (<strong...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Este método descreve a preparação da amostra de células cultivadas e tecidos animais, extração e derivatização da coenzima A nas amostras, seguida de cromatografia líquida de alta pressão para purificação e quantificação da coenzima a derivatizada por absorvância ou detecção de fluorescência.

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

A coenzima A, chamada CoA para abreviar, é um importante cofator no metabolismo celular. Medições quantitativas revelam alterações que acontecem com estados nutricionais e hormonais em modelos animais. Este método quantifica a quantidade total de CoA celular, incluindo derivados de CoA e CoA gratuito, em um método simples e confiável.Vários tipos de neurodegeneração com acúmulo de ferro cerebral estão associados a mutações nos genes da via biossintética coa. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema biológico, uma vez que todos os organismos requerem CoA para sobrevivência, crescimento e função. Um pesquisador iniciante pode lutar com os primeiros passos na preparação da amostra, onde é importante manter as amostras absolutamente frias e, em seguida, transferi-las rapidamente para hidróxido de potássio.Limitar o número de amostras em um lote antes da transferência para hidróxido de potássio e praticar com a transferência antes de trabalhar com as amostras experimentais. Muitos pesquisadores não estão familiarizados com a extração em fase sólida na preparação de amostras biológicas para análise bioquímica posterior. Para começar, incubar pratos de cultura triplicada em paralelo, dois para análise bioquímica e um para determinação de número celular viável.Quando a cultura se aproxima das densidades subconfluentes tardias, por exemplo, as células HepG2/C3A humanas cresceram a uma densidade de seis a oito vezes 10 para as seis ou hek 293T cultivadas a uma densidade de cerca de 1,3 vezes 10 a sete por prato de 100 milímetros, colher as células aderentes na cultura. Em seguida, adicione um mililitro de água gelada ao mesmo prato de cultura. Raspe as células na água fria do prato, e transfira a suspensão celular para um tubo de ensaio de vidro contendo 400 microliters de hidróxido de potássio de 0,25-molar e 1,5 mililitros de água para trazer o pH acima de 12.Misture a suspensão vigorosamente por vórtice em alta por 10 segundos. Em seguida, cubra firmemente com filme de parafina, e incubar a 55 graus Celsius por uma hora sem tremer em um banho de água. Em seguida, adicione 160 microliters de solução trizma-cloridrato de um molar e 10 microliters de 100 mililitros mBBr.Misture por vórtice no alto por 10 segundos. Isso leva o pH a aproximadamente oito para suportar a reação mBBr com CoA gratuito. Cubra o tubo com filme de parafina, e incubar as amostras à temperatura ambiente por duas horas no escuro para que o mBBr reaja com o tiol de CoA.Depois de duas horas, adicione 100 microliters de ácido acético, e misture por vórtice por 10 segundos para parar a reação. Uma precipitação se forma no tubo. Em seguida, centrífuga a 2.000 vezes g por 15 minutos.Para remover os detritos celulares precipitados, transfira e salve o sobrenante em um tubo de teste de vidro para a limpeza da coluna de extração em fase sólida. Antes de iniciar a análise, adicione dois mililitros de hidróxido de potássio de um milimão a um tubo de teste de vidro projetado para inserção de uma sonda e ruptura tecidual com um homogeneizador rotor-estetor. Mantenha o tubo no gelo até usar.Pesar os pedaços de tecido congelado rapidamente, e registrar o peso molhado para cada amostra. Transfira o tecido para o tubo de vidro e homogeneize o tecido por 30 segundos. Evite o degelo completo do tecido.Adicione 500 microliters de hidróxido de potássio de 0,25 molar. Vórtice no alto por 10 segundos, e mantenha no gelo. Isso traz o pH da amostra acima de 12 para hidrolisar os tioestres coa para produzir CoA total.Cubra o tubo com filme de parafina. A preparação de células cultivadas e a preparação dos tecidos são os passos mais críticos neste procedimento. É importante adicionar hidróxido de potássio elevado rapidamente para evitar a degradação do CoA.Incubar as amostras a 55 graus Celsius por duas horas em um banho de água sem tremer para suportar a hidrólise. Em seguida, adicione 150 microliters de um molar Trizma-cloridrato e 10 microliters de 100 milimil mBBr para trazer o pH para cerca de oito para suportar a reação mBBr com CoA livre. Vórtice no alto por 10 segundos.Cubra o tubo com filme de parafina e incuba as amostras à temperatura ambiente por duas horas no escuro para garantir que todo o CoA seja derivado com mBBr. Depois disso, adicione 100 microliters de ácido acético, e vórtice no alto por 10 segundos para parar a reação. Centrífuga a 2.000 vezes g por 15 minutos para pelotas detritos celulares precipitados, e transfira o supernasal em um tubo de teste de vidro para a limpeza da coluna de extração em fase sólida.À temperatura ambiente, equilibre cada mililitro descartável 2-2-piridyl-coluna de gel de sílica etil com um mililitro de tampão de lavagem para garantir que o grupo funcional piridilo seja protoado e funcione como um trocador de ânion. Em seguida, pipete a amostra sobrenatante na coluna, e coletar o elunato. Lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem e uma vez com um mililitro de água para remover qualquer espécie não retida.Em seguida, em um tubo de ensaio de vidro separado, lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão de elução para coletar o CoA-bimane. Seque a amostra de CoA-bimane no tubo sob gás nitrogênio. Veda, cubra completamente o tubo, e armazene a menos 20 graus Celsius.Quando estiver pronto para a análise do HPLC, resuspenja a amostra em 300 microliters de água e misture vigorosamente com vórtice no alto por 10 segundos. Transfira a amostra resuspended para um filtro de tubo de centrífuga e centrífuga a 5.000 vezes g por 10 minutos para remover qualquer precipitante. Em seguida, transfira a amostra filtrada para um frasco de vidro adequado para injeção HPLC.Neste estudo, um perfil hplc representativo mostra o tempo de retenção do padrão CoA-bimane na coluna C18 HPLC. Quantidades crescentes do padrão CoA-bimane foram injetadas individualmente, e as áreas sob os picos nos cromatógrafos CoA-bimane foram plotadas em função da entrada CoA-bimane. A curva padrão refletiu a magnitude da absorção de CoA-bimane em um comprimento de onda de 393 nanômetros.A fluorescência do CoA-bimane também foi refletida no comprimento de onda de excitação de 393 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 470 nanômetros. A separação subsequente do HPLC e os perfis típicos de detecção para fígado de rato ou células C3A cultivadas humanas são indicados aqui por picos vermelhos, com um tempo de retenção entre 11 e 12 minutos usando o programa de elução. Se a reação com o mBBr não produzir resultados detectáveis, a quantidade de Trizma-HCl pode precisar ser ajustada para reduzir o pH para aproximadamente oito.É possível detectar moléculas celulares adicionais que contenham moieties de sulfhydryl ou tioester como derivados de bimane. Por exemplo, glutationo-bimane pode ser detectado com o método HPLC. Essa técnica permitirá que outros pesquisadores investiguem o papel potencial da disfunção do CoA associada ao desequilíbrio metabólico, como modelos animais de diabetes tipo 2.Os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual ao trabalhar com solventes orgânicos usados para a extração em fase sólida.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic factors affecting glucose uptake. The measurement of intracellular fluorescence is a widely used method to test the uptake of fluorescently-labeled glucose (FD-glucose) in cells in vitro, or for imaging glucose-consuming tissues in vivo. This assay assesses glucose uptake at a chosen time point. The intracellular analysis assumes that the metabolism of FD-glucose is slower than that of endogenous glucose, which participates in catabolic and anabolic reactions and signaling. However, dynamic glucose metabolism also alters uptake mechanisms, which would require kinetic measurements of glucose uptake in response to different factors. This article describes a method for measuring extracellular FD-glucose depletion and validates its correlation with intracellular FD-glucose uptake in cells and tissues ex vivo. Extracellular glucose depletion may be potentially applicable for high-throughput kinetic and dose-dependent studies, as well as identifying compounds with glycemic activity and their tissue-specific effects.

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular depletion of fluorescently labeled glucose correlates with glucose uptake and could be used for high-throughput screening of glucose uptake in excised organs and cell cultures.

Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Quantificação de alto rendimento da síntese e distribuição de mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autor em destaque: Quantificação baseada em imagem de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...