Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Авторы признают финансирование спонсируемых исследований, предоставляемых CoA Therapeutics, Inc., дочерней компанией BridgeBio LLC, Грантом Национальных институтов здравоохранения GM34496 и американскими ливанскими сирийскими благотворительными организациями.

Процедура животных, упомянутая в этом протоколе, была выполнена в соответствии с протоколами 323 и 556 и специально одобрена Комитетом по институциональному уходу и использованию животных в Санкт-Джудской детской больнице.
1. Подготовка решений
ПРИМЕЧАНИЕ: Ис...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Здесь мы демонстрируем надежную, пошаговую процедуру количественной оценки общего КоАП в клетках и тканях животных с широким спектром линейного обнаружения, который доступен во многих лабораториях, которые имеют HPLC с либо абсорбцией или флуоресценции выходного детектора. Кроме того, ...

Коэнзим А (CoA) является незаменимым кофактором во всех живых организмах и синтезируется из пантотеновой кислоты, также называемой пантотенатом (соль пантотеновой кислоты) или витамина В5. КоА является основным внутриклеточным носителем органических кислот, включая короткоцепочечные кислоты, такие как ацетат и суччатый, ветвяные кислоты, такие как пропионат и метилмалонат, длинноцепочечные жирные кислоты, такие как пальмитат и олеат, очень длинноцепочечные жирные кислоты, такие как полиненасыщенные жирные кислоты и ксенобиотики, такие как вальпроевая кислота. Органическая кислота образует тиоэстер связи ферментативно с КоАп, чтобы его использование в качестве субстрата в более чем 100 реакций в промежуточныхметаболизм1. CoA thioesters также аллостерические регуляторы и транскрипционные активаторы. В настоящее времяоценили 2, что сотовый общий объем поставок КоАП регулируется3,4; таким образом, доступность КоАп может быть ограничена, и что недостатки КоАП могут быть катастрофическими, о чем служат наследственные генетические расстройства, которые влияют на биосинтез CoA5. Пантотенат киназы катализирует первый шаг в биосинтезе CoA (Рисунок 1) и Pantothenate Киназы Ассоциированные нейродегенерации, называется PKAN, вызвано мутациями в гене PANK2 6. CoA synthase, кодируется геном COASYN, катализирует последние два шага в биосинтезе CoA(Рисунок 1)и COASY Protein-Associated Neurodegeneration, называемой CoPAN, вызвана мутацией в гене COASYN 7. Оба PKAN и CoPAN являются наследственные нейродегенеративные заболевания, связанные с накоплением железа в головном мозге и Недостатки КоАП недостаточно патологии болезни.
Клеточные уровни общего КоА варьируются между тканями8 и общего КоА может увеличиваться или уменьшаться при различных физиологических, патологических и фармакологических состояний. Печень Коа увеличивается во время переключения топлива из корма в постное состояние9, и печени CoA уровни аномально высока в лептин-дефицитных тучных мышей10. Печень КоА уменьшается в ответ на хроническое проглатывание этанола11. Мозг CoA уровни в модели Pank2 нокаут мыши депрессии в течение перинатального периода, но позже на взрослой стадии мозга содержание мозга CoA эквивалентно диким типа уровней, что свидетельствует о адаптивной реакции КоАп во время развития12. Манипуляция содержанием коэнзии с помощью трансгенеза или методов доставки генов влияет на метаболические и нервные функции13,14,15. Доклиническое развитие потенциальных методов лечения PKAN или CoPAN включает измерения КоАп клеток или тканей в качестве показателей эффективности16,17,18,19,20 . Оценка всех этих состояний и их метаболических или функциональных последствий требует количественного метода измерения общего КоАп.
Точный, надежный анализ для измерения КоАп в биологических образцах является технической проблемой во многих лабораториях. К сожалению, Есть нет зондов, доступных для оценки или количественно CoA или CoA thioesters в нетронутых клеток, хотя аналоги природных CoA тиесты были широко использованы в качестве механистических зондов в исследованиях CoA эфира с использованием ферментов21. Преобразование КоАп, с помощью свободного сульфидрила (-SH) муэти, в коап thioester (или наоборот) является быстрым в клетках или тканях животных во время передачи в другую среду и во время лизиса клеток. Многочисленные синтезаторы acyl-CoA и ацил-КоА тиостасесы в клетках посредничают интерконверсии в пуле КоАП, а также дополнительные ферменты, которые используют коап тиестеры в качестве субстратов, остаются активными в биологических образцах до утопленного химическими или физическими Означает. Разгрузка ацил-групп от КоАп до карнитина ацил-трансферазами является одним из примеров в рамках сети реакций, которые могут изменить распределение тиоэстера CoA/CoA. Радиоактивные трассы могут быть использованы для измерения темпов синтеза КоАП в клетках. Текущие методы измерения производных КоАп и КоА в биологических образцах были рассмотрены22 и включают в себя соединенные энзиматические спектромеметрические анализы, жидкой хроматографии высокого давления и процедуры, основанные на масс-спектрометрии. Тем не менее, эти методы часто сосредоточены на конкретных молекулярных видов КоАП и слепы к изменению общего пула КоАП. Соединенные ферментативные анализы обычно требуют большего количества входного материала из-за низкой чувствительности обнаружения и имеют ограниченный диапазон линейности.
Наша лаборатория разработала надежную процедуру количественной оценки общего объема КоАП в культивированных клетках и тканях животных. Стратегия включает в себя гидролиз всех КоАП тиоэстеров, чтобы дать только бесплатно CoA во время подготовки образцов, а не прилагать усилия для поддержания и анализа всего спектра видов КоАП. Процедура представляет собой компиляцию отдельных опубликованных методов подготовки образцов, деиватации КоА, очистки и идентификации после жидкой хроматографии высокого давления (HPLC), а также количественной оценки производного КоА путем абсорбции или флуоресценция23,24,25. Определения КоАП, полученные с помощью этой процедуры, позволили нам понять регулирование КоАП и разработку терапевтического подхода к лечению недостатков КоАП.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

Новые исследования показали, что клеточный коэнзим A (CoA) питания может стать ограниченным с пагубным воздействием на рост, обмен веществ и выживание. Измерение клеточного КоАп является сложной задачей из-за его относительно низкого изобилия и динамического преобразования свободного КоАП в КоАП, которые, в свою очередь, участвуют в многочисленных метаболических реакциях. Описан метод, который проходит через потенциальные ловушки во время подготовки образца, чтобы дать анализ с широким линейным диапазоном обнаружения, который подходит для использования во многих биомедицинских лабораториях.

Относительно быстрый и надежный метод для обнаружения общего КоАп в культивированных клетках и тканях был разработан путем произвождения тиола КоАП к флуоресцентному агенту с использованием mBBr, а затем очищения производной КоА-биман с использованием обратной фазы HPLC. Сначала генерир...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Этот метод описывает подготовку образца из культивированных клеток и тканей животных, экстракции и произвлечения коэнзима А в образцах, а затем жидкой хроматографии высокого давления для очистки и количественной оценки производного коэнзима А абсорбции или обнаружения флуоресценции.

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Коэнзим А, называемый CoA для краткости, является важным кофактором в клеточном метаболизме. Количественные измерения показывают изменения, которые происходят с питательными и гормональными состояниями в животных моделях. Этот метод количественно общее количество сотовых CoA, в том числе производных CoA и бесплатно CoA, в простой, надежный метод.Несколько типов нейродегенерации с накоплением железа мозга связаны с мутациями в генах биосинтетических путей КоА. Этот метод может быть применен к любой биологической системе, так как все организмы требуют CoA для выживания, роста и функции. Впервые исследователь может бороться с первыми шагами в подготовке образца, где важно держать образцы абсолютно холодными, а затем быстро передавать их гидроксиду калия.Ограничьте количество образцов в партии перед переходом на гидроксид калия и попрактикуйтесь в передаче перед работой с экспериментальными образцами. Многие исследователи не знакомятся с твердой фазой экстракции при подготовке биологических образцов для более поздних биохимических анализов. Для начала инкубировать тройной культуры блюда параллельно, два для биохимического анализа и один для определения жизнеспособного числа клеток.Когда культура приближается к поздней плотности субвлияния, например, человеческие клетки HepG2/C3A выросли до плотности от шести до восьми раз от шести до шести или HEK 293T клеток, выращенных с плотностью около 1,3 раза от 10 до семи на 100-миллиметровую тарелку, урожай приверженцев клеток в культуре. Затем добавьте один миллилитр ледяной воды в одно и то же культурное блюдо. Очистите клетки в холодную воду в тарелке, и передать клеточной подвески в стеклянной пробирке, содержащей 400 микролитров 0,25-молярного гидроксида калия и 1,5 миллилитров воды, чтобы принести рН выше 12.Смешайте подвеску энергично вихрем на высоком в течение 10 секунд. Затем плотно накройте парафиновой пленкой и инкубировать при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа, не встряхивая в водяной бане. Затем добавьте 160 микролитров раствора одномолярной тризмы-гидрохлорида и 10 микролитров 100-миллимолярной мББр.Смешайте вихрем на высоком в течение 10 секунд. Это приводит рН примерно до восьми для поддержки реакции mBBr со свободным CoA. Обложка трубки с парафиновой пленкой, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов в темноте для mBBr реагировать с тиолом CoA.Через два часа добавьте 100 микролитров уксусной кислоты и перемешайте вихрем в течение 10 секунд, чтобы остановить реакцию. В трубке образуется осадк. Далее, центрифуга на 2000 раз г в течение 15 минут.Чтобы удалить осажденный клеточный мусор, перенесите и сохраните супернатант в стеклянную пробирку для очистки столба извлечения твердой фазы. Перед началом анализа добавьте два миллилитров гидроксида калия в стеклянную пробирку, предназначенную для вставки зонда и разрушения тканей с помощью гомогенизатора ротора-статора. Держите трубку на льду до использования.Взвесить замороженные части ткани быстро, и записывать мокрый вес для каждого образца. Перенесите ткань в стеклянную трубку и гомогенизируйте ткань в течение 30 секунд. Избегайте полного оттаивания тканей.Добавьте 500 микролитров 0,25-молярного гидроксида калия. Вихрь на высоте в течение 10 секунд, и держать на льду. Это приносит рН образца выше 12 для гидролиза CoA thioesters для того чтобы дать полный CoA.Обложка трубки с парафиновой пленкой. Подготовка культурных клеток и подготовка тканей являются наиболее важными шагами в этой процедуре. Важно, чтобы добавить высокий гидроксид калия быстро, чтобы предотвратить деградацию КоА.Инкубировать образцы при 55 градусах по Цельсию в течение двух часов в водяной бане без тряски для поддержки гидролиза. Затем добавьте 150 микролитров одномолярного тризмы-гидрохлорида и 10 микролитров 100-миллимолярной мББр, чтобы довести рН примерно до восьми для поддержки реакции mBBr со свободным CoA. Вихрь на высоте в течение 10 секунд.Обложка трубки с парафиновой пленкой, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов в темноте, чтобы обеспечить все CoA является производным с mBBr. После этого добавьте 100 микролитров уксусной кислоты и вихрь на высоком уровне в течение 10 секунд, чтобы остановить реакцию. Центрифуга в 2000 раз г в течение 15 минут, чтобы гранулы осаждается клеточного мусора, и передачи супернатанта в стеклянную пробирку для твердой фазы извлечения столба очистки.При комнатной температуре, равномерный каждый один миллилитр одноразовые 2-2-пиридил-этиловый кремнезем гель колонки с одним миллилитров мыть буфера для обеспечения того, чтобы пиридил функциональной группы протонируется и будет функционировать как обменник аниона. Затем, пипетка образца supernatant на колонку, и собирать eluate. Вымойте столбец дважды с одним миллилитров мыть буфера и один раз с одним миллилитром воды, чтобы удалить любые неустановимые виды.Затем, в отдельную стеклянную пробирку, мыть колонку дважды с одним миллилитров элюционного буфера для сбора CoA-bimane. Высушите образец CoA-bimane в трубке под азотным газом. Печать, полностью покрыть трубку, и хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Когда он будет готов к анализу HPLC, повторно посвястите образец в 300 микролитров воды и энергично смешивайте вихрем на максимуме в течение 10 секунд. Перенесите распровоцированный образец в центрифугный трубчатый фильтр и центрифугу при 5 000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадк. Затем перенесите отфильтрованный образец на стеклянный флакон, пригодный для инъекций HPLC.В этом исследовании репрезентативный профиль HPLC показывает время хранения стандарта CoA-bimane в столбце C18 HPLC. Все большее количество стандарта CoA-bimane вводилось индивидуально, и области под пиками в хроматограммах CoA-bimane были построены как функция входного CoA-bimane. Стандартная кривая отражала величину поглощения КоА-бимана на длине волны 393 нанометров.Флуоресценция КоА-бимана также отразилась на возбудительной длине волны 393 нанометров и длине волны выбросов 470 нанометров. Последующее разделение HPLC и типичные профили обнаружения для печени мыши или человеческих культурных клеток C3A показаны здесь красными пиками, с временем удержания от 11 до 12 минут с помощью программы elution. Если реакция с mBBr не дает обнаруживаемых результатов, количество Trizma-HCl, возможно, потребуется настроить, чтобы снизить рН примерно до восьми.Можно обнаружить дополнительные клеточные молекулы, которые содержат сульфгидрил или тиоэстер moieties как биман производные. Например, глутатион-биман можно обнаружить методом HPLC. Этот метод позволит другим исследователям исследовать потенциальную роль дисфункции CoA связанной с метаболическим дисбалансом, such as животные модели мочеизнурения типа 2.Исследователи должны использовать средства индивидуальной защиты при работе с органическими растворителями, используемыми для извлечения твердой фазы.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic factors affecting glucose uptake. The measurement of intracellular fluorescence is a widely used method to test the uptake of fluorescently-labeled glucose (FD-glucose) in cells in vitro, or for imaging glucose-consuming tissues in vivo. This assay assesses glucose uptake at a chosen time point. The intracellular analysis assumes that the metabolism of FD-glucose is slower than that of endogenous glucose, which participates in catabolic and anabolic reactions and signaling. However, dynamic glucose metabolism also alters uptake mechanisms, which would require kinetic measurements of glucose uptake in response to different factors. This article describes a method for measuring extracellular FD-glucose depletion and validates its correlation with intracellular FD-glucose uptake in cells and tissues ex vivo. Extracellular glucose depletion may be potentially applicable for high-throughput kinetic and dose-dependent studies, as well as identifying compounds with glycemic activity and their tissue-specific effects.

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular depletion of fluorescently labeled glucose correlates with glucose uptake and could be used for high-throughput screening of glucose uptake in excised organs and cell cultures.

Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения мтДНК

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

В центре внимания автора: Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...