Name: sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det tyske Forskningsråd (DFG) via projektet STE 432/11-1, der blev tildelt AS og af ELAN-programmet fra det medicinske fakultet (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via projektet 18-12-21-1, der blev tildelt LG.

De monocytter afledte DCs-produkter blev genereret fra leukaferese af raske donorer. Derfor er der opnået en positiv afstemning i den lokale etiske komité (referencenummer 4556). Forsøgene i nærværende undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra den etiske komité for "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (referencenummer 4556). Alle donorer godkendte et skriftligt informeret samtykke, herunder i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.
1. generering og håndtering af umodne dendritiske celler (Idc'er) og modne dendritiske celler (mDCs)
<ol><li>Isoler humane perifert blod mononukleære celler (pbmcs) fra leukoreduktion system Chambers (lrscs) som tidligere beskrevet27. Undgå Kryopreservation af Pbm'er, og brug dem direkte ved isolation for at opnå højere DC-udbytter.</li>
	<li>Generere humane DCS-systemer fra pbmc'er af forskellige raske donorer i T175 cellekultur kolber som tidligere beskrevet10,27. Brug kortvarigt 350-400 millioner Pbmc'er i 30 mL DC-medium (RPMI 1640 uden L-glutamin, 1% (v/v) AB-serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 0,4 mM L-glutamin, 10 mM HEPES) pr. celle dyrknings kolbe til isolering af monocytter ved tilslutning. Efter 1 time vaskes ikke-vedhængende brøk ved hjælp af RPMI 1640. Tilsæt Fresh DC medium suppleret med 800 U/mL GM-CSF og 250 U/mL IL-4, og Inkuber i 3 dage.<ol>
<li>På dag 3 efter tilslutning tilsættes 5 mL frisk DC-medium indeholdende GM-CSF og IL-4 med en endelig koncentration på henholdsvis 400 U/mL og 250 U/mL pr. celle dyrknings kolbe til DC-differentiering.</li>
		<li>For at høste Idc'er skal du forsigtigt skylle løst klæbende Idc'er fra bunden af cellekultur kolben på dag 4 efter tilslutningen. Gentag dette trin 2 gange. For generation af mDCs, tilsættes modning cocktail sammensat som følger: GM-CSF (Final koncentration: 40 U/mL), IL-4 (endelig koncentration: 250 U/mL), IL-6 (endelig koncentration: 1000 U/mL), IL-1β (endelig koncentration: 200 U/mL), TNF-α (endelig koncentration: 10 ng/ mL), prostaglandin E2 (PGE2; endelig koncentration: 1 μg/mL).</li>
		<li>Seks dage efter tilslutning (to dage efter induktion af modning ved hjælp af en cytokincocktail), skyl mDCs fra bunden af cellen kultur kolbe. Gentag dette trin to gange. Bemærk: umodne og modne DCs kan sekventielt genereres af identiske donorer i 1 celle dyrknings kolbe. For at gøre dette, (i) adskille det relevante antal Idc'er og (II) fremkalde modning af de resterende celler i kolberne ved hjælp af den cytokincocktail, der er anført i trin 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør Idc'er eller Mdc'er i det pågældende celle dyrkningsmedium til 50 mL rør. Høst cellerne via centrifugering ved 300 x g i 5 min.<ol>
<li>Resuspender forsigtigt (= vask) DCs i 5-10 mL RPMI 1640 pr. celle dyrknings kolbe. Kombiner de respektive DC-suspensioner i ét rør.</li>
		<li>Definer celle nummeret ved hjælp af et optællings kammer eller en alternativ metode. Undgå temperaturændringer ved håndtering af Idc'er, for at reducere risikoen for fænotypiske ændringer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. flow cytometriske analyser til overvågning af fænotypiske modnings status
<ol><li>Overfør Idc'er eller Mdc'er (0,5 x 106) fra trin 1.3.1 til et 1,5 ml rør. Høst cellerne via centrifugering ved 3390 x g i 1,5 min. vask cellerne én gang med FACS BUFFER (PBS suppleret med 2% føtal kalveserum (FCS)).</li>
	<li>Cellerne opslæmmes i 100 μL antistof farvningsopløsning (FACS buffer), der indeholder specifikke fluorokrom-mærkede antistoffer mod definerede overflade molekyler.<ol>
<li>Brug følgende antistoffer til at verificere renhed (CD3-FITC, CD14-PE) samt modning status af DCs (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).</li>
		<li>Forbered en ufarvet prøve i 100 μL FACS buffer som kontrol.</li>
		<li>Plette cellerne på is i mørket i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efterfølgende vaskes cellerne to gange i 1 mL FACS-buffer og centrifugeres ved 3390 x g i 1,5 min.</li>
	<li>Endelig resuspension cellerne i 200 μL af FACS buffer suppleret med 2% PFA og analysere cellerne ved flow cytometry. Faste celler kan opbevares ved 4 ° C i mørket op til 2 dage.</li>
</ol>3. infektion procedure af DCs med herpes simplex virus type-1 (HSV-1) og interferens af HSV-1-induceret autophagic flux via spautin-1 eller bafilomycin-a1
Bemærk: stammen HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP), der anvendes i dette studie, blev opnået fra laboratorie stammen HSV-1 stamme 17 +. HSV-1 EGFP-stammen udtrykker det forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP), som er blevet indsat i UL43-genlocus under kontrol af CMV-promotoren. EGFP fungerer som markør for HSV-1-infektion. Desuden blev stammen HSV1-RFPVP26 anvendt til DC-infektions undersøgelser (tidligere beskrevet i Turan et al., 2019). Denne virus udtrykker kapsid overflade protein VP26 smeltet til monomer rødt fluorescerende protein (mrfp).
<ol><li>Overfør Idc'er eller Mdc'er (2 x 106) fra trin 1,3 til et 2 ml rør. Derefter centrifugeres cellerne ved 3390 x g i 1,5 min, og supernatanten kasseres.</li>
	<li>Resuspender forsigtigt cellerne i infektions mediet (RPMI 1640 suppleret med 20 mM HEPES).<ol>
<li>At hæmme autophagosomal-lysosomal nedbrydnings pathway, før behandling af DCs med spautin-1 eller bafilomycin-a1 1 h før infektion. Tilsæt enten 10 μM spautin-1 eller 1 μM BA1, eller DMSO som ubehandlet kontrol, til infektionen medium. Cellerne inkubates i en varmeblok ved 300 RPM omrystning ved 37 °C i 1 time.</li>
		<li>For infektion undersøgelser, inokulere cellerne med HSV-1 virions på en mangfoldighed af infektion (MOI) af 2. Tilsæt den respektive volumen MNT buffer (30 mM 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) som mock Control. Cellerne inkubates i en varmeblok ved 300 RPM omrystning ved 37 °C i 1 time.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 h post infektion (HPI), indsamle cellerne ved 3390 x g for 1,5 min. Aspirate inokulum og forsigtigt resuspendere cellerne i DC medium indeholdende 40 u/ml GM-CSF, 250 U/ml Il-4 og enten 10 μM spautin-1, 1 μM BA1, eller DMSO som kontrol. Og HSV-1-inficerede celler i en endelig koncentration på 1 x 106/ml i en 6-brønd plade.</li>
	<li>Ved 16-24 HPI, høst cellerne ved skylning (mDCs) eller ved hjælp af en celle skraber (Idc'er). Cellerne overføres til et 1,5 mL safelock-rør.<ol>
<li>Cellerne opsamles via centrifugering ved 3390 x g i 1,5 min, og pelleten vaskes én gang ved tilsætning af 1 ml PBS.</li>
		<li>Cellerne i lysis mix, der indeholder 29 μL 2x Roti-belastning, 1 μL 100 mM MgCl2 og 12,5 U/ml benzonase, resuspenderes kraftigt.</li>
		<li>Ved cellelyse og DNA-fordøjelse med benzonase Inkubér prøverne ved 37 °C i 10 minutter. Derefter, denaturere proteinerne ved 95 °C i 10 min.</li>
		<li>Udfør SDS-side-og Western blot-analyser for at verificere protein niveauerne for LC3BI/II, p62, ICP0/5 og GAPDH.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interferens af HSV-1-induceret autophagic flux via elektroporation af Idc'er ved hjælp af FIP200-siRNA
Bemærk: denne protokol for siRNA elektroporation blev modificeret fra prechtel et al. (2007) og gerer et al. (2017).
<ol><li>Overfør Idc'er (12 x 106) på dag 3,5 efter tilslutning til et 50 ml rør. Derefter centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 min., og supernatanten kasseres. Parallelt hermed udføres flow cytometrisk analyse for at overvåge modnings status som beskrevet i trin 2 (brug Life/Dead violet i stedet for CD80-PacBlue).</li>
	<li>Vask forsigtigt Idc'erne i 5 mL OptiMEM uden phenol, og centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 min. kassér supernatanten, og Resuspender forsigtigt idc'erne i 200 ΜL optimem uden phenol, og Juster en celle koncentration på 6 x 106/100 μl. Placer ikke cellerne på is, og undgå temperaturændringer. Bevæge sig hurtigt og undgå lange inkubations perioder af Idc'er i OptiMEM uden phenol rød.</li>
	<li>Overfør enten 75 pmol af FIP200-specifik siRNA eller 75 pmol af røræg siRNA, som en kontrol, til 4 mm elektro kuvetter og tilsæt 100 μl (6x106 celler) af cellesuspensionen. Direkte puls-Idc'er ved hjælp af elektro porationapparatet I, som anvender følgende indstillinger: 500 V for 1 MS.<ol>
<li>Før forsøgs proceduren forberedes siRNA-suspensioner i henhold til fabrikantens instruktion, alikvot og opbevares ved-20 °c. Tø og opbevar dem på is, når du bruger disse siRNAs til elektroporation. Udfør en test puls før elektro porering af prøverne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter elektroporation overføres iDC direkte til 6-brønd plader med frisk præ-varmet DC-medium (suppleret med 40 U/mL GM-CSF og 250 U/mL IL-4). Cellerne i en endelig koncentration på 1 x 106/ml og placeres i en inkubator. Cellerne må ikke skylles ud af elektro kuvetten.</li>
	<li>Efter 48 h, først undersøge morfologien af elektro porterede Idc'er mikroskopisk. Derefter høste cellerne ved hjælp af en celle scrapper og overføre dem til 15 mL rør. Brøndene skylles med 1 mL PBS suppleret med 0,01% EDTA, og opløsningen overføres til de respektive rør.</li>
	<li>Derefter opdeles 6 x 106 idc'er pr. siRNA-tilstand som beskrevet i de næste trin.<ol>
<li>Brug 0,5 x 106 celler til at vurdere modnings status og cellelevedygtighed som beskrevet i trin 2. Brug følgende antistoffer: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 og Life/Dead violet.</li>
		<li>Brug 1 x 106 celler til Western blot-analyser for at verificere FIP200-specifik Knockdown-effektivitet. Overfør og høst cellerne til et 1,5 ml safelock-rør ved centrifugering ved 3390 x g for 1,5 min. Forbered celle lysater som beskrevet i trin 3,4 og Udfør Western blot-analyser.</li>
		<li>Brug de resterende celler (4,5 x 106) til forsøg med HSV-1-infektion. For hver eksperimentel tilstand, Overfør 2,25 x 106 idc'er i 2 ml rør og enten inficere dem med HSV1 på en Moi af 2 eller tilføje mnt buffer som en mock kontrol. Udfør infektionen som beskrevet i trin 3,3.</li>
		<li>Ved 20 HPI, høst cellerne ved hjælp af en celle skraber og forberede celle lysater til Western blot analyser som beskrevet i trin 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. graduering af autophagosome-lysosomal pathway i HSV-1-inficerede Mdc'er ved hjælp af KIF1B/2A-siRNA-elektroporation
<ol><li>Overfør Idc'er (24 x 106) på dag 4 efter tilslutning til et 50 ml rør. Derefter centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 min., og supernatanten kasseres.</li>
	<li>Opsæt forsigtigt (= vask) Idc'er i 8 mL PBS for at justere en endelig celle koncentration på 3 x 106/ml. Overfør 3 x 106 celler til 1,5 ml rør og høst cellerne ved 3390 x g for 1,5 min.</li>
	<li>Gensuspension af Idc'er i 100 μL buffer P3, der indeholder supplement blandingen (i henhold til fabrikantens anvisninger; apparater til elektro portering kit II) og enten (i) 75 pmol af KIF1B-specifik siRNA, (II) 75 pmol af KIF2A-specifik siRNA, eller (III) begge. Brug (IV) den respektive mængde røræg siRNA som et kontrolelement. Forbered to rør til hver siRNA-tilstand (6 x 106 celler), og Overfør suspensionerne til separate elektro kuvetter. Direkte puls-Idc'er, som anvender pulsen "EH-100" ved hjælp af elektroporations apparatet II.<ol>
<li>Før forsøgs proceduren forberedes siRNA-suspensioner i henhold til fabrikantens instruktion, alikvot og opbevares ved-20 °c. Tø og opbevar dem på is, når du bruger disse siRNAs til elektroporation. Anbring ikke Idc'er på is, og undgå temperaturændringer. Gå hurtigt videre, og undgå lang inkubation af Idc'er i PBS eller buffer P3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 500 μL præ-opvarmet RPMI 1640 til elektro kuvetter. Inkubér cellerne i en inkubator i 5-10 min. Overfør Idc'er til 6-brønd plader med frisk forvarmet DC-medium (suppleret med 40 U/mL GM-CSF og 250 U/mL IL-4). Kombiner de respektive forhold i en brønd, frø cellerne i en endelig koncentration på 1 · 106/ml og Placer dem i en inkubator.</li>
	<li>4 h efter inkubation tilsættes modnings cocktailen, der indeholder de cytokiner, der er anført i trin 1.2.2. Bemærk: Forbered en prøve fra ikke-elektro porterede DCs (1 x 106) som kontrol for strømnings cytometriske analyser 2 dage efter elektro portering. Behandl kontrol celler analogt med elektro porterede prøver.</li>
	<li>To dage efter elektro portering, høst celler ved opblanding og overførsel til 15 ml rør. Hullerne skylles med 1 mL PBS, og opslæmningen overføres i de respektive rør. Split 6 · 106 DCS pr. siRNA-tilstand som beskrevet i følgende trin:<ol>
<li>Brug 0,25 x 106 DCS (elektro porated og ikke-elektro porated) til at kontrollere for modning status og cellelevedygtighed som beskrevet i trin 2. Brug følgende antistoffer: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7 og Life/Dead violet.</li>
		<li>Brug 0,75 x 106 celler til Western blot-analyser for at vurdere KIF1B/2a-specifik Knockdown-effektivitet. Cellerne opsamles i et 1,5 ml safelock-rør ved centrifugering ved 3390 x g i 1,5 min. Forbered celle lysater som beskrevet i trin 3,4 og Udfør Western blot-analyser.</li>
		<li>Brug de resterende celler (5 x 106) fra hver siRNA-tilstand, og Udfør HSV-1-infektions forsøg. For hver eksperimentel tilstand, Overfør 2,5 x 106 idc'er i 2 ml rør og enten inficere dem med HSV-1 på en Moi af 2 eller tilføje mnt buffer som en mock kontrol. Udfør infektionen som beskrevet i trin 3,3.</li>
		<li>Ved 20 timer efter infektion, høst cellerne ved opblanding og forberede celle lysater for Western blot analyser for at verificere induktion af HSV-1-induceret autophagic omsætning, som beskrevet ovenfor i trin 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro.">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).</li><li>Kummer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+induces+CD83+degradation+in+mature+dendritic+cells+with+immediate-early+kinetics+via+the+cellular+proteasome.">Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome.</a> Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).</li><li>Kruse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infected+with+herpes+simplex+virus+type+1+exhibit+inhibited+T-cell+stimulatory+capacity.">Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity.</a> Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).</li><li>Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dendritic+cell+maturation+by+herpes+simplex+virus.">Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus.</a> European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).</li><li>Prechtel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+mature+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+dramatically+reduces+lymphoid+chemokine-mediated+migration.">Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration.</a> Journal of General Virology. 86, 1645-1657 (2005).</li><li>Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+induces+rapid+degradation+of+CYTIP,+thereby+modulating+adhesion+and+migration.">Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration.</a> Blood. 118 (1), 107-115 (2011).</li><li>Cohrs, R. J., Gilden, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+herpesvirus+latency.">Human herpesvirus latency.</a> Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).</li><li>Grinde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses:+latency+and+reactivation+-+viral+strategies+and+host+response.">Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response.</a> Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).</li><li>Whitley, R. J., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+infections.">Herpes simplex virus infections.</a> The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).</li><li>Turan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+degradation+of+lamins+facilitates+the+nuclear+egress+of+herpes+simplex+virus+type+1.">Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).</li><li>Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+yeast+demonstrated+with+proteinase-deficient+mutants+and+conditions+for+its+induction.">Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction.</a> The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).</li><li>Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+machinery+and+regulation.">Autophagy: machinery and regulation.</a> Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).</li><li>Bodemann, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RalB+and+the+exocyst+mediate+the+cellular+starvation+response+by+direct+activation+of+autophagosome+assembly.">RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly.</a> Cell. 144 (2), 253-267 (2011).</li><li>Bjorkoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+GABARAP+and+GATE16+localize+to+autophagosomal+membrane+depending+on+form-II+formation.">LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation.</a> Journal of Cell Science. 117, 2805-2812 (2004).</li><li>Pankiv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+binds+directly+to+Atg8/LC3+to+facilitate+degradation+of+ubiquitinated+protein+aggregates+by+autophagy.">p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).</li><li>Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+autophagy+by+lysosomal+positioning.">Regulation of autophagy by lysosomal positioning.</a> Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+quantitative+high-throughput+image+screening+identified+novel+autophagy+modulators.">A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators.</a> Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Cellular+Spheroid-Based+Autophagy+Screen+Applying+Live+Fluorescence+Microscopy+Identifies+Nonactin+as+a+Strong+Inducer+of+Autophagosomal+Turnover.">A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).</li><li>Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+compound+database:+A+resource+connecting+autophagy-modulating+compounds,+their+potential+targets+and+relevant+diseases.">Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases.</a> Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin1+controls+the+levels+of+p53+by+regulating+the+deubiquitination+activity+of+USP10+and+USP13.">Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13.</a> Cell. 147 (1), 223-234 (2011).</li><li>Mauvezin, C., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+disrupts+autophagic+flux+by+inhibiting+both+V-ATPase-dependent+acidification+and+Ca-P60A/SERCA-dependent+autophagosome-lysosome+fusion.">Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion.</a> Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).</li><li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1,+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H(+)-ATPase,+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells.">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li><li>Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mRNA+as+Universal+Technology+Platform+to+Transfect+a+Variety+of+Primary+Cells+with+Antigens+and+Functional+Proteins.">Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).</li><li>Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+knockdown+in+monocyte-derived+dendritic+cells+by+small+interfering+RNA+leads+to+a+diminished+T+cell+stimulation.">CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.</a> The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).</li><li>Pfeiffer, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukoreduction+system+chambers+are+an+efficient,+valid,+and+economic+source+of+functional+monocyte-derived+dendritic+cells+and+lymphocytes.">Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes.</a> Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).</li><li>Villadangos, J. A., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle,+migration+and+antigen+presenting+functions+of+spleen+and+lymph+node+dendritic+cells:+limitations+of+the+Langerhans+cells+paradigm.">Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm.</a> Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).</li><li>Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+on+dendritic+cells:+more+than+just+a+marker+for+maturation.">CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation.</a> Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).</li><li>Yang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+interpretation+of+current+autophagy+inhibitors+and+activators.">Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).</li><li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons.">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biology. 11, 73-81 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+induces+caspase-independent+cell+death+in+hepatocellular+carcinoma+cells+via+targeting+of+autophagy+and+MAPK+pathways.">Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways.</a> Scientific Reports. 6, 37052 (2016).</li><li>Hale, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+modulators+of+autophagic+flux+in+an+image-based+high+content+siRNA+screen.">Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen.</a> Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).</li><li>Lipinski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+reveals+multiple+mTORC1+independent+signaling+pathways+regulating+autophagy+under+normal+nutritional+conditions.">A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions.</a> Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).</li><li>Orvedahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+genome-wide+siRNA+screen+identifies+selective+autophagy+factors.">Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors.</a> Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).</li><li>Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+autophagy+by+shRNA+knockdown:+cautions+and+recommendations.">Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations.</a> Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+modulates+p53+activity+to+regulate+cell+cycle+and+survival+during+metabolic+stress.">Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress.</a> Science. 336 (6078), 225-228 (2012).</li><li>Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin-1+is+required+for+chromosome+congression+and+proper+outer+kinetochore+assembly.">Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly.</a> EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).</li><li>Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+behind+autophagy:+the+unconventional+roles+of+ATG+proteins.">Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins.</a> Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).</li><li>Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+divergent+functions+of+Beclin+1+and+Beclin+2.">Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2.</a> Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Anvendelsesområdet for denne protokol omfatter (i) håndtering af humane mono byte-afledte Idc'er samt Mdc'er, (II) deres infektion med HSV-1, (III) deres behandling med forbindelser, der vides at hæmme autophagy, og (IV) deres elektroporation med siRNA ved hjælp af to forskellige tekniske opsætninger. Ved hjælp af denne protokol kan autophagic flux enten blokeres i HSV-1-inficerede Idc'er eller induceret i HSV-1-inficerede Mdc'er.
Da DCs, og især Idc'er, er meget sårbare celler, involverer arbejdet med disse celler temmelig sarte trin. Til DC generation anbefaler vi at bruge frisk isolerede PBMCs, og for at undgå deres Kryopreservation, for at opnå højere celle udbytter. Ved håndtering af Idc'er under forsøg, herunder efterfølgende dyrkning, forhindres barske eller langvarige temperaturændringer desuden. Ellers kan Idc'er gennemgå fænotypiske ændringer, og det er derfor nødvendigt at verificere deres umodne fænotype ved flow cytometri. Bemærk, i modsætning til deres modne modparter, idc'er mangler særskilte markører, såsom CD80, CD83, og CD8628,29. Infektionen af idc'er og mdc'er med HSV-1 er en veletableret metode2,3,4,5,6,10. Vi og andre viste, at DCs er meget modtagelig for HSV-1-infektion, når der er anvendt et MOI på 1 eller 2 (figur 2). I vores hænder, at holde volumen af infektionen medium ved lave niveauer (1-3 x 106 celler i 250-350 μl) vil føre til bedre smitte effektivitet.
En klassisk tilgang til at blande sig med en given særskilt cellulære pathway er brugen af specifikke forbindelser. En række forskellige modulatorer af autophagy, dvs aktivatorer såvel som hæmmere, er i øjeblikket tilgængelige30. Med hensyn til HSV-1-induceret autophagy i DCs, Turan et al., (2019) for nylig viste de hæmmende virkninger af spautin-1 og bafilomycin-a1 (BA1) på autophagic omsætning i iDCs10. Denne teknik til autophagy hæmning er egnet til kombinationen med en efterfølgende HSV-1 infektion, da hverken infektionen sats eller modning status af DCs (især Idc'er) er forringet. I fremtidige anvendelser, denne inhibitor-baserede tilgang kan anvendes også i kombination med andre smitsomme agenser, stress betingelser, såsom sult, samt for forskellige celletyper. Ved anvendelse af inhibitorer opstår der imidlertid begrænsninger ved bestemmelsen af den passende koncentration til effektiv autophagy hæmning uden at påvirke cellernes levedygtighed alvorligt. Den største begrænsning ved brug af inhibitorer er imidlertid forekomsten af potentielle off-Target eller negative virkninger, hvilket kan føre til misvisende resultater31,32.
Den anden tilgang til at blande sig i autophagy, der er omfattet af denne protokol, er den specifikke Knockdown ved hjælp af siRNA33,34,35. På den ene side brugte vi elektroporations apparatet i til specifikt at afsmelte udtrykket FIP200 og derved hæmme HSV-1-induceret autophagisk omsætning i idc'er. På den anden side, vi tavshed to forskellige KIF proteiner (dvs., KIF1B og KIF2A), ved hjælp af elektro poration apparat II, at lette autophagic flux i HSV-1-inficerede mDCs. Begge elektro poration protokoller resulterede i en næsten fuldstændig ablation af FIP200 i Idc'er, og KIF1B/KIF2A i mDCs, som blev verificeret via Western blot analyser (figur 4a, figur 5a). I modsætning til elektroporations apparatet i, som ikke påvirker DCs ' levedygtighed, medfører elektro portering af Mdc'er, der anvender elektro porations apparatet II, lidt højere rater af døde celler (figur 4b, figur 5b ). Derfor, i fremtidige applikationer, den elektro poration apparat jeg bør fortrinsvis anvendes til både iDCs og mDCs. Bemærkelsesværdigt, både siRNA-baserede teknikker, at moduere autophagic flux, er kompatible med efterfølgende HSV-1 infektion af enten Idc'er eller Mdc'er. Endvidere, hverken den umodne fænotype af Idc'er eller den modne fænotype af Mdc'er er ændret post elektro poration.
Elektroporation af Idc'er ved hjælp af FIP200-specifik siRNA er en effektiv og meget specifik metode til gen-Knockdown samt hæmning af autophagic flux ved HSV-1-infektion. Ud over den specifikke hæmning af FIP200, denne protokol kan tilpasses til at lukke munden på andre autophagic komponenter, der deltager på forskellige trin under autophagic kaskade. Men at identificere det passende mål for effektiv siRNA-medieret hæmning af autophagy omfatter flere aspekter af bekymring. For det første er Knockdown effektivitet af autophagy-relaterede gener (ATG) ikke nødvendigvis positivt korreleret med effektiv hæmning af autophagy og er stærkt afhængig af det specifikke ATG-protein, der er lyddæmpet36. For det andet, særskilte ATG proteiner er desuden involveret i veje adskiller sig fra autophagy, således deres ablation kunne også føre til bivirkninger37,38,39. For det tredje kan forskellige Atg'er have overflødige funktioner, og derfor er det ikke nok med et Knockdown af en komponent at hæmme autophagy (f. eks. beclin-1 og beclin-2)40.
Desuden er det elektro porations apparat I-baserede elektroporations protokol af DCs også egnet til mRNAs, og kan anvendes til en række yderligere primære celletyper, såsom PBMCs25. Dette system giver således en generel strategi for at levere særskilte RNA-arter til forskellige primære celletyper. Afslutningsvis præsenterer vi to protokoller til at hæmme autophagic flux, ved enten at bruge en inhibitor-eller siRNA-baserede tilgang kombineret med efterfølgende HSV-1 infektion af Idc'er. Desuden beskriver vi en siRNA-elektroporations tilgang for at inducere autophagic flux i Mdc'er ved HSV-1-infektion.

Generering af humane mono byte-afledte dendritiske celler (DCs) udgør en passende in vitro-model til at studere funktioner og biologi af denne vigtige immuncelle type. Isolation og differentiering af monocytter i DCS har været veletableret i de seneste år1,2. Infektionen af DCS med α-herpesvirus herpes simplex virus type-1 (HSV-1) fungerer som et model system til at studere HSV-1-medierede modulationer af DC biologi2,3,4,5,6 . Dette er især vigtigt at belyse, hvordan herpesvira dæmpe eller hæmme potent antiviral immunrespons, at etablere ventetid i immun-privilegerede nicher inde i værten7,8. I denne henseende er herpesvira meget vellykkede patogener, der er udbredt i hele befolkningen nå en sero-prævalens på op til 90% i henhold til den geografiske region9. At forstå og muligvis forhindre dette, mere indsigt i HSV-1-mediated modulationer af værtens immunsystem, og især af immunceller som DCs, er påkrævet.
En helt ny observation vedrørende samspillet mellem DCs og HSV-1 blev for nylig udgivet af Turan et al.10. Forfatterne viste, at udførelsen af HSV-1 replikation er strengt afhængig af modnings status af DCs. I Idc'er, er komplet replikering af HSV-1 lettes ved autophagy-afhængige mekanismer. Mens HSV1 inducerer autophagy i både Idc'er og Mdc'er, observeres autophagic flux kun i Idc'er. Dette letter til gengæld nukleare udgang af virale capsid'er via autophagic nedbrydning af nukleare laminer i Idc'er. For at få mekanistisk indsigt i denne HSV-1-inducerede nedbrydnings pathway i Idc'er versus Mdc'er er nye og effektive strategier afgørende for at undersøge autophagic flux.
Macroautophagy (autophagy) er en velbevaret Step-proces, der er rettet mod intracellulære proteiner eller hele organeller til lysosomale fordøjelse11. Simplistisk kan autophagy opdeles i (i) initiering, (II) membran nukleation, (III) vesikel ekspansion, og (IV) autophagosome-lysosome fusion fase12. Under initiering (i) er komponenter som det aktiverede ULK1/2 kinase-kompleks, der indeholder det fokale adhæsion kinase-familie interagerende protein på 200 kD (FIP200), afgørende for at aktivere beclin-1-Vps34-AMBRA1-komplekset. Efterfølgende membran nukleation (II) initierer phagophore formation13, som opsluger cytoplasmiske Cargos, der er præget af molekyler som p6214. Under vesikelprotein ekspansion og autophagophore modning (III) microtubule-associeret protein lyskæde 3 (LC3)-Jeg omdannes til sin lipideret form LC3-II, der er indsat i autophagosomal membran. Således er LC3-i til-II omregningskurser en indikator for autophagy induktion ved at spejle dannelsen af modne autophagosomes15,16. Ved autophagonogle-lysosome fusion (IV), ikke kun autophagic Cargo, men også tilhørende p62 og LC3-II proteiner undergår nedbrydning (f. eks, ved hydrolyse). Således tjener tab af p62 og LC3-II som markører for autophagic flux17. Fusionen af autophagosomer med lysosomer, og dermed efter autophagic omsætning, er meget afhængig af den intracellulære lysosomale lokalisering. Dette er blandt andet reguleret af kinesin familiemedlemmer KIF1B og KIF2A, som har vist sig at have en negativ indvirkning på autophagosome-lysosome fusion18. Interessant, protein ekspression af KIF1B og KIF2A induceres ved DC modning og er dermed ansvarlig for ineffektiv autophagic flux i HSV-1-inficerede mDCs, som hæmmer komplet HSV-1 replikation10.
Eksperimentelle forsøg på at modutere autophagy omfatter brugen af forbindelser kendt for at inducere eller hæmme denne særlige vej19,20,21. I denne undersøgelse beskriver vi to inhibitor-baserede strategier til at blokere autophagic omsætning i HSV-1-inficerede Idc'er. Det første stof, der anvendes i vores eksperimenter er specifik og potent autophagy inhibitor-1 (spautin-1), som blev beskrevet for at fremme beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks nedbrydning under Initierings fasen af autophagy22. Det andet stof, der anvendes i nærværende undersøgelse, er bafilomycin-a1 (BA1), en V-ATPase-hæmmer, der blokerer for de sene autophagiske hændelser (dvs. autophagosome-lysosome fusion samt autolysosome forsuring)23,24. Brugen af en af disse to hæmmere forud for iDC infektion med HSV-1 potent hæmmer autophagy, men forstyrrer ikke effektivt viral Gen ekspression. Således, denne inhibitor-baserede strategi forud for HSV-1 infektion tilbyder et kraftfuldt værktøj til at hæmme HSV-1-induceret autophagic flux, der nemt kan udvides til en overflod af forskellige celletyper og vira, som også potentielt fremkalde autophagy.
For at overvinde en stor ulempe ved en inhibitor-baseret tilgang (dvs. uspecifik off-Target effekter), vi udviklet en siRNA-baserede metode til at blokere autophagic flux i (HSV-1-inficerede) idc'er. SiRNA electroporations teknikken er en kraftfuld alternativ strategi via selektiv ablation af ekspression af forskellige proteiner (dvs. autophagic-komponenter). I vores eksperimenter blev Idc'er elektroporeret med FIP200-specifik siRNA ved hjælp af elektroporations apparatet I (Se tabel over materialer) og en modificeret protokol beskrevet af gerer et al. (2017) og Prechtel et al. (2007) for at hæmme autophagy under indledende fase25,26. Denne teknik tillod os at specifikt Knockdown FIP200 udtryk i Idc'er, uden at forstyrre cellernes levedygtighed og deres umodne fænotype to dage efter elektroporation. Bemærkelsesværdigt, HSV-1 infektion blev etableret i disse elektro porterede Idc'er spejlet af effektiv viral protein udtryk. Denne siRNA-baserede teknik giver en unik fordel (dvs. at en række forskellige autophagic komponenter, selv i kombination), kan være specifikt rettet mod ablation af deres udtryk.
I denne undersøgelse beskriver vi yderligere en siRNA-baseret metode til at inducere autophagic flux også i HSV-1-inficerede Mdc'er. I dette tilfælde blev Idc'er elektroporeret med siRNA rettet mod KIF1B og KIF2A før DC modning ved hjælp af elektro porations apparatet II (Se tabel over materialer). Da begge proteiner er upregulated under DC modning og kendt for at negativt regulere fusion af autophagosomer med lysosomer10,18, deres Knockdown kraftigt induceret autophagic flux i mdcs ved HSV-1 infektion. Den siRNA-baserede teknik gjorde det således muligt for os specifikt at fremkalde autophagisk omsætning via indblanding i KIF protein ekspression i Mdc'er og dermed kunne efterligne deres ekspressionsniveauer i Idc'erne.
Sammenfattende præsenterer vi to forskellige metoder til at hæmme autophagic flux i HSV-1-inficerede Idc'er. Mens den første inhibitor baserede tilgang udgør en nem, billig og hurtig måde at forstyrre autophagisk nedbrydning på, er den anden siRNA-baserede teknik mere specifik og en meget velegnet metode til at understøtte og verificere resultaterne af inhibitor baserede Eksperimenter. Derudover beskriver vi en metode til at inducere autophagic flux også i HSV-1-inficerede Mdc'er, via siRNA-mediated Knockdown af to KIF proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB-Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Dendritic cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>9007281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Western Blot Detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7074</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>tlrl-baf1</td>
			<td>inhibition of autophagy and lysosomal degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Chamber Fastblot B44</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>557648</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: G043H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>561692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: B-ly6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555398</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (mouse, FITC)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555332</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 (mouse, V450)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>560442</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: L307.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 (mouse, APC)</td>
			<td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>17-0839-41</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: HB15e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>553692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging</td>
			<td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIP200 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>12436</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D10D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (mouse)</td>
			<td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB2302</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:5000 
			Clone: MAB374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td>
			<td>BioRad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>165-2112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF (4x104 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA&#8208;DR (mouse, APC-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>307618</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td>
			<td>BioVex</td>
			<td></td>
			<td>DC infection 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP0 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 11060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP5 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-56989</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946; (0.1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1404-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF1B (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-376246</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: E-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF2A (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-271471</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>3868</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>L34964</td>
			<td>L/D staining in Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td>
			<td>04-03-9391/01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 2.0 RS</td>
			<td>Heraeus (Hanau, Germany)</td>
			<td>75015505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Brand (Wertheim, Germany)</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td>
			<td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p62 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>88588</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D5L7G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16 %</td>
			<td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectSpin 24 Plus</td>
			<td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td>
			<td>C2500-R-PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (1 mg/mL)</td>
			<td>Pfizer (Berlin, Germany)</td>
			<td>BE130681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel system MiniProtean II</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>1652960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform wt 15</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>042-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A151.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1 (4x)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>K929.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; (10 &#956;g/mL)</td>
			<td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 0.2 &#956;m nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>10600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td>
			<td>3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) inducerer autophagy i begge, umodne dendritiske celler (Idc'er) samt modne dendritiske celler (mDCs), hvorimod autophagic flux kun observeret i Idc'er. For at opnå mekanistisk indsigt udviklede vi effektive strategier til at forstyrre HSV-1-induceret autophagic omsætning. En inhibitor-baseret strategi, at moduere HSV-1-induceret autophagy, udgør det første valg, da det er en nem og hurtig metode. For at omgå potentielle uspecifikke off-Target effekter af sådanne forbindelser, vi udviklet en alternativ siRNA-baserede strategi, at moduere autophagic omsætning i Idc'er ved HSV-1 infektion. Faktisk, elektroporation af idc'er med FIP200-specifikke siRNA før HSV-1 infektion er en meget specifik og vellykket metode til at afsmelte FIP200 protein ekspression og dermed hæmme autophagic flux. Begge præsenterede metoder resulterer i en effektiv hæmning af HSV-1-induceret autophagisk omsætning i Idc'er, hvorved siRNA-baserede teknik er mere målspecifik. En yderligere siRNA-baseret tilgang blev udviklet til selektivt at dæmpe protein ekspression af KIF1B og KIF2A, hvilket letter autophagisk omsætning ved HSV-1-infektion i Mdc'er. Afslutningsvis, teknikken med siRNA elektroporation repræsenterer en lovende strategi, selektivt at afsmelte udtrykket af forskellige proteiner og til at analysere deres indflydelse på en HSV-1 infektion.

I dette manuskript beskriver vi metoder til at forstyrre HSV-1-induceret autophagy i dendritiske celler. Dette omfatter generering af humane mono byte-afledte Idc'er og Mdc'er, som var phenotypisk analyseret ved flowcytometri (figur 1). På dag 4 post tilslutning, DCs viser en umoden fænotype karakteriseret ved svage udtryk for CD80, CCR7, og CD83 samt høj CD11c og mellemliggende MHCII udtryk. Da CD3 og CD14 signaler mangler, kan T-celle-og monocyt-forureninger udelukkes. På dag 6 efter tilslutning (dvs. dag 2 post induktion af modning), DCs viser en moden fænotype afspejles af en signifikant stigning i CD80, CCR7, CD83, og MHC-II overflade udtryk. Infektion med en eGFP-udtrykker HSV-1 stamme (figur 2) resulterer i en næsten fuldstændig infektion af enten Idc'er (figur 2a øvre panel) eller mdcs(figur2a lavere panel, figur 2B), baseret på stærke GFP-signaler analyseret ved Fluorescens mikroskopi samt flow cytometri.
Som det fremgår af vores nylige rapport, inducerer HSV-1 autophagy både i Idc'er og Mdc'er, men autophagic omsætningen forekommer kun i Idc'er10. I en første tilgang behandlede vi Idc'er og Mdc'er med spautin-1 (figur 3a)-til at blokere autophagy initiering-eller bafilomycin-a1 (BA1; Figur 3B)-til at hæmme de endelige autophagonogle-lysosome fusion. Ved HSV-1-infektion af Idc'er i fravær af spautin-1 og BA1 afspejles autophagic flux af nedgangen i henholdsvis p62 og LC3B udtryk. I modsætning hertil påvirker HSV-1-infektion med Mdc'er i fravær af spautin-1 ikke p62 ekspression, mens spautin-1 og BA1 behandling inducerer en ophobning af LC3B-II. Dette afspejler induktion af autophagy, men en fiasko af autophagic omsætning i mDCs. I Idc'er genopretter spautin-1 forbehandling kraftigt autophagic nedbrydning af p62 ved HSV-1 infektion, på grund af hæmning af autophagy i Initierings fasen. Ved forbehandling med BA1 viser mock-og HSV-1-inficerede Idc'er en stærk ophobning af LC3B-II-protein niveauer, hvilket indikerer en vellykket hæmning af autophagisk omsætning via blokering af sen autophagosome-lysosomfusion. I overensstemmelse med dette resulterer spautin-1 og BA1 forbehandling af Mdc'er også i stabile p62 og forhøjede LC3B-II protein niveauer.
I en anden metode til at forringe autophagic flux undersøges siRNA elektroporation FIP200 med hensyn til dens evne til at blokere autophagic flux i HSV-1-inficerede idc'er. Som vist i figur 4A, stærkt reduceret FIP200 protein niveauer blev påvist i IDCs 48 h post elektro poration, sammenlignet med kontrol siRNA. På dette tidspunkt viser Idc'erne ingen tegn på celledød (figur 4B) og bevarer deres umodne fænotype (figur 4C). Infektion af FIP200-lyddæmpet Idc'er med HSV-1 afslører et stærkt fald i autophagic flux sammenlignet med deres kontrol siRNA-behandlede modparter (figur 4D). Dette er ledsaget af øget protein niveauer af LC3B samt p62, når FIP200 er lyddæmpet i HSV-1-inficerede Idc'er.
I et omvendt forsøg har vi undersøgt, om siRNA-medieret ablation af KIF1B og KIF2A protein ekspression muliggør autophagosomal-lysosomal omsætning også i HSV-1-inficerede Mdc'er. Derfor blev Idc'er elektroporerede ved hjælp af specifikke siRNAs, der var rettet mod enten et eller begge af disse proteiner, og cellerne blev efterfølgende modnet (figur 5). 2 dage efter elektro portering viser mDCs en kraftig reduktion i KIF1B og/eller KIF2A protein ekspression, når der er anvendt specifikke siRNAs (figur 5a). Denne metode førte heller ikke til fremtrædende celledød (figur 5B) eller til ændringer i deres fænotypiske modnings status (figur 5C). Understøtte betydningen af KIF1B og KIF2A under autophagosomal-lysosomal nedbrydning, deres nedbrydning før HSV-1 infektion letter en øget autophagic flux i mDCs. Dette afspejles af reducerede rest p62 protein niveauer, i modsætning til den respektive kontroltilstand (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg"> Figur 1: fænotypisk karakterisering af humane monocytter-afledte Idc'er og Mdc'er ved hjælp af flow cytometri. DCs blev genereret og plettet med specifikke antistoffer for at verificere deres renhed: (A) CD3 at udelukke T-celle forureninger, (B) CD14 at udelukke kontaminering med monocytter, og (C) CD11c som markør for DCS. For at vurdere deres fænotypiske modnings status blev følgende antistoffer anvendt: (D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83, og (G) mhcii. Disse molekyler udtrykkes i høj grad på Mdc'er og tillader således diskrimination mellem den umodne og modne DC-fænotype. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg"> Figur 2: mikroskopiske og flow cytometriske analyser af HSV-1-inficerede idc'er og Mdc'er. Idc'er og Mdc'er blev inficeret med en HSV-1-stamme, der udtrykker EGFP (HSV-1 EGFP), for at muliggøre kvantificering af infektions hastigheden baseret på GFP-signalet. A) mikroskopiske analyser af gfp-positive HSV-1-inficerede idc'er og mdc'er, der er inficeret med et moi på 2, sammenlignet med deres ikke-inficerede modparter, ved 24 HPI. For at visualisere inficerede celler blev GFP fluorescens overvåget. Scale bar repræsenterer 400 μm.B) flow cytometrisk måling af mock-eller HSV-1-inficerede mdc'er under infektions kinetikken. Øvre paneler (sort foret histogrammer) viser mock tilstand, lavere paneler (sort fyldte histogrammer) viser HSV-1-inficerede celler efter de angivne tidspunkter post infektion. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg"> Figur 3: Spautin-1 og b afilomycin-a1 moduere autophagic flux i HSV-1-inficerede Idc'er. Idc'er og Mdc'er blev behandlet med (A) spautin-1 eller (B) Bafilomycin-a1 (BA1) i 1 time før infektion. Celler blev efterfølgende mock-eller HSV-1-inficeret (HSV1-RFPVP26) ved hjælp af en MOI af 2. Efter 16-18 h, DCS blev høstet og protein lysater blev udsat for vestlige blotting at bestemme ekspression af p62 eller LC3B-I/-II som autophagic markører, ICP0 som infektion kontrol, og gapdh som lastning kontrol. LC3B-I-og LC3B-II-protein niveauerne blev kvantificeret og normaliseret til referenceproteinet GAPDH med Bio1D (optisk tæthed). Forholdet mellem normaliseret LC3B-II og normaliseret LC3B-I-signaler vises. Dette tal er blevet ændret og tilpasset fra © 2019 Turan et al. oprindeligt offentliggjort i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg"> Figur 4: analyse af autophagic flux i HSV-1-inficerede Idc'er ved FIP200-siRNA elektroporation. Idc'er blev elektroporeret med kontrol siRNA eller FIP200-specifik siRNA ved hjælp af elektro porations apparatet I. (a) DCS blev analyseret med hensyn til effektiviteten af FIP200 knockdown 48 h post elektroporation ved at udføre Western blot-analyser. (B) cellelevedygtighed samt (C) modnings status blev analyseret før elektroporation (lyseblå histogrammer) og 48 h post (mørkeblå og grå histogrammer) elektroporering ved flow cytometri. Median værdier for tre forskellige donorer vises. Efter at have bekræftet effektiv Knockdown af FIP200 og den umodne fænotype, celler var HSV-1-inficerede (HSV-1 EGFP) ved hjælp af en MOI af 2. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express 5,0. (D) ved 20 h post infektion, celler blev udsat for vestlige blot analyser til at bestemme udtryk for LC3B-I/-II og p62 som autophagic markører. ICP5 blev detekteret som infektionskontrol, og GAPDH som loading Control. Paneler A og D er blevet modificeret og tilpasset fra © 2019 Turan et al. oprindeligt udgivet i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg"> Figur 5: siRNA-mediated ablation af KIF1B og/eller KIF2A modulerer autophagic omsætning i HSV-1-inficerede Mdc'er. Idc'erne blev elektro porteret med KIF1B-specifik og/eller KIF2A-specifik siRNA, samt kontrol siRNA, ved hjælp af elektroporations apparatet II. Ved 4 h post elektro poration, modning blev induceret via tilsætning af en modning cocktail. Ved 48 h post elektroporation blev DCs analyseret med hensyn til (A) effektiviteten af KIF Knockdown via Western blotting, (B) cellelevedygtighed samt deres (C) fænotypiske modnings status ved hjælp af flow cytometriske analyser (to forskellige donorer vises). "w/o EP" betyder uden elektroporation, men efter induktion af modning; "post Control EP" betyder post-elektro portering ved hjælp af kontrol siRNA; "post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP" betyder post-elektro portering ved hjælp af KIF1B-og/eller KIF2A-specifik siRNA. Efter at have bekræftet effektiv Knockdown af KIF1B og/eller KIF2A og den modne fænotype, celler var HSV-1-inficerede (HSV-1 EGFP) ved hjælp af en MOI af 2. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express 5,0. (D) celler blev udsat for Western blot analyser 20 h post infektion, for at vurdere ekspression af p62 som en autophagic markør. ICP5 blev brugt som en infektion kontrol, og GAPDH som lastning kontrol. Figur A og D er blevet ændret og tilpasset fra © 2019 Turan et al. oprindeligt offentliggjort i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

I denne undersøgelse præsenterer vi inhibitor-og siRNA-baserede strategier for at forstyrre autophagic flux i herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-inficerede monocyte-afledte dendritiske celler.

siRNA elektroporation at Modutere Autophagy i herpes simplex virus type 1-inficerede Monocyte-afledte dendritiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Vores protokol beskriver metoder til effektivt at forstyrre HSV-1 induceret autofagic omsætning i dendritiske celler. Og især sammenligner vi en inhibitorbaseret med en siRNA-baseret strategi om at blokere autofagi før infektion. Mens den inhibitorbaserede interferens med autofagi omfatter potentielle og specifikke off-target effekter, vores udviklede siRNA-baserede strategi er mere målrettet specifik.Det er vigtigt, at begge præsenterede teknikker ikke påvirker sygdomsmodningsstadiet. Demonstration af proceduren vil være Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, og Alexandra Duthorn, en grad studerende, fra mit laboratorium. Begynd med at høste umodne proteseceller eller idC'er ved forsigtigt at skylle de løstklæbende celler fra bunden af cellekulturkolben på dag fire efter klæbende.Tilføj modning cocktail til cellerne til at generere modne dendritiske celler eller mDCs. To dage efter induktion af modning skylles mDCs fra bunden af cellekulturkolben. Skylningen gentages to gange, og id-erne og mDC'erne overføres derefter til 50 milliliterrør i deres respektive kulturmedium.Høst cellerne via centrifugering ved 300 gange g i fem minutter. Cellerne skal forsigtigt opslænnes i fem til 10 milliliter RPMI 1640 pr. cellekulturkolbe og kombinere de respektive DC-suspensioner i et rør. Derefter kvantificere cellerne ved hjælp af et tællekammer og sørg for at undgå temperaturændringer ved håndtering af DCs.Overfør to millioner id'er eller mDCs i et to milliliterrør, centrifugeres ved 3, 390 gange g i 1-1/2 minut og kassér supernatanten. Forsigtigt resuspenderede cellerne i infektion medium. Hæms den autophagosomale lysosomal nedbrydningsvej ved at tilføje 10 micromolar spautin-1 eller en mikromolar bafilomycin A1 til infektionsmediet en time før infektion.Tilføj DMSO til ubehandlet kontrol og inkuber cellerne på en varmeblok ved 37 grader Celsius med omrystning ved 300 omdr./min. For infektionsundersøgelser skal cellerne vaccineres med HSV-1 virioner ved en mangfoldighed af infektion på to. Tilsæt den respektive volumen af MNT buffer som en mock kontrol og inkubere cellerne på en varmeblok ved 37 grader Celsius i en time med omrystning.En time efter infektion, indsamle cellerne via centrifugering på 3, 390 gange g i 1-1/2 minutter, derefter aspirere inoculum forsigtigt og resuspend cellerne i DC medium. Frø mock behandlet og HSV-1 inficerede celler ved en endelig koncentration af en million celler pr milliliter i en seks-brønd plade. Ved 16 til 24 timer efter infektion, høst idc'er ved hjælp af en celle skraber eller mDCs ved skylning, overføre cellerne til en 1,5 milliliter sikker lås rør og indsamle dem via centrifugering på 3, 390 gange g i 1-1/2 minutter.Gentag høst og centrifugering med de resterende celler i brøndene, vask derefter pellet én gang med en milliliter PBS og kraftigt resuspend cellerne i lysis mix. Inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i 10 minutter og varm derefter til 95 grader Celsius i 10 minutter. Udfør SDS-side- og western blot-analyse for at kontrollere LC3B1- og LC3B2-, P62-, ICP0- og ICP5- og GAPDH-proteinniveauerne.På dag 3,5 efter overholdelse, overføre 12 millioner id'er i en 50 milliliter rør, centrifuge dem på 300 gange g i fem minutter, og derefter kassere supernatant. Parallelt hermed udføres flowcytometrisk analyse for at overvåge modningsstatus. IdC'erne vaskes forsigtigt i fem milliliter Opti-MEM uden fenolrød og centrifugeres ved 300 gange g i fem minutter.Kassér supernatanten og opslæmm cellerne i 200 mikroliter af Opti-MEM, der justerer cellekoncentrationen til seks millioner celler pr. 100 mikroliter. Der tilsættes 75 picomoler af enten FIP200 specifikke eller rørægte siRNA til fire millimeter elektroklytter og overføre 100 mikroliter af cellesuspensionen til den respektive kuvette. Pulser direkte id'erne ved hjælp af et elektroporationsapparat.Efter elektroporation overføres iDC'erne til seks-brøndplader med frisk forvarmt DC-medium, såning cellerne i en endelig koncentration på en million celler pr. milliliter og læg dem i inkubatoren. Efter 48 timer undersøges morfologien af de elektroporerede idC'er mikroskopisk, derefter høste cellerne med celleskraberen og overføre dem til 15 milliliterrør. Skyl brøndene med en milliliter PBS suppleret med 0,1% EDTA og overfør opløsningen til de respektive rør.Derefter opdeles cellerne for hver siRNA-tilstand som beskrevet i manuskriptet. Brug 500,000 celler til at vurdere modningsstatus og celle levedygtighed, bruge en million celler til western blot analyse for at kontrollere FIP200 specifikke knockdown effektivitet og bruge de resterende celler til HSV-1 infektion eksperimenter. De genererede idC'er og mDC'er blev fænotopypisk analyseret ved flowcytometri for at udelukke kontaminering med andre celletyper og for at kontrollere deres modningsstatus.Cellerne blev plettet med CD3 og CD14 antistoffer for at udelukke henholdsvis T-celle- og monocytforurening. Cellerne blev plettet for CD11c, der tjener som en højt udtrykt generel markør for DC'er. For at vurdere modningsstatus blev CD80,CCR7, CD83 og MHCII-antistoffer anvendt, fordi disse molekyler er meget udtrykt på modne DC'er.Fluorescensmikroskopi og flowcytometri blev anvendt til at bestemme infektion med EGFP, der udtrykte HSV-1. Stærke GFP-signaler indikerer næsten fuldstændig infektion af idC'er og mDC'er. Western blot analyse blev brugt til at afgøre, om spautin-1 eller bafilomycin A1 hæmmer autofagisk flux i HSV-1 inficerede celler.I IDC'er påvises autofagisk flux ved faldet i P62- og LC3B-udtrykket i mangel af henholdsvis spautin-1 og bafilomycin A1. I modsætning hertil påvirker HSV-1-infektion af mdcs i mangel af spautin-1 ikke P62-udtrykket, mens spautin-1- og BA1-behandling medførte en akkumulering af LC3B-II, som afspejler induktionen af autofagi, men en fejlslagen autofaseomsætning i mDC'er. Reduktion af FIP200 proteinniveauer med siRNA-elektroporation forårsager også et kraftigt fald i autofag flux i HSV-1-inficerede idC'er.Denne siRNA-baserede elektroporationsprotokol til hæmning af autofagi påvirker ikke cellernes levedygtighed, billedets fænotype eller etableringen af HSV-1 proteinudtryk i iDC'er. Vores elektroporationsprotokoller giver mulighed for at levere forskellige DNA- eller RNA-arter til sygdom og andre primære celletyper. Efterfølgende kan der udføres en række molekylære, funktionelle og infektionsanalyser.Den siRNA-baserede strategi for ekspressionshæmning ved sygdom baner vejen for at udforske funktionen af ethvert protein af interesse, også kombineret med efterfølgende funktionelle analyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Tidsmæssig analyse af nukleare til cytoplasmatisk omplantning af en Herpes Simplex Virus 1 Protein af immunfluorescent konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Porcine Hornhin Tissue Explant at studere effekten af Herpes Simplex Virus-1 Antivirale lægemidler

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Vækst, rensning og titrering af oncolytic Herpes Simplex Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing af herpes Simplex vira

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...