Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Författarna erkänner finansiering för sponsrad forskning som tillhandahålls av CoA Therapeutics, Inc., ett dotterbolag till BridgeBio LLC, National Institutes of Health Grant GM34496, och den amerikanska libanesiska syriska associerade välgörenhetsorganisationer.

Det djur förfarande som avses i detta protokoll utfördes i enlighet med protokollen 323 och 556 och godkändes särskilt av St. Jude Children ' s Research Hospital institutions djuromsorg och användnings utskott.
1. beredning av lösningar
Obs: Använd ultrarent vatten för alla lösningar och när det anges i procedurer.
<ol><li>Bered 1 mM kaliumhydroxid (KOH) i vatten.</li>
	<li>Förbered 0,25 M KOH i vatten.</li>
	<li>Bered 1 M Trizma-HCl i vatten och juster...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Här visar vi ett tillförlitligt steg-för-steg-förfarande för att kvantifiera total CoA i celler och djurvävnader med ett brett spektrum av linjär detektion som är tillgänglig i många laboratorier som har en HPLC med antingen en absorbans eller fluorescens utgång detektor. Alternativt, masspektrometri är en vanlig teknik för att utvärdera CoA och CoA thioesters, men är inte allmänt tillgänglig på grund av kostnaden för instrumenteringen och de specialiserade kunskaper som krävs för utveckling av metod...

Coenzym A (CoA) är en viktig kofaktor i alla levande organismer och syntetiseras från pantotensyra, även kallad pantothenate (salt av pantotensyra) eller vitamin B5. CoA är den största intracellulära bärare av organiska syror, inklusive korta kedjor syror såsom acetat och succinat, gren-Chain syror såsom propionat och metylmalonat, långkedjiga fettsyror såsom palmitat och oleat, mycket långkedjiga fettsyror som fleromättade fettsyror, och xenobiotika såsom valproinsyra. Den organiska syran bildar en Thioester sammanlänkning enzymatiskt med COA för att möjliggöra dess bruk som ett substrat i över 100 reaktioner i intermediär ämnesomsättning1. COA thioesters är också Alloster regulatorer och transkriptionella aktivatorer. Det är nu uppskattat2 att den cellulära totala COA utbudet regleras3,4; Således, CoA tillgänglighet kan vara begränsande, och att CoA brister kan vara katastrofala, som exemplifieras av ärftliga genetiska sjukdomar som påverkar CoA biosyntes5. Pantothenate Kinas katalyserar det första steget i COA biosyntes (figur 1) och pantothenate Kinas associerade neurodegeneration, kallas pkan, orsakas av mutationer i PANK2 genen6. CoA syntas, kodade av coasyn genen, katalyserar de två sista stegen i COA biosyntes (figur 1) och Coasy protein-associerad neurodegeneration, kallas Copan, orsakas av en mutation i coasyn genen7. Både pkan och Copan ärvs neurodegenerativa sjukdomar förknippade med järnansamling i hjärnan och COA brister un sjukdomens patologier.
Cellulära nivåer av totala CoA varierar mellan vävnader8 och totala COA kan öka eller minska under en mängd olika fysiologiska, patologiska och farmakologiska tillstånd. Lever CoA ökar under bränsle växling från Fed till fastande tillstånd9, och lever COA nivåer är onormalt hög hos leptin-bristfällig feta möss10. Lever CoA minskar som svar på kronisk etanol intag11. Hjärnan CoA nivåer i Pank2 knockout musmodellen är deprimerad under den perinatal perioden, men senare i vuxen stadiet hjärnan COA innehåll motsvarar Wild-typ nivåer, vilket indikerar en adaptiv COA svar under utveckling12. Manipulation av vävnad COA innehåll genom transgenes eller gen leveransmetoder påverkar metabola och neurala funktioner13,14,15. Preklinisk utveckling av potentiella terapier för pkan eller Copan inkluderar cell-eller vävnads COA-mätningar som indikatorer på effekt16,17,18,19,20 . Utvärdering av alla dessa villkor och deras metabola eller funktionella konsekvenser kräver en kvantitativ metod för mätning av total CoA.
En noggrann, tillförlitlig analys för att mäta CoA i biologiska prover är en teknisk utmaning i många laboratorier. Tyvärr, det finns inga sonder tillgängliga för att utvärdera eller kvantifiera CoA eller CoA thioesters i intakt celler, även om analoger av naturliga CoA thioesters har använts i stor utsträckning som mekanistiska sonder i studier av CoA Ester utnyttja enzymer21. Omvandlingen av CoA, med en fri sulfhydryl (-SH) del, till en CoA Thioester (eller vice versa) är snabb i celler eller djurvävnader under överföring till en annan miljö och under cell lysis. Många Acyl-CoA-syntetar och Acyl-CoA-tioesteraser i celler förmedlar interkonverteringarna inom CoA-poolen, och ytterligare enzymer som utnyttjar CoA-tioestrar som substrat förblir aktiva i biologiska prover tills de släckts av kemisk eller fysikalisk Innebär. Den off-loading av Acyl-grupper från CoA till karnitin av Acyl-transferases är ett exempel inom nätverket av reaktioner som kan förändra CoA/CoA Thioester distribution. Radioaktiva spårämnen kan användas för att mäta frekvenser av COA-syntes i celler. Nuvarande metoder för mätning av CoA-och CoA-derivat i biologiska prover har setts över22 och omfattar sammansatta enzymatiska spektrofotometriska analyser, högtrycks vätskekromatografi och masspektrometribaserade procedurer. Emellertid, dessa metoder är ofta inriktade på särskilda CoA molekylära arter och är blinda för variation av den totala CoA pool. De kopplade enzymatiska analyserna kräver i allmänhet större mängder inmatnings material på grund av låg detektionskänslighet och har ett begränsat utbud av linearitet.
Vårt laboratorium har utvecklat ett tillförlitligt förfarande för kvantifiering av total CoA i odlade celler och djurvävnader. Strategin omfattar hydrolys av alla CoA thioesters att ge endast gratis CoA under provberedning, snarare än att göra ansträngningar för att underhålla och analysera hela spektrumet av CoA arter. Förfarandet är en sammanställning av enskilda publicerade metoder för provberedning, CoA-derivatisering, rening och identifiering efter högtrycks vätskekromatografi (HPLC), och kvantifiering av det derivatiserade äkthetsbeviset genom absorbans eller fluorescensdetektion23,24,25. CoA bestämningar erhålls med hjälp av detta förfarande har möjliggjort vår förståelse av CoA reglering och utveckling av en terapeutisk metod för behandling av CoA brister.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

Framväxande forskning har visat att den cellulära coenzym A (CoA) utbudet kan bli begränsande med en skadlig inverkan på tillväxt, metabolism och överlevnad. Mätning av cellulära CoA är en utmaning på grund av dess relativt låga överflöd och den dynamiska omvandlingen av fri CoA till CoA thioesters att i sin tur delta i många metabola reaktioner. En metod beskrivs som navigerar genom potentiella fallgropar under provberedning för att ge en analys med ett brett linjärt detektionsområde som lämpar sig för användning i många biomedicinska laboratorier.

En relativt snabb och tillförlitlig metod för detektion av total CoA i odlade celler och vävnader har utvecklats genom derivatizing den thiol av CoA till en fluorescerande medel med hjälp av mBBr, och sedan rena derivatized CoA-bimane med omvänd fas HPLC. En standardkurva genereras först, där kända och ökande mängder av CoA-bimane-standarden injiceras individuellt och områdena under topparna i CoA-bimane-kromatogrammen ritas som en funktion av ingången CoA-bimane (figur 4). CoA-b...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Denna metod beskriver provberedning från odlade celler och djurvävnader, extraktion och derivatisering av coenzym A i proverna, följt av vätskekromatografi med högt tryck för rening och kvantifiering av det derivatiserade coenzym A genom absorbans eller fluorescensdetektion.

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Coenzym A, kallas CoA för kort, är en viktig kofaktor i cellulär metabolism. Kvantitativa mätningar avslöjar förändringar som sker med närings- och hormonella tillstånd i djurmodeller. Denna metod kvantifierar den totala mängden cellulära CoA, inklusive CoA derivat och fri CoA, i en enkel, tillförlitlig metod.Flera typer av neurodegeneration med hjärnan järn ackumulering är associerade med mutationer i generna i CoA biosyntetiska vägen. Denna metod kan tillämpas på alla biologiska system eftersom alla organismer kräver CoA för överlevnad, tillväxt, och funktion. En första gången forskare kan kämpa med de första stegen i provberedning, där det är viktigt att hålla proverna helt kallt och sedan snabbt överföra dem till kaliumhydroxid.Begränsa antalet prover i ett parti före överföring till kaliumhydroxid, och öva med överföringen innan du arbetar med försöksproverna. Många forskare är inte bekanta med solid-fas extraktion i beredningen av biologiska prover för senare biokemisk analys. Till att börja med ruva tre exemplar kultur rätter parallellt, två för biokemisk analys och en för bestämning av livskraftiga cellnummer.När kulturen närmar sig den sena subkonfluensiteter, till exempel, mänskliga HepG2/C3A celler som odlas till en densitet av sex till åtta gånger 10 till sex eller HEK 293T celler som odlas till en densitet på cirka 1,3 gånger 10 till de sju per 100-millimeters skålen, skörda de anhängare celler i kulturen. Tillsätt sedan en milliliter iskallt vatten till samma odlingsrätt. Skrapa celler i det kalla vattnet i skålen, och överföra cellen suspensionen i ett glas provrör som innehåller 400 mikroliter av 0,25-molar kaliumhydroxid och 1,5 milliliter vatten för att få pH över 12.Blanda upphängningen kraftigt genom att virvelsa på hög i 10 sekunder. Täck sedan tätt med paraffinfilm och inkubera i 55 grader Celsius i en timme utan att skaka i ett vattenbad. Tillsätt sedan 160 mikroliter av en-molar Trizma-hydrokloridlösning och 10 mikroliter på 100-millimolar mBBr.Blanda genom att virvelning på hög i 10 sekunder. Detta kommer med pH-n till ungefärligt åtta för att stötta mBBr-reaktionen med fria CoA. Täck röret med paraffinfilm, och inkubera proverna i rumstemperatur i två timmar i mörker för att mBBr ska reagera med thiol av CoA.Efter två timmar, tillsätt 100 mikroliter av ättiksyra, och blanda genom att vortexa i 10 sekunder för att stoppa reaktionen. En nederbörd bildas i röret. Därefter centrifug vid 2, 000 gånger g i 15 minuter.För att ta bort det utfällda cellskräpet, överför och sparar du supernatanten i ett glasprovrör för saneringen av utvinningskolumnen i fast fas. Innan analysen påbörjas, tillsätt två milliliter av en millimol kaliumhydroxid till ett provrör av glas som är konstruerat för insättning av en sond och vävnadsstörning med en rotor-stator-homogenisator. Håll röret på is tills användning.Väg de frysta vävnadsbitarna snabbt, och registrera den våta vikten för varje prov. Överför vävnaden i glasröret, och homogenisera vävnaden i 30 sekunder. Undvik fullständig upptining av vävnaden.Tillsätt 500 mikroliter av 0,25-mol kaliumhydroxid. Virvel på hög i 10 sekunder, och hålla på is. Detta ger pH av provet ovan 12 för att hydrolysera CoA thioesters att ge totalt CoA.Täck röret med paraffinfilm. Beredningen av odlade celler och beredning av vävnader är de mest kritiska stegen i detta förfarande. Det är viktigt att lägga till hög kaliumhydroxid snabbt för att förhindra CoA nedbrytning.Inkubera proverna i 55 grader Celsius i två timmar i ett vattenbad utan att skaka för att stödja hydrolys. Tillsätt sedan 150 mikroliter av en-molar Trizma-hydroklorid och 10 mikroliter av 100-millimolar mBBr för att få pH till cirka åtta för att stödja mBBr reaktion med fri CoA. Virvel på hög i 10 sekunder.Täck röret med paraffinfilm, och inkubera proverna i rumstemperatur i två timmar i mörker för att säkerställa att alla CoA är derivatiserad med mBBr. Efter det, tillsätt 100 mikroliter av ättiksyra, och virvel på hög i 10 sekunder för att stoppa reaktionen. Centrifugera vid 2, 000 gånger g i 15 minuter till pellet utfällda cellskräp, och överföra supernatanten i ett glasprovrör för saneringen av fastfas-utsugningskolumn.Vid rumstemperatur, jämvikt varje en-milliliter engångs 2-2-pyridyl-etyl kiselgel kolumn med en milliliter av tvätt buffert för att säkerställa att pyridyl funktionell grupp är protonated och kommer att fungera som en anjon växlare. Sedan pipettera provet supernatant på kolonnen, och samla eluat. Tvätta kolonnen två gånger med en milliliter tvättbuffert och en gång med en milliliter vatten för att avlägsna eventuella obefläckade arter.Därefter, i ett separat glas provrör, tvätta kolumnen två gånger med en milliliter eluer buffert för att samla coA-bimane. Torka coa-bimanprovet i röret under kvävegas. Tätning, helt täcka röret, och förvara på minus 20 grader Celsius.När du är klar för HPLC-analys, återanvänd provet i 300 mikroliter vatten, och blanda kraftigt genom att virvla på hög i 10 sekunder. Överför det återanvända provet till ett centrifugrörsfilter, och centrifug vid 5, 000 gånger g i 10 minuter för att avlägsna eventuell precipitant. Därefter överför du det filtrerade provet till en glasflaska som är lämplig för HPLC-injektion.I denna studie visar en representativ HPLC-profil retentionstiden för CoA-bimane-standarden på C18 HPLC-kolumnen. Ökande mängder av CoA-bimane standarden injicerades individuellt, och de områden under topparna i CoA-bimane kromatogram ritades som en funktion av ingången CoA-bimane. Standardkurvan återspeglade omfattningen av absorbans av CoA-biman vid en våglängd på 393 nanometer.Fluorescensen av CoA-bimane återspeglades också vid excitation våglängden av 393 nanometer och utsläpp våglängd av 470 nanometer. Efterföljande HPLC-separation och typiska detektionsprofiler för muslever eller human odlade C3A-celler indikeras här av röda toppar, med en retentionstid mellan 11 och 12 minuter med hjälp av eulutionsprogrammet. Om reaktionen med mBBr inte ger detekterbara resultat kan mängden Trizma- HCl behöva justeras för att sänka pH-värdet till cirka åtta.Det är möjligt att upptäcka ytterligare cellulära molekyler som innehåller sulfhydryl eller thioester moieties som bimanederivat. Glutation-bimane kan till exempel detekteras med HPLC-metoden. Denna teknik kommer att tillåta andra forskare att undersöka den potentiella rollen av CoA dysfunktion i samband med metabolisk obalans, såsom djurmodeller av typ 2-diabetes.Forskare bör använda personlig skyddsutrustning när de arbetar med organiska lösningsmedel som används för fast-fas extraktion.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimerad enmolekylär pull-down-analys för kvantifiering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...