सिरियाना इलेक्ट्रोपोरिओशन हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1-संक्रमित मोनोसाइट-रिडेरिड डेन्ड्रिटिक सेल में ऑटोफैगी को मॉडूलेट करने के लिए

हमारा प्रोटोकॉल एचएसवी-1 प्रेरित ऑटोफैजिक टर्नओवर के साथ डेंड्रिटिक कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक हस्तक्षेप करने के तरीकों का वर्णन करता है। और विशेष रूप से, हम संक्रमण से पहले ऑटोफैगी को ब्लॉक करने के लिए एक सिरना-आधारित रणनीति के साथ एक अवरोधक-आधारित तुलना करते हैं। जबकि ऑटोफैगी के साथ अवरोधक-आधारित हस्तक्षेप में संभावित और विशिष्ट ऑफ-टारगेट प्रभाव शामिल हैं, हमारी विकसित सिरना-आधारित रणनीति अधिक लक्ष्य विशिष्ट है।

महत्वपूर्ण बात, दोनों प्रस्तुत तकनीकों रोग के परिपक्वता चरणों को प्रभावित नहीं करते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन पेट्रा Muhl-Zurbes, एक तकनीशियन, और एलेक्जेंड्रा Duthorn, एक स्नातक छात्र, मेरी प्रयोगशाला से होगा । चार के बाद पालन पर कोशिका संस्कृति फ्लास्क के नीचे से शिथिल अनुयायी कोशिकाओं को धीरे से धोना द्वारा अपरिपक्व डेंड्रिटिक कोशिकाओं या iDCs की कटाई से शुरू करें।

परिपक्व डेंड्रिटिक कोशिकाओं या एमडीसी उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं में परिपक्वता कॉकटेल जोड़ें। परिपक्वता के शामिल होने के दो दिन बाद, सेल कल्चर फ्लास्क के नीचे से एमडीसी को खंगालें। कुल्ला को दो बार दोहराएं, फिर अपने-अपने कल्चर मीडियम में 50 मिलीलीटर ट्यूब में आईसी और एमडीसी ट्रांसफर करें।

पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को फसल। धीरे-धीरे आरपीएमआई 1640 प्रति सेल संस्कृति फ्लास्क के पांच से 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और संबंधित डीसी निलंबन को एक ट्यूब में जोड़ें। फिर डीसी को संभालते समय तापमान परिवर्तन से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए एक गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की मात्रा ।

दो मिलियन आईसी या एमडीसी को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्री करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें। धीरे-धीरे संक्रमण माध्यम में कोशिकाओं को फिर से व्यतीप करें। संक्रमण से एक घंटे पहले संक्रमण माध्यम में 10 माइक्रोमोलर स्पॉटिन-1 या एक माइक्रोमोलर बाफिलोमाइसिन A1 जोड़कर ऑटोफैगोसोमल लिसोसोमल रक्षित मार्ग को रोकें।

अनुपचारित नियंत्रण के लिए DMSO जोड़ें और ३०० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट । संक्रमण अध्ययन के लिए, दो के संक्रमण की बहुलता पर एचएसवी-1 विरियंस के साथ कोशिकाओं को टीका लगाएं। एक नकली नियंत्रण के रूप में एमएनटी बफर की संबंधित मात्रा जोड़ें और मिलाते हुए के साथ एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।

संक्रमण के एक घंटे बाद, 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा करें, फिर धीरे-धीरे इनोकुलम को एस्पिरेट करें और डीसी माध्यम में कोशिकाओं को फिर से व्यतीत करें। बीज नकली इलाज और एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं को एक छह अच्छी तरह से थाली में मिलीलीटर प्रति १,०,० कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर । संक्रमण के बाद 16 से 24 घंटे में, एक सेल स्क्रैपर या एमडीसी का उपयोग करके फसल iDCs, कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से एकत्र करें।

कुओं में शेष कोशिकाओं के साथ कटाई और अपकेंद्रित्र दोहराएं, फिर पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ एक बार गोली धोएं और लाइसिस मिश्रण में कोशिकाओं को तेजी से फिर से खर्च करें। नमूनों को 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस तक गर्मी । एलसी 3बी1 और LC3B2, P62, ICP0 और ICP5, और GAPDH प्रोटीन के स्तर को सत्यापित करने के लिए SDS पृष्ठ और पश्चिमी दाग विश्लेषण करें।

पालन के बाद 3.5 दिन, 12 मिलियन आईसी को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्री करें, और फिर सुपरनैट्रेशन को त्याग दें। समानांतर में, परिपक्वता स्थिति की निगरानी के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें। धीरे-धीरे ऑप्टी-एमईएम के पांच मिलीलीटर में आईआईडीसी को बिना फिनॉल लाल और अपकेंद्रित्र के पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर धोएं।

सुपरनेट को त्यागें और ऑप्टी-एमईएम के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें जो कोशिका एकाग्रता को प्रति 100 माइक्रोलीटर छह मिलियन कोशिकाओं में समायोजित करते हैं। चार मिलीमीटर इलेक्ट्रोक्यूवेट में या तो FIP200 विशिष्ट या तले हुए सिरना के 75 पिकोमोल्स जोड़ें और सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर को संबंधित क्यूवेट में स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रोपाउनेशन उपकरण का उपयोग करके सीधे आईसीई को पल्स करें।

इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, आईसीई को ताजा पूर्व-गर्म डीसी माध्यम के साथ छह-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं को प्रति मिलीलीटर दस लाख कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर सीडिंग करें और उन्हें इनक्यूबेटर में रखें। 48 घंटे के बाद, इलेक्ट्रोपेटेड आईसी की आकृति विज्ञान की जांच करें सूक्ष्म रूप से, फिर कोशिका स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को फसल करें और उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कुओं कुल्ला 0.1% EDTA के साथ पूरक और संबंधित ट्यूबों के लिए समाधान हस्तांतरण।

फिर पांडुलिपि में वर्णित प्रत्येक सिराना स्थिति के लिए कोशिकाओं को विभाजित करें। परिपक्वता की स्थिति और कोशिका व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए 500, 000 कोशिकाओं का उपयोग करें, FIP200 विशिष्ट नॉकडाउन दक्षता को सत्यापित करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए दस लाख कोशिकाओं का उपयोग करें और एचएसवी-1 संक्रमण प्रयोगों के लिए शेष कोशिकाओं का उपयोग करें। उत्पन्न आईसी और एमडीसी को अन्य सेल प्रकारों के साथ संदूषण को बाहर करने और उनकी परिपक्वता स्थिति को सत्यापित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोथिपिक रूप से विश्लेषण किया गया था।

कोशिकाओं को क्रमशः टी-सेल और मोनोसाइट संदूषण को बाहर करने के लिए सीडी 3 और सीडी 14 एंटीबॉडी से सना हुआ था। कोशिकाओं CD11c जो डीसी के लिए एक उच्च व्यक्त सामांय मार्कर के रूप में कार्य करता है के लिए दाग थे । परिपक्वता की स्थिति का आकलन करने के लिए, सीडी80, सीसीआर 7, सीडी 83, और MHCII एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था क्योंकि इन अणुओं को परिपक्व डीसी पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग एचएसवी-1 को व्यक्त करते हुए ईजीएफपी के साथ संक्रमण निर्धारित करने के लिए किया गया था। मजबूत जीएफपी संकेतों से आईसीसी और एमडीसी के लगभग पूर्ण संक्रमण का संकेत मिलता है। पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या स्पॉटिन-1 या बाफिलोमाइसिन ए 1 एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं में ऑटोफैजिक फ्लक्स को रोकता है।

आईसी में, क्रमशः स्पॉटिन-1 और बाफिलोमाइसिन ए 1 की अनुपस्थिति में पी 62 और एलसी 3बी अभिव्यक्ति की गिरावट से ऑटोफैजिक फ्लक्स का प्रदर्शन किया जाता है। इसके विपरीत, स्पॉटिन-1 के अभाव में एमडीसी के एचएसवी-1 संक्रमण P62 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है जबकि स्पॉटिन-1 और बीए1 उपचार ने एलसी 3बी-II के संचय को प्रेरित किया जो ऑटोफैगी के प्रडक्शन को दर्शाता है लेकिन एमडीसीएस में ऑटोफैजिक कारोबार की विफलता । सिरना इलेक्ट्रोपॉरेशन के साथ FIP200 प्रोटीन के स्तर को कम करने से एचएसवी-1 संक्रमित टीडीसी में ऑटोफैजिक फ्लक्स में भी जोरदार कमी आती है।

ऑटोफैगी के अवरोध के लिए यह सिरना-आधारित इलेक्ट्रोप्यूशन प्रोटोकॉल कोशिका व्यवहार्यता, छवि फेनोटाइप या आईसीसी में एचएसवी-1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थापना को प्रभावित नहीं करता है। हमारे इलेक्ट्रोपाउशन प्रोटोकॉल रोग और अन्य प्राथमिक कोशिका प्रकारों में अलग डीएनए या आरएनए प्रजातियों को वितरित करने का अवसर प्रदान करते हैं। इसके बाद, विभिन्न प्रकार के आणविक, कार्यात्मक और संक्रमण विश्लेषण किए जा सकते हैं।

रोग में मुंह बंद अभिव्यक्ति के लिए सिरना आधारित रणनीति ब्याज के किसी भी प्रोटीन के कार्य का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त करती है, बाद में कार्यात्मक परख के साथ भी संयुक्त होती है।