siRNA Electroporation voor het moduleren van Autophagie in herpes simplex virus type 1-geïnfecteerde monocyt-afgeleide dendritische cellen

Ons protocol beschrijft methoden om hsv-1 geïnduceerde autophagische omzet in dendritische cellen efficiënt te verstoren. En in het bijzonder vergelijken we een op remmer gebaseerde met een siRNA-gebaseerde strategie om autofagie te blokkeren voorafgaand aan infectie. Terwijl de op remmer gebaseerde interferentie met autofagie potentiële en specifieke off-target effecten omvat, is onze ontwikkelde siRNA-gebaseerde strategie meer doelspecifiek.

Belangrijk is dat beide gepresenteerde technieken geen invloed hebben op de rijpingsstadia van de ziekte. Het aantonen van de procedure zal Petra Muhl-Zurbes, een technicus, en Alexandra Duthorn, een grad student, uit mijn laboratorium. Begin met het oogsten van onrijpe dendritische cellen of iDC's door de loshangende cellen voorzichtig te spoelen vanaf de bodem van de celkweekkolf op dag vier na de aanhankelijkheid.

Voeg rijping cocktail aan de cellen om volwassen dendritische cellen of mDC's te genereren. Spoel twee dagen na de inductie van de rijping de mDC's van de bodem van de celkweek. Herhaal de spoeling twee keer en breng de iDC's en mDC's over op 50 milliliter buizen in hun respectievelijke kweekmedium.

Oogst de cellen via centrifugatie op 300 keer g gedurende vijf minuten. Voorzichtig resuspend de cellen in vijf tot 10 milliliter RPMI 1640 per cel cultuur kolf en combineren de respectieve DC schorsingen in een buis. Kwantificeer vervolgens de cellen met behulp van een telkamer om temperatuurveranderingen te voorkomen bij het hanteren van de DC's.

Breng twee miljoen iDC's of mDC's in een twee milliliter buis, centrifuge ze op 3, 390 keer g gedurende 1-1/2 minuten en gooi de supernatant. Voorzichtig de resuspend de cellen in infectie medium. Rem het autophagosomale lysosomale afbraaktraject door een uur voor infectie 10 micromolar spautin-1 of één micromolar bafilomycine A1 toe te voegen aan het infectiemiddel.

Voeg DMSO toe voor de onbehandelde besturing en ontcubeer de cellen op een verwarmingsblok bij 37 graden Celsius met schudden bij 300 RPM. Voor infectiestudies inent u de cellen met HSV-1-virionen bij een veelheid aan infectie van twee. Voeg het respectieve volume van MNT buffer als een mock controle en incubeer de cellen op een verwarmingsblok op 37 graden Celsius gedurende een uur met schudden.

Een uur na infectie, verzamel de cellen via centrifugatie op 3, 390 keer g gedurende 1-1/2 minuten, dan aspirate het entmateriaal zachtjes en resuspend de cellen in DC medium. Zaad mock behandeld en HSV-1 geïnfecteerde cellen met een uiteindelijke concentratie van een miljoen cellen per milliliter in een zes-put plaat. Oogst na 16 tot 24 uur na infectie iDC's met behulp van een celschraper of mDC door te spoelen, breng de cellen over in een 1,5 milliliter veilige buis en verzamel ze via centrifugatie op 3, 390 keer g gedurende 1-1/2 minuten.

Herhaal oogsten en centrifugeren met de resterende cellen in de putten, dan was de pellet een keer met een milliliter PBS en krachtig resuspend de cellen in lyse mix. Incubeer de monsters op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en verwarm vervolgens tot 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voer SDS-pagina en western blot-analyse uit om de LC3B1- en LC3B2-, P62-, ICP0- en ICP5- en GAPDH-eiwitniveaus te verifiëren.

Op dag 3,5 na de aanhankelijkheid, breng 12 miljoen iDC's in een 50 milliliter buis, centrifuge ze op 300 keer g gedurende vijf minuten, en gooi dan de supernatant. Voer tegelijkertijd cytometrische analyse uit om de rijpingsstatus te controleren. Was de iDC's voorzichtig in vijf milliliter Opti-MEM zonder fenolrood en centrifugeer ze vijf minuten lang op 300 keer g.

Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 200 microliter van Opti-MEM, waarbij de celconcentratie wordt aangepast aan zes miljoen cellen per 100 microliter. Voeg 75 picomoles van FIP200 specifieke of roerei siRNA aan vier millimeter elektrovetten en breng 100 microliter van de cel suspensie in de respectieve cuvette. Pulseer de iDC's rechtstreeks met behulp van een elektroporatieapparaat.

Breng na elektroporatie de iDC's over in zes-goed platen met vers voorverwarmd GELIJKGEstemd, het zaaien van de cellen met een uiteindelijke concentratie van een miljoen cellen per milliliter en plaats ze in de couveuse. Na 48 uur, onderzoek de morfologie van de elektrorateerde iDC's microscopisch, dan oogst de cellen met de cel schraper en breng ze in 15 milliliter buizen. Spoel de putten met een milliliter PBS aangevuld met 0,1%EDTA en breng de oplossing over naar de respectievelijke buizen.

Vervolgens splitsen de cellen voor elke siRNA voorwaarde zoals beschreven in het manuscript. Gebruik 500.000 cellen om de rijpingsstatus en cel levensvatbaarheid te beoordelen, gebruik een miljoen cellen voor westerse vlekanalyse om fip200 specifieke knockdown-efficiëntie te verifiëren en de resterende cellen te gebruiken voor HSV-1-infectieexperimenten. De gegenereerde iDC's en mDC's werden fenotypisch geanalyseerd door stromingscytometrie om besmetting met andere celtypen uit te sluiten en hun rijpingsstatus te verifiëren.

De cellen werden bevlekt met CD3- en CD14-antilichamen om respectievelijk T-cel- en monocytenbesmetting uit te sluiten. De cellen werden gekleurd voor CD11c die dient als een zeer uitgedrukte algemene marker voor DC's. Om de rijpingsstatus te beoordelen, werden CD80-, CCR7-, CD83- en MHCII-antilichamen gebruikt omdat deze moleculen sterk worden uitgedrukt op volwassen DC's.

Fluorescentie microscopie en stroom cytometrie werden gebruikt om infectie te bepalen met EGFP uitdrukken HSV-1. Sterke GFP-signalen wijzen op een bijna volledige infectie van iDC's en mDC's. Westerse vlek analyse werd gebruikt om te bepalen of spautin-1 of bafilomycine A1 remmen autofagische flux in HSV-1 geïnfecteerde cellen.

In iDC's wordt autophagische flux aangetoond door de daling van P62 en LC3B-expressie bij afwezigheid van respectievelijk spautin-1 en bafilomycine A1. HSV-1-infectie van mDC's bij afwezigheid van spautin-1 heeft daarentegen geen invloed op de P62-expressie, terwijl de behandeling van Spautin-1 en BA1 een opeenstapeling van LC3B-II heeft veroorzaakt die de inductie van autofagie weerspiegelt, maar een gebrek aan autofic-omzet in mDC's. Het verminderen van FIP200 eiwitniveaus met siRNA-elektroporatie veroorzaakt ook een sterke afname van de autofaagflux in HSV-1 geïnfecteerde iDC's.

Dit siRNA-gebaseerde elektroporatieprotocol voor remming van autofagie heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cel, het beeldfenotype of de oprichting van HSV-1-eiwitexpressie in iDC's. Onze elektroporatieprotocollen bieden de mogelijkheid om verschillende DNA- of RNA-soorten te leveren aan ziekte- en andere primaire celtypen. Vervolgens kunnen verschillende moleculaire, functionele en infectieanalyses worden uitgevoerd.

De siRNA-gebaseerde strategie voor expressie-uitschakeling in ziekte effent de weg om de functie van elk eiwit van belang te verkennen, ook gecombineerd met latere functionele testen.