Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
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Los autores reconocen la financiación para la investigación patrocinada proporcionada por CoA Therapeutics, Inc., una subsidiaria de BridgeBio LLC, la subvención de los Institutos Nacionales de Salud GM34496, y las Organizaciones Benéficas Asociadas Sirias Libanesas Estadounidenses.

El procedimiento animal mencionado en este protocolo se realizó de acuerdo con los protocolos 323 y 556 y fue aprobado específicamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Investigación Infantil de St. Jude.
1. Preparación de soluciones
NOTA: Utilice agua ultrapura para todas las soluciones y cuando se indique en los procedimientos.
<ol><li>Preparar 1 mM de hidróxido de potasio (KOH) en agua.</li>
	<li>Preparar 0,25 M KOH ...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Aquí demostramos un procedimiento fiable, paso a paso para cuantificar el CoA total en células y tejidos animales con una amplia gama de detección lineal que es accesible en muchos laboratorios que tienen un HPLC con un detector de salida de absorbancia o fluorescencia. Alternativamente, la espectrometría de masas es una técnica común para evaluar los tioesters de CoA y CoA, pero no está ampliamente disponible debido al costo de la instrumentación y los conocimientos especializados necesarios para el desarrollo d...

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgánico forma un enlace tioésico enzimáticamente con CoA para permitir su uso como sustrato en más de 100 reacciones en el metabolismo intermediario1. Los tióreros de CoA también son reguladores alostéricos y activadores transcripcionales. Ahora se aprecia2 que el suministro de CoA total celular está regulado3,4; por lo tanto, la disponibilidad de CoA puede ser limitante, y que las deficiencias de CoA pueden ser catastróficas, como lo ejemplifican los trastornos genéticos hereditarios que afectan la biosíntesis de CoA5. La pantotenato quinasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Pantotenato Kinasa, llamada PKAN, es causada por mutaciones en el gen PANK2 6. La coA sintasa, codificada por el gen COASYN, cataliza los dos últimos pasos de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Proteína COASY, llamada CoPAN, es causada por una mutación en el gen COASYN 7. Tanto PKAN como CoPAN son enfermedades neurodegenerativas hereditarias asociadas con la acumulación de hierro en el cerebro y las deficiencias de CoA subyacentes a las patologías de la enfermedad.
Los niveles celulares de CoA total varían entre los tejidos8 y el CoA total puede aumentar o disminuir bajo una variedad de estados fisiológicos, patológicos y farmacológicos. El coA hepático aumenta durante el cambio de combustible de la alimentada al estado de ayuno9, y los niveles de CoA hepático son anormalmente altos en ratones obesos con deficiencia de leptina10. El coA hepático disminuye en respuesta a la ingestión crónica de etanol11. Los niveles de CoA cerebral en el modelo de ratón Nocaut Pank2 están deprimidos durante el período perinatal, pero más tarde en la etapa adulta el contenido de CoA del cerebro es equivalente a los niveles de tipo salvaje, lo que indica una respuesta de CoA adaptable durante el desarrollo12. La manipulación del contenido de coA tisular por transgénesis o métodos de administración de genes afecta a las funciones metabólicas y neuronales13,14,15. El desarrollo preclínico de posibles terapias para PKAN o CoPAN incluye mediciones de CoA celular o tisular como indicadores de eficacia16,17,18,19,20 . La evaluación de todas estas condiciones y sus consecuencias metabólicas o funcionales requiere un método cuantitativo para la medición del CoA total.
Un ensayo preciso y fiable para medir el CoA en muestras biológicas es un desafío técnico en muchos laboratorios. Desafortunadamente, no hay sondas disponibles para evaluar o cuantificar tioesters de CoA o CoA en células intactas, aunque los análogos de los tioesters coA naturales se han utilizado ampliamente como sondas mecanicistas en estudios de éster CoA utilizando enzimas21. La conversión de CoA, con una mitad libre de sulfhidilo (-SH), a un tioester de CoA (o viceversa) es rápida en las células o tejidos animales durante la transferencia a un ambiente diferente y durante la lisis celular. Numerosas acomodatinosas y tilatirasas ayl-CoA en células median las interconversiones dentro de la piscina de CoA, y enzimas adicionales que utilizan tióreros de CoA como sustratos permanecen activos en muestras biológicas hasta que son apagones por sustanciaquímica o física Significa. La descarga de grupos de acil de CoA a carnitina por acil-transferasas es un ejemplo dentro de la red de reacciones que pueden alterar la distribución del tioester CoA/CoA. Los trazadores radiactivos se pueden utilizar para medir las tasas de síntesis de CoA en las células. Los métodos actuales para medir los derivados de CoA y CoA en muestras biológicas se han revisado22 e incluyen ensayos espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografía líquida de alta presión y procedimientos basados en espectrometría de masas. Sin embargo, estos métodos a menudo se centran en especies moleculares de CoA particulares y son ciegos a la variación de la piscina total de CoA. Los ensayos enzimáticos acoplados generalmente requieren mayores cantidades de material de entrada debido a las sensibilidades de detección bajas y tienen un rango limitado de linealidad.
Nuestro laboratorio ha desarrollado un procedimiento fiable para la cuantificación del CoA total en células cultivadas y tejidos animales. La estrategia incluye hidrólisis de todos los tioesters de CoA para producir sólo CoA libre durante la preparación de la muestra, en lugar de hacer esfuerzos para mantener y analizar todo el espectro de especies de CoA. El procedimiento es una compilación de métodos individuales publicados para la preparación de muestras, derivación de CoA, purificación e identificación después de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y cuantificación del CoA derivatizado por absorbancia o detección de fluorescencia23,24,25. Las determinaciones de CoA obtenidas mediante este procedimiento han permitido nuestra comprensión de la regulación del CdA y el desarrollo de un enfoque terapéutico para el tratamiento de las deficiencias de CoA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

Investigaciones emergentes han revelado que el suministro de coenzima celular A (CoA) puede llegar a ser limitante con un impacto perjudicial en el crecimiento, metabolismo y supervivencia. La medición del CoA celular es un desafío debido a su relativamente baja abundancia y la conversión dinámica de coa libre a tioestés de CoA que, a su vez, participan en numerosas reacciones metabólicas. Se describe un método que navega a través de posibles escollos durante la preparación de la muestra para producir un ensayo con una amplia gama lineal de detección que es adecuado para su uso en muchos laboratorios biomédicos.

Se ha desarrollado un método relativamente rápido y fiable para la detección de CoA total en células y tejidos cultivados mediante la derivación del tiol de CoA a un agente fluorescente utilizando mBBr, y luego purificando el CoA-bimane derivatizado utilizando HPLC de fase inversa. Primero se genera una curva estándar, donde se inyectan individualmente cantidades conocidas y crecientes del estándar CoA-bimane y las áreas bajo los picos de los cromatogramas CoA-bimane se trazan en función de la entrada CoA-bimane...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Este método describe la preparación de muestras a partir de células cultivadas y tejidos animales, extracción y derivación de la coenzima A en las muestras, seguida de cromatografía líquida de alta presión para la purificación y cuantificación de la coenzima A derivada por detección de absorbancia o fluorescencia.

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

La coenzima A, llamada CoA para abreviar, es un cofactor importante en el metabolismo celular. Las mediciones cuantitativas revelan cambios que ocurren con estados nutricionales y hormonales en modelos animales. Este método cuantifica la cantidad total de CoA celular, incluyendo derivados de CoA y CoA libre, en un método simple y confiable.Varios tipos de neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral se asocian con mutaciones en los genes de la vía biosintética de CoA. Este método se puede aplicar a cualquier sistema biológico ya que todos los organismos requieren CoA para la supervivencia, el crecimiento y la función. Un investigador por primera vez puede tener problemas con los primeros pasos en la preparación de la muestra, donde es importante mantener las muestras absolutamente frías y luego transferirlas rápidamente al hidróxido de potasio.Limite el número de muestras en un lote antes de la transferencia al hidróxido de potasio, y practique con la transferencia antes de trabajar con las muestras experimentales. Muchos investigadores no están familiarizados con la extracción en fase sólida en la preparación de muestras biológicas para análisis bioquímicos posteriores. Para empezar, incubar platos de cultivo triplicado en paralelo, dos para análisis bioquímicos y uno para la determinación del número celular viable.Cuando el cultivo se acerca a las densidades subconfluentes tardías, por ejemplo, las células humanas HepG2/C3A cultivadas a una densidad de seis a ocho veces 10 a las seis o hek 293T células cultivadas a una densidad de aproximadamente 1,3 veces 10 a las siete por plato de 100 milímetros, cosechar las células adherentes en el cultivo. Luego, agregue un mililitro de agua helada al mismo plato de cultivo. Raspa las células en el agua fría del plato y transfiere la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio que contiene 400 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares y 1,5 mililitros de agua para llevar el pH por encima de 12.Mezclar la suspensión vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. A continuación, cubra firmemente con película de parafina, e incubar a 55 grados centígrados durante una hora sin agitar en un baño de agua. A continuación, añada 160 microlitros de solución de clorhidrato de Trizma de un molar y 10 microlitros de 100 mililitrolares mBBr.Mezclar por vórtices en alto durante 10 segundos. Esto lleva el pH a aproximadamente ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para que el mBBr reaccione con el thiol de CoA.Después de dos horas, añadir 100 microlitros de ácido acético, y mezclar por vórtices durante 10 segundos para detener la reacción. Se forma una precipitación en el tubo. A continuación, centrifugar a 2.000 g durante 15 minutos.Para eliminar los residuos celulares precipitados, transfiera y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida. Antes de comenzar el análisis, agregue dos mililitros de hidróxido de potasio de un mililitrolar a un tubo de ensayo de vidrio diseñado para la inserción de una sonda y la interrupción del tejido con un homogeneizador de rotor-estator. Mantenga el tubo sobre hielo hasta su uso.Pesar las piezas de tejido congelado rápidamente, y registrar el peso húmedo para cada muestra. Transfiera el tejido al tubo de vidrio y homogeneice el tejido durante 30 segundos. Evite el descongelación completa del tejido.Añadir 500 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares. Vórtice en alto durante 10 segundos, y manténgase en hielo. Esto lleva el pH de la muestra por encima de 12 para hidrolizar los tioesters de CoA para producir CoA total.Cubra el tubo con película de parafina. La preparación de células cultivadas y la preparación de tejidos son los pasos más críticos en este procedimiento. Es importante añadir un alto hidróxido de potasio rápidamente para evitar la degradación de CoA.Incubar las muestras a 55 grados centígrados durante dos horas en un baño de agua sin agitar para apoyar la hidrólisis. A continuación, agregue 150 microlitros de un molar Trizma-hidrocloruro y 10 microlitros de 100 mililitros de mBBr para llevar el pH a unos ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Vórtice a fuego alto durante 10 segundos.Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para asegurarse de que todo el CoA se deriva con mBBr. Después de eso, añadir 100 microlitros de ácido acético, y vórtice en alto durante 10 segundos para detener la reacción. Centrifugar a 2.000 veces g durante 15 minutos para peletizar los desechos celulares precipitados, y transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida.A temperatura ambiente, equilibre cada columna de gel de sílice 2-2-pyridyl-ethyl desechable de un mililitro con un mililitro de tampón de lavado para asegurar que el grupo funcional piríi esté protonado y funcione como un intercambiador de aniones. A continuación, pipetee el sobrenadante de la muestra en la columna y recoja el eluido. Lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de lavado y una vez con un mililitro de agua para eliminar cualquier especie no contenida.A continuación, en un tubo de ensayo de vidrio separado, lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de elución para recoger el CoA-bimane. Seque la muestra de CoA-bimane en el tubo bajo gas nitrógeno. Selle, cubra completamente el tubo y guárdelo a menos 20 grados centígrados.Cuando esté listo para el análisis de HPLC, resuspender la muestra en 300 microlitros de agua, y mezclar vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. Transfiera la muestra resuspendida a un filtro de tubo centrífuga y centrifugar a 5.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitante. A continuación, transfiera la muestra filtrada a un vial de vidrio adecuado para la inyección de HPLC.En este estudio, un perfil HPLC representativo muestra el tiempo de retención del estándar CoA-bimane en la columna HPLC C18. Las cantidades crecientes del estándar CoA-bimane se inyectaron individualmente, y las áreas bajo los picos en los cromatogramas de CoA-bimane se trazaron en función del CoA-bimane de entrada. La curva estándar reflejaba la magnitud de la absorbancia de CoA-bimane a una longitud de onda de 393 nanómetros.La fluorescencia de CoA-bimane también se refletió en la longitud de onda de excitación de 393 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 470 nanómetros. La separación posterior de HPLC y los perfiles de detección típicos para el hígado de ratón o las células C3A cultivadas en humanos se indican aquí por picos rojos, con un tiempo de retención entre 11 y 12 minutos utilizando el programa de elución. Si la reacción con mBBr no produce resultados detectables, es posible que sea necesario ajustar la cantidad de Trizma-HCl para reducir el pH a aproximadamente ocho.Es posible detectar moléculas celulares adicionales que contienen mitades de sulfhidril o tioestes como derivados del bimano. Por ejemplo, el glutatión-bimano se puede detectar con el método HPLC. Esta técnica permitirá a otros investigadores investigar el papel potencial de la disfunción del CoA asociada con el desequilibrio metabólico, como los modelos animales de diabetes tipo 2.Los investigadores deben utilizar equipos de protección personal cuando se trabaja con disolventes orgánicos utilizados para la extracción en fase sólida.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Investigación

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic factors affecting glucose uptake. The measurement of intracellular fluorescence is a widely used method to test the uptake of fluorescently-labeled glucose (FD-glucose) in cells in vitro, or for imaging glucose-consuming tissues in vivo. This assay assesses glucose uptake at a chosen time point. The intracellular analysis assumes that the metabolism of FD-glucose is slower than that of endogenous glucose, which participates in catabolic and anabolic reactions and signaling. However, dynamic glucose metabolism also alters uptake mechanisms, which would require kinetic measurements of glucose uptake in response to different factors. This article describes a method for measuring extracellular FD-glucose depletion and validates its correlation with intracellular FD-glucose uptake in cells and tissues ex vivo. Extracellular glucose depletion may be potentially applicable for high-throughput kinetic and dose-dependent studies, as well as identifying compounds with glycemic activity and their tissue-specific effects.

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular depletion of fluorescently labeled glucose correlates with glucose uptake and could be used for high-throughput screening of glucose uptake in excised organs and cell cultures.

El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADNmt

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autor destacado: Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...