Name: quantification of coenzyme a in cells and tissues
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Yazarlar CoA Therapeutics, Inc, BridgeBio LLC, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe GM34496 ve Amerikan Lübnan Suriye Associated Charities bir yan kuruluşu tarafından sağlanan sponsorlu araştırma için finansman kabul.

Bu protokolde belirtilen hayvan prosedürü 323 ve 556 sayılı protokollere göre gerçekleştirilmiştir ve Özellikle St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT: Tüm çözeltiler için ve prosedürlerde belirtildiği zaman ultra saf su kullanın.
<ol><li>Suda 1 mM potasyum hidroksit (KOH) hazırlayın.</li>
	<li>Suda 0,25 M KOH hazırlayın.</li>
	<li>Suda...

<ol>
	<li>Abiko, Y., Greenburg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).</li><li>Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+A:+Back+in+action.">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis.">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li><li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle.">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li><li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration.">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pantothenate+kinase+gene+(PANK2)+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome.">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li><li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation.">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li><li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases.">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li><li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats.">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li><li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism.">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871 (2012).</li><li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2.">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li><li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice.">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).</li><li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy.">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li><li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration.">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399 (2018).</li><li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation.">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease.">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104 (2017).</li><li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-4'-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency.">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260 (2017).</li><li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+missing+link:+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications.">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples.">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li><li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane.">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li><li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds.">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li><li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isolation+procedure+for+short-,+medium-,+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue.">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li><li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li><li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimanes+.17.+(Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones+(Halo-9,10-Dioxabimanes)+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol,+Glutathione.">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li><li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis.">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry &amp; Biology. 14, 291-302 (2007).</li><li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toyoda+A,Chohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues.">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li><li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A,+dephospho-coenzyme+A,+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats.">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li><li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells.">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li></ol>

Burada, bir emicilik veya floresan çıkış dedektörü ile bir HPLC'ye sahip birçok laboratuvarda erişilebilen çok çeşitli doğrusal algılama ile hücre ve hayvan dokularında toplam CoA'nın ölçülmesi için güvenilir, adım adım bir prosedür gösteriyoruz. Alternatif olarak, kütle spektrometresi CoA ve CoA tiyoesterlerinin değerlendirilmesinde yaygın bir tekniktir, ancak enstrümantasyon maliyeti ve metodoloji ve verilerin yorumlanması için gerekli özel bilgi nedeniyle yaygın olarak mevcut değildir...

Koenzim A (CoA) tüm canlıorganizmalarda önemli bir kofaktördür ve pantotenik asitten sentezlenir, pantotenat (pantotenik asit tuzu) veya B5 vitamini olarak da adlandırılır. CoA organik asitlerin büyük hücre içi taşıyıcısıdır, asetat ve sinkinat gibi kısa zincirli asitler, propiyonat ve metimalonat gibi dal zincirli asitler, palmitat ve oleat gibi uzun zincirli yağ asitleri, çok uzun zincirli yağ asitleri gibi çoklu doymamış yağ asitleri, ve valproik asit gibi kkneobiyotikler. Organik asit, ara metabolizma1'de 100'den fazla reaksiyonda substrat olarak kullanılmasını sağlamak için CoAile enzimatik olarak bir tiyoester bağlantısı oluşturur. CoA tiyoesterler de allosterik düzenleyiciler ve transkripsiyonel aktivatörler vardır. Şimdi takdir2 hücresel toplam CoA kaynağı düzenlenir3,4; böylece, CoA kullanılabilirliği sınırlayıcı olabilir, ve CoA eksiklikleri felaket olabilir, CoA biyosentezi etkileyen kalıtsal genetik bozukluklar tarafından örneklenen5. Pantotenat kinazi CoA biyosentezinin ilk adımını katalizler (Şekil 1) ve Pantotenat Kiaz İlişkili Nörodejenerasyon, PKAN denilen, PANK2 genmutasyonları neden 6 . COA synthase, COASYN geni tarafından kodlanmış, CoA biyosentezinde son iki adımı katalizler(Şekil 1) ve COASY Protein İlişkili Nörodejenerasyon, CoPAN olarak adlandırılan, COASYN genmutasyonuna neden olur7. Hem PKAN hem de CoPAN beyinde demir birikimi ve CoA eksiklikleri ile ilişkili kalıtsal nörodejeneratif hastalıklardır.
Total CoA hücresel düzeyleri dokular arasında değişir8 ve toplam CoA fizyolojik, patolojik ve farmakolojik durumların çeşitli altında artırabilir veya azalabilir. Karaciğer CoA açlık durumuna beslenen yakıt geçiş sırasında artar9, ve karaciğer CoA düzeyleri leptin eksikliği obez farelera anormal derecedeyüksek10. Karaciğer CoA kronik etanol alımına yanıt olarak azalır11. Pank2 nakavt fare modelinde Beyin CoA düzeyleri perinatal dönemde depresif, ancak daha sonra yetişkin aşamasında beyin CoA içeriği vahşi tip düzeyleri eşdeğerdir, geliştirme sırasında adaptif CoA yanıtı gösteren12. Transgenez veya gen iletim yöntemleri ile doku CoA içeriğinin manipülasyonu metabolik ve sinirsel fonksiyonları etkiler13,14,15. PKAN veya CoPAN için potansiyel tedavilerin preklinik gelişimi etkinlik göstergesi olarak hücre veya doku CoA ölçümleri içerir16,17,18,19,20 . Tüm bu durumların ve bunların metabolik veya fonksiyonel sonuçlarının değerlendirilmesi, toplam CoA'nın ölçümü için nicel bir yöntem gerektirir.
Biyolojik numunelerde CoA'nın ölçülmesi için doğru ve güvenilir bir tahlil birçok laboratuvarda teknik bir sorundur. Doğal CoA tiyoesterlerinin analogları enzimleri kullanan CoA esteri çalışmalarında mekanistik problar olarak yaygın olarak kullanılmış olsa da, ne yazık ki, bozulmamış hücrelerde CoA veya CoA tiyoesterlerini değerlendirmek veya ölçmek için kullanılabilir problar bulunmamaktadır21. CoA dönüşüm, serbest sulfhydryl ile (-SH) moiety, bir CoA tiyoester (veya tersi) farklı bir ortama transfer sırasında hücre veya hayvan dokularında hızlı ve hücre lisis sırasında. Hücrelerdeki çok sayıda ayl-CoA sentezi ve acyl-CoA tiyostazları CoA havuzundaki dönüşümlere aracılık eder ve substratlar biyolojik numunelerde kimyasal veya fiziksel olarak söndürülene kadar aktif kalırlar. Anlamına gelir. Acil-transferazlar ile CoA'dan karnitin'e kadar olan asil gruplarının off-loading'i, CoA/CoA tiyoester dağılımını değiştirebilecek reaksiyonlar ağı içinde bir örnektir. Radyoaktif izleyiciler hücrelerde CoA sentezoranlarını ölçmek için kullanılabilir. Biyolojik numunelerde CoA ve CoA türevlerinin ölçülmesi için kullanılan mevcut yöntemler22 gözden geçirilmiştir ve birleştirilmiş enzimatik spektrofotometrik tahliller, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi tabanlı prosedürleri içermektedir. Ancak, bu yöntemler genellikle belirli CoA moleküler türler üzerinde duruldu ve toplam CoA havuzu varyasyon için kör. Birleştirilmiş enzimatik tahliller genellikle düşük algılama hassasiyetleri nedeniyle daha büyük miktarlarda giriş malzemesi gerektirir ve doğrusallık sınırlı bir aralığına sahiptir.
Laboratuvarımız kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında toplam CoA'nın sayısallaştırılması için güvenilir bir prosedür geliştirmiştir. Strateji, coa türlerinin tüm spektrumu korumak ve analiz etmek için çaba sarf etmek yerine, numune hazırlama sırasında sadece serbest CoA verim için tüm CoA tiyoesterlerin hidroliziçerir. Prosedür, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) sonrasında numune hazırlama, CoA türevileştirme, saflaştırma ve tanımlama için bireysel olarak yayınlanan yöntemlerin bir derlemesidir ve türemiş CoA'nın absorbasyon veya floresan algılama23,24,25. Bu prosedür kullanılarak elde edilen CoA tayini, CoA regülasyonu ve CoA eksikliklerinin tedavisi için terapötik bir yaklaşım geliştirilmesini anlamamızı sağlamıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>54127-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coenzyme A</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini C18 3 &#956;m 100 &#197; HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4439-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobromobimane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M-1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>32750H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0530997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T395-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2475 fluorescence detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2489 UV-Vis detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td>2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters e2695 separations module</td>
			<td>Waters</td>
			<td>e2695</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of coenzyme a in cells and tissues

Ortaya çıkan araştırmalar hücresel koenzim A (CoA) kaynağı büyüme, metabolizma ve sağkalım üzerinde zararlı bir etkisi ile sınırlayıcı hale gelebileceğini ortaya koymuştur. Hücresel CoA ölçümü nispeten düşük bolluk ve coa thioesters için ücretsiz CoA dinamik dönüşüm nedeniyle bir meydan okuma, sırayla, çok sayıda metabolik reaksiyonlar katılmak. Bir yöntem, numune hazırlama sırasında birçok biyomedikal laboratuvarda kullanıma uygun geniş bir doğrusal algılama aralığıile bir test verim potansiyel tuzaklar arasında gezinir açıklanmıştır.

Kültürlü hücre ve dokularda toplam CoA tespiti için nispeten hızlı ve güvenilir bir yöntem mBBr kullanarak bir floresan ajan CoA tiyol türevi ve daha sonra ters faz HPLC kullanarak türev coa-biman arındırıcı tarafından geliştirilmiştir. CoA-bimane standardının bilinen ve artan miktarlarının tek tek enjekte edildiği ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanların CoA-bimane girişinin bir fonksiyonu olarak çizildiği standart bir eğri ilk olarak oluşturulur (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues at JoVE.com

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Bu yöntem, kültürhücreleri ve hayvan dokularından örnek hazırlanmasını, örneklerde koenzim A'nın çıkarılması nı ve türebenizasyonunu, türevleştirilmiş koenzim A'nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi absorbans veya floresan algılama.

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Koenzim A, kısaca CoA denir, hücremetabolizmasında önemli bir kofaktördür. Kantitatif ölçümler hayvan modellerinde beslenme ve hormonal durumlarla meydana gelen değişiklikleri ortaya koymaktadır. Bu yöntem, basit ve güvenilir bir yöntemle, CoA türevleri ve ücretsiz CoA dahil olmak üzere hücresel CoA'nın toplam miktarını ölçüyor.Beyin demir birikimi ile nörodejenerasyon çeşitli CoA biyosentetik yol genlerinde mutasyonlar ile ilişkilidir. Tüm organizmalar hayatta kalmak, büyüme ve fonksiyon için CoA gerektirdiğinden bu yöntem herhangi bir biyolojik sisteme uygulanabilir. İlk kez araştırmacı olan bir araştırmacı, numune hazırlamada ilk adımlarla mücadele edebilir, burada numuneleri kesinlikle soğuk tutmak ve daha sonra hızlı bir şekilde potasyum hidroksite aktarmak önemlidir.Potasyum hidroksite aktarılmadan önce toplu olarak alınan numune sayısını sınırlayın ve deneysel numunelerle çalışmadan önce transferle pratik yapın. Birçok araştırmacı daha sonra biyokimyasal analiz için biyolojik örneklerin hazırlanmasında katı faz çıkarma ile tanışmış değildir. Başlamak için, paralel olarak triplicate kültür yemekleri inkübat, biyokimyasal analiz için iki ve canlı hücre sayısının belirlenmesi için bir.Kültür geç subconfluent yoğunlukları yaklaştığında, örneğin, insan HepG2/C3A hücreleri altı ila sekiz kez 10 bir yoğunluk büyüdü altı veya HEK 293T hücreleri yaklaşık 1.3 kat 10 00 00 00 000-10 00 bir yoğunluk büyüdü, kültürde yapışık hücreleri hasat. Sonra, aynı kültür çanak buz gibi su bir mililitre ekleyin. Hücreleri çanaktaki soğuk suya kazıyın ve hücre süspansiyonuna 400 mikrolitre 0,25-molar potasyum hidroksit ve 1,5 mililitre su içeren bir cam test tüpüne aktarArak pH'ı 12'nin üzerine çıkarın.Süspansiyonu 10 saniye boyunca yüksekbir şekilde girdaplayarak şiddetle karıştırın. Sonra parafin film ile sıkıca kaplayın ve bir su banyosunda sallayarak olmadan bir saat boyunca 55 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, tek azılı Trizma-hidroklorür çözeltisi 160 mikrolitre ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre ekleyin.10 saniye boyunca yüksek girdap tarafından karıştırın. Bu da pH'ı serbest CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekize çıkarır. Tüpü parafin filmle kaplayın ve mBBr'nin CoA'nın tiyoliyle reaksiyona sayılması için numuneleri iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.İki saat sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 10 saniye girdap tarafından karıştırın. Tüpte bir yağış oluşur. Sonra, santrifüj 2, 000 kez g 15 dakika.Çökelmiş hücre enkazını çıkarmak için, katı fazlı ekstraksiyon sütunu temizliği için bir cam test tüpündeki süpernatant'ı aktarın ve kaydedin. Analize başlamadan önce, bir rotamatör-stator homogenizer ile bir prob ve doku bozulması yerleştirmek için tasarlanmış bir cam test tüpüne bir mililitre bir mililitre bir mililitre potasyum hidroksit ekleyin. Tüpü kullanıma kadar buzda tutun.Dondurulmuş doku parçalarını hızlı bir şekilde tartın ve her örnek için ıslak ağırlığı kaydedin. Dokuyu cam tüpe aktarın ve 30 saniye boyunca dokuyu homojenize edin. Doku tamamen çözülmesinden kaçının.0.25-molar potasyum hidroksit 500 mikrolitre ekleyin. Girdap 10 saniye yüksekte ve buzda kal. Bu toplam CoA verim coa tiyoesters hidrolize 12 yukarıdaki numunenin pH getiriyor.Tüpü parafin filmle kaplayın. Kültürlü hücrelerin hazırlanması ve dokuların hazırlanması bu işlemin en kritik adımlarıdır. CoA bozulmasını önlemek için hızlı bir şekilde yüksek potasyum hidroksit eklemek önemlidir.Hidrolizi desteklemek için titremeden numuneleri su banyosunda iki saat boyunca 55 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 150 mikrolitre tek molar Trizma-hidroklorür ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre eklemek ücretsiz CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekiz pH getirmek için. Girdap 10 saniye boyunca yüksekte.Tüpü parafin filmle kaplayın ve tüm CoA'nın mBBr ile türetilmesini sağlamak için numuneleri karanlıkta iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve yüksek girdap 10 saniye boyunca reaksiyonu durdurmak için. 2, 000 kez g 15 dakika pelet çökelmiş hücre enkaz için santrifüj ve katı faz çıkarma sütunu temizleme için bir cam test tüpü içine supernatant aktarın.Oda sıcaklığında, piriridil fonksiyonel grubun protonated ve bir aniyon değiştirici olarak işlev sağlayacak yıkama tampon bir mililitre ile her bir mililitre tek kullanımlık 2-2-piriridyl-etil silika jel sütun dengeleyin. Daha sonra, pipet örnek supernatant sütun üzerine supernatant ve eluate toplamak. Sütunu bir mililitre yıkama tamponuyla iki kez ve bir mililitre suyla yıkayın.Daha sonra, ayrı bir cam test tüpü içine, CoA-bimane toplamak için elüsyon tampon bir mililitre ile iki kez sütun yıkayın. Tüpteki CoA-bimane örneğini azot gazı altında kurutun. Seal, tamamen tüp kapağı, ve eksi 20 santigrat derece saklayın.HPLC analizi için hazır olduğunuzda, 300 mikrolitre suda numuneyi yeniden askıya alın ve 10 saniye boyunca yükseklere girdap atarak şiddetle karıştırın. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 5.000 kez g olarak bir santrifüj tüp filtresi ve santrifüj için resuspended örnek aktarın. Daha sonra, filtrelenmiş numuneyi HPLC enjeksiyonu için uygun bir cam şişeye aktarın.Bu çalışmada, temsili bir HPLC profili C18 HPLC sütununda CoA-bimane standardının bekletme süresini göstermektedir. CoA-bimane standardının artan miktarları ayrı ayrı enjekte edildi ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanlar CoA-bimane girdisinin bir fonksiyonu olarak çizildi. Standart eğri 393 nanometre dalga boyunda CoA-bimane emicilik büyüklüğünü yansıtıyor.CoA-bimane floresansı da 393 nanometre uyarma dalga boyu ve 470 nanometre emisyon dalga boyu yansıtıldı. Sonraki HPLC ayırma ve fare karaciğer veya insan kültürlü C3A hücreleri için tipik algılama profilleri burada kırmızı zirveleri ile gösterilir, arasında bir tutma süresi ile 11 ve 12 dakika elüsyon programı kullanılarak. mBBr ile reaksiyon tespit edilebilir sonuçlar vermezse, TRizma-HCl miktarının pH'ı yaklaşık sekize düşürmek için ayarlanması gerekebilir.Bu bimantürevleri olarak sulfhydryl veya tiyoester moieties içeren ek hücresel molekülleri tespit etmek mümkündür. Örneğin, glutatyon-bimane HPLC yöntemi ile tespit edilebilir. Bu teknik, diğer araştırmacıların tip 2 diyabetin hayvan modelleri gibi metabolik dengesizlikle ilişkili CoA disfonksiyonunun potansiyel rolünü araştırmalarına olanak sağlayacaktır.Araştırmacılar, katı faz lı ekstraksiyon için kullanılan organik çözücülerle çalışırken kişisel koruyucu ekipman kullanmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...