siRNA elektroporation at Modutere Autophagy i herpes simplex virus type 1-inficerede Monocyte-afledte dendritiske celler

Vores protokol beskriver metoder til effektivt at forstyrre HSV-1 induceret autofagic omsætning i dendritiske celler. Og især sammenligner vi en inhibitorbaseret med en siRNA-baseret strategi om at blokere autofagi før infektion. Mens den inhibitorbaserede interferens med autofagi omfatter potentielle og specifikke off-target effekter, vores udviklede siRNA-baserede strategi er mere målrettet specifik.

Det er vigtigt, at begge præsenterede teknikker ikke påvirker sygdomsmodningsstadiet. Demonstration af proceduren vil være Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, og Alexandra Duthorn, en grad studerende, fra mit laboratorium. Begynd med at høste umodne proteseceller eller idC'er ved forsigtigt at skylle de løstklæbende celler fra bunden af cellekulturkolben på dag fire efter klæbende.

Tilføj modning cocktail til cellerne til at generere modne dendritiske celler eller mDCs. To dage efter induktion af modning skylles mDCs fra bunden af cellekulturkolben. Skylningen gentages to gange, og id-erne og mDC'erne overføres derefter til 50 milliliterrør i deres respektive kulturmedium.

Høst cellerne via centrifugering ved 300 gange g i fem minutter. Cellerne skal forsigtigt opslænnes i fem til 10 milliliter RPMI 1640 pr. cellekulturkolbe og kombinere de respektive DC-suspensioner i et rør. Derefter kvantificere cellerne ved hjælp af et tællekammer og sørg for at undgå temperaturændringer ved håndtering af DCs.

Overfør to millioner id'er eller mDCs i et to milliliterrør, centrifugeres ved 3, 390 gange g i 1-1/2 minut og kassér supernatanten. Forsigtigt resuspenderede cellerne i infektion medium. Hæms den autophagosomale lysosomal nedbrydningsvej ved at tilføje 10 micromolar spautin-1 eller en mikromolar bafilomycin A1 til infektionsmediet en time før infektion.

Tilføj DMSO til ubehandlet kontrol og inkuber cellerne på en varmeblok ved 37 grader Celsius med omrystning ved 300 omdr./min. For infektionsundersøgelser skal cellerne vaccineres med HSV-1 virioner ved en mangfoldighed af infektion på to. Tilsæt den respektive volumen af MNT buffer som en mock kontrol og inkubere cellerne på en varmeblok ved 37 grader Celsius i en time med omrystning.

En time efter infektion, indsamle cellerne via centrifugering på 3, 390 gange g i 1-1/2 minutter, derefter aspirere inoculum forsigtigt og resuspend cellerne i DC medium. Frø mock behandlet og HSV-1 inficerede celler ved en endelig koncentration af en million celler pr milliliter i en seks-brønd plade. Ved 16 til 24 timer efter infektion, høst idc'er ved hjælp af en celle skraber eller mDCs ved skylning, overføre cellerne til en 1,5 milliliter sikker lås rør og indsamle dem via centrifugering på 3, 390 gange g i 1-1/2 minutter.

Gentag høst og centrifugering med de resterende celler i brøndene, vask derefter pellet én gang med en milliliter PBS og kraftigt resuspend cellerne i lysis mix. Inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i 10 minutter og varm derefter til 95 grader Celsius i 10 minutter. Udfør SDS-side- og western blot-analyse for at kontrollere LC3B1- og LC3B2-, P62-, ICP0- og ICP5- og GAPDH-proteinniveauerne.

På dag 3,5 efter overholdelse, overføre 12 millioner id'er i en 50 milliliter rør, centrifuge dem på 300 gange g i fem minutter, og derefter kassere supernatant. Parallelt hermed udføres flowcytometrisk analyse for at overvåge modningsstatus. IdC'erne vaskes forsigtigt i fem milliliter Opti-MEM uden fenolrød og centrifugeres ved 300 gange g i fem minutter.

Kassér supernatanten og opslæmm cellerne i 200 mikroliter af Opti-MEM, der justerer cellekoncentrationen til seks millioner celler pr. 100 mikroliter. Der tilsættes 75 picomoler af enten FIP200 specifikke eller rørægte siRNA til fire millimeter elektroklytter og overføre 100 mikroliter af cellesuspensionen til den respektive kuvette. Pulser direkte id'erne ved hjælp af et elektroporationsapparat.

Efter elektroporation overføres iDC'erne til seks-brøndplader med frisk forvarmt DC-medium, såning cellerne i en endelig koncentration på en million celler pr. milliliter og læg dem i inkubatoren. Efter 48 timer undersøges morfologien af de elektroporerede idC'er mikroskopisk, derefter høste cellerne med celleskraberen og overføre dem til 15 milliliterrør. Skyl brøndene med en milliliter PBS suppleret med 0,1% EDTA og overfør opløsningen til de respektive rør.

Derefter opdeles cellerne for hver siRNA-tilstand som beskrevet i manuskriptet. Brug 500,000 celler til at vurdere modningsstatus og celle levedygtighed, bruge en million celler til western blot analyse for at kontrollere FIP200 specifikke knockdown effektivitet og bruge de resterende celler til HSV-1 infektion eksperimenter. De genererede idC'er og mDC'er blev fænotopypisk analyseret ved flowcytometri for at udelukke kontaminering med andre celletyper og for at kontrollere deres modningsstatus.

Cellerne blev plettet med CD3 og CD14 antistoffer for at udelukke henholdsvis T-celle- og monocytforurening. Cellerne blev plettet for CD11c, der tjener som en højt udtrykt generel markør for DC'er. For at vurdere modningsstatus blev CD80,CCR7, CD83 og MHCII-antistoffer anvendt, fordi disse molekyler er meget udtrykt på modne DC'er.

Fluorescensmikroskopi og flowcytometri blev anvendt til at bestemme infektion med EGFP, der udtrykte HSV-1. Stærke GFP-signaler indikerer næsten fuldstændig infektion af idC'er og mDC'er. Western blot analyse blev brugt til at afgøre, om spautin-1 eller bafilomycin A1 hæmmer autofagisk flux i HSV-1 inficerede celler.

I IDC'er påvises autofagisk flux ved faldet i P62- og LC3B-udtrykket i mangel af henholdsvis spautin-1 og bafilomycin A1. I modsætning hertil påvirker HSV-1-infektion af mdcs i mangel af spautin-1 ikke P62-udtrykket, mens spautin-1- og BA1-behandling medførte en akkumulering af LC3B-II, som afspejler induktionen af autofagi, men en fejlslagen autofaseomsætning i mDC'er. Reduktion af FIP200 proteinniveauer med siRNA-elektroporation forårsager også et kraftigt fald i autofag flux i HSV-1-inficerede idC'er.

Denne siRNA-baserede elektroporationsprotokol til hæmning af autofagi påvirker ikke cellernes levedygtighed, billedets fænotype eller etableringen af HSV-1 proteinudtryk i iDC'er. Vores elektroporationsprotokoller giver mulighed for at levere forskellige DNA- eller RNA-arter til sygdom og andre primære celletyper. Efterfølgende kan der udføres en række molekylære, funktionelle og infektionsanalyser.

Den siRNA-baserede strategi for ekspressionshæmning ved sygdom baner vejen for at udforske funktionen af ethvert protein af interesse, også kombineret med efterfølgende funktionelle analyser.