הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות להפריע ביעילות לתחלופה אוטופגית המושרה HSV-1 בתאים דנדריטיים. ובמיוחד, אנו משווים מעכב מבוסס עם אסטרטגיה מבוססת siRNA כדי לחסום autophagy לפני ההדבקה. בעוד שההתערבות המבוססת על מעכבים עם אוטופגיה כוללת השפעות פוטנציאליות וספנטיות מחוץ ליעד, האסטרטגיה המפותחת שלנו המבוססת על siRNA היא ספציפית יותר למטרה.
חשוב לציין, שתי הטכניקות המוצגות אינן משפיעות על שלבי ההבשלה של המחלה. הדגימו את ההליך יהיו פטרה מול-זורב, טכנאית, ואלכסנדרה דות'ורן, סטודנטית לתואר שני, מהמעבדה שלי. התחל על ידי קצירת תאים תותבים לא בוגרים או iDCs על ידי שטיפה עדין של התאים חסידים באופן רופף מתחתית בקבוק תרבות התא ביום הרביעי דבקות פוסט.
הוסף קוקטייל התבגרות לתאים כדי ליצור תאים דנדריטיים בוגרים או mDCs. יומיים לאחר אינדוקציה של התבגרות, לשטוף את mDCs מתחתית בקבוקון תרבות התא. חזור על שטיפה פעמיים, ולאחר מכן להעביר את iDCs ו- mDCs ל 50 צינורות מיליליטר במדיום התרבות שלהם בהתאמה.
לקצור את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. בעדינות resuspend התאים בחמישה עד 10 מיליליטר של בקבוק RPMI 1640 לכל תא תרבות ולשלב את המתלים DC בהתאמה בצינור אחד. לאחר מכן כימת את התאים באמצעות תא ספירה כדי למנוע שינויי טמפרטורה בעת טיפול ב- DCs.
העבר שני מיליון IDCs או mDCs לתוך צינור שני מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 3, 390 פעמים g במשך 1-1/2 דקות ולהשליך את העל טבעי. בעדינות resuspend התאים במדיום זיהום. לעכב את מסלול השפלה ליזוזומלית autophagosomal על ידי הוספת 10 spautin מיקרומולרי-1 או אחד bafilomycin מיקרומולרי A1 למדיום זיהום שעה אחת לפני ההדבקה.
הוסף DMSO לבקרה לא מטופלת והדקירה את התאים על בלוק חימום ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 300 סל"ד. עבור מחקרי זיהום, לחסן את התאים עם virions HSV-1 בריבוי של זיהום של שניים. הוסף את עוצמת הקול המתאימה של מאגר MNT כפקד מדומה והדמה את התאים על בלוק חימום ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות.
שעה לאחר ההדבקה, לאסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 3, 390 פעמים גרם במשך 1-1/2 דקות, ולאחר מכן לשאוף את inoculum בעדינות resuspend התאים באמצע DC. זרעים מדומים מטופלים ותאים נגועים HSV-1 בריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר לתוך צלחת שש בארות. ב 16 עד 24 שעות לאחר זיהום, קציר iDCs באמצעות מגרד תא או mDCs על ידי שטיפה, להעביר את התאים לתוך צינור 1.5 מיליליטר בטוח נעילה ולאסוף אותם באמצעות צנטריפוגה ב 3, 390 פעמים g במשך 1-1/2 דקות.
חזור על קציר וצנטריפוגה עם התאים הנותרים בארות, ולאחר מכן לשטוף את גלולה פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS במרץ resuspend התאים בתערובת תמוגה. הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן לחמם ל 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בצע ניתוחי SDS ו- Blot מערבי כדי לאמת את רמות החלבון LC3B1 ו- LC3B2, P62, ICP0 ו- ICP5 ו- GAPDH.
ביום 3.5 פוסט דבקות, להעביר 12 מיליון iDCs לתוך צינור 50 מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים g במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. במקביל, בצע ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לפקח על מצב ההבשלה. בעדינות לשטוף את iDCs בחמישה מיליליטר של Opti-MEM ללא פנול אדום צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב-200 מיקרוליטרים של Opti-MEM כדי להתאים את ריכוז התאים לשישה מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטרים. הוסף 75 picomoles של FIP200 siRNA ספציפי או מקושקשות לארבעה אלקטרוקובטים מילימטר ולהעביר 100 microliters של ההשעיה התא לתוך קובט בהתאמה. דופק ישירות את ה-IDCs באמצעות מנגנון אלקטרופולציה.
לאחר אלקטרופורציה, להעביר את iDCs לתוך שש בארות צלחות עם טרי מחומם מראש DC בינוני, זריעת התאים בריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר ולמקום אותם באינקובטור. לאחר 48 שעות, לבחון את המורפולוגיה של iDCs אלקטרופו מדורג מיקרוסקופית, ולאחר מכן לקצור את התאים עם מגרד התא ולהעביר אותם לתוך צינורות 15 מיליליטר. לשטוף את בארות עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 0.1% EDTA ולהעביר את הפתרון צינורות בהתאמה.
לאחר מכן לפצל את התאים עבור כל תנאי siRNA כמתואר בכתב היד. השתמש ב- 500, 000 תאים כדי להעריך את מצב ההבשלה ואת יכולת הקיום של התאים, השתמש במיליון תאים לניתוח כתמים מערביים כדי לאמת יעילות נוקאאוט ספציפית של FIP200 ולהשתמש בתאים הנותרים לניסויי זיהום HSV-1. IDCs שנוצר mDCs נותחו פנוטיפית על ידי cytometry זרימה על מנת לא לכלול זיהום עם סוגי תאים אחרים כדי לאמת את מצב ההתבגרות שלהם.
התאים היו מוכתמים בנוגדנים CD3 ו- CD14 כדי לא לכלול זיהום תאי T ומונוציטים בהתאמה. התאים היו מוכתמים עבור CD11c המשמש כסמן כללי מבוטא מאוד עבור מחשבי DCs. כדי להעריך את מצב ההבשלה, נעשה שימוש בנוגדנים CD80, CCR7, CD83 ו- MHCII מכיוון שמולקולות אלה מתבטאות מאוד במחשבי DCs בוגרים.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי וציטומטריית זרימה שימשו כדי לקבוע זיהום עם EGFP המבטא HSV-1. אותות GFP חזקים מצביעים על זיהום כמעט מוחלט של IDCs ו- MDCs. ניתוח כתם מערבי שימש כדי לקבוע אם spautin-1 או bafilomycin A1 לעכב שטף autophagic בתאים נגועים HSV-1.
ב- iDCs, שטף אוטופגני מוכח על ידי הירידה של ביטוי P62 ו- LC3B בהיעדר spautin-1 ו bafilomycin A1 בהתאמה. לעומת זאת, זיהום HSV-1 של mDCs בהיעדר spautin-1 אינו משפיע על ביטוי P62 בעוד טיפול spautin-1 ו BA1 גרם הצטברות של LC3B-II אשר משקף את אינדוקציה של autophagy אבל כישלון של מחזור אוטופגי ב- mDCs. הפחתת רמות החלבון FIP200 עם אלקטרופוזיה siRNA גם גורם לירידה חזקה שטף autophagic ב- IDCs נגוע HSV-1.
פרוטוקול אלקטרופוזיה מבוסס siRNA זה לעיכוב אוטופגיה אינו משפיע על כדאיות התא, על פנוטיפ התמונה או על הקמת ביטוי חלבון HSV-1 ב- iDCs. פרוטוקולי האלקטרופורציה שלנו מציעים את ההזדמנות לספק מיני דנ"א או רנ"א נפרדים למחלות ולסוגי תאים ראשוניים אחרים. לאחר מכן, ניתן לבצע מגוון ניתוחים מולקולריים, פונקציונליים וזיהומים.
האסטרטגיה מבוססת siRNA להשעת ביטוי במחלות סוללת את הדרך לחקור את הפונקציה של כל חלבון מעניין, בשילוב גם עם בדיקות תפקודיות עוקבות.
