Name: sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

इस काम को जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा परियोजना STE 432/11-1 के माध्यम से सहायता प्रदान की गई थी एएस को और चिकित्सा संकाय से ELAN कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया (Friedich-Alexander-Universit-t Erlangen-Nrnberg) परियोजना के माध्यम से 18-12-21-1, एलजी को दी.

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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

वर्तमान प्रोटोकॉल के दायरे में (i) मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न आईडीसी के साथ-साथ एमडीसी की हैंडलिंग, (ii) एचएसवी-1 के साथ उनका संक्रमण, (iii) ऑटोफैगी को बाधित करने के लिए ज्ञात यौगिकों के साथ उनका उपचार, और (iv) दो का उपयोग करके सरना के साथ उनके इलेक्ट्रोपोट्रेशन विभिन्न तकनीकी setups. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, autophagic प्रवाह या तो HSV-1 संक्रमित iDCs में अवरुद्ध किया जा सकता है या एचएसवी -1 संक्रमित एमडीसी में प्रेरित.
चूंकि डीसी, और विशेष रूप से iDCs, बहुत कमजोर कोशिकाओं रहे हैं, इन कोशिकाओं के साथ काम करने के बजाय नाजुक कदम शामिल है. डीसी पीढ़ी के लिए, हम ताजा अलग PBMCs का उपयोग करने के लिए अनुशंसा करते हैं, और उनके cryopservation से बचने के लिए, उच्च सेल पैदावार प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, जब उनके बाद की खेती सहित प्रयोगों के दौरान iDCs हैंडलिंग, कठोर या लंबे समय तक तापमान परिवर्तन को रोकने के. अन्यथा, iDCs phenotypic परिवर्तन से गुजरना हो सकता है और इस प्रकार यह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके अपरिपक्व phenotype सत्यापित करने के लिए आवश्यक है. नोट करें, अपने परिपक्व समकक्षों के विपरीत, iDCs में अलग-अलग मार्कर की कमी होती है, जैसे CD80, CD83 और CD8628,29. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी और एमडीसी का संक्रमण एक सुस्थापित विधि2,3,4,5,6,10है . हम और दूसरों से पता चला है कि डीसी एचएसवी -1 संक्रमण के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं, जब 1 या 2 के एक MOI इस्तेमाल किया गया है (चित्र 2) . हमारे हाथों में, कम स्तर पर संक्रमण माध्यम की मात्रा रखने (1-3 x 106 कोशिकाओं में 250-350 $L) बेहतर संक्रमण क्षमता के लिए नेतृत्व करेंगे.
एक दिया अलग सेलुलर मार्ग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण विशिष्ट यौगिकों का उपयोग है. ऑटोफैगी के विभिन्न न्यूनाधिक की एक किस्म, यानी उत्प्रेरक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से inhibitors, वर्तमान में उपलब्ध हैं30. के बारे में एचएसवी-1 प्रेरित autophagy में डीसी, Turan एट अल., (2019) हाल ही में iDCs10में autophagic कारोबार पर spautin-1 और bafilomycin-A1 (BA1) के निरोधात्मक प्रभाव से पता चला. autophagy निषेध के लिए इस तकनीक के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त है, के बाद से न तो संक्रमण की दर और न ही डीसी (विशेष रूप से iDCs) की परिपक्वता स्थिति बिगड़ा है. भविष्य के अनुप्रयोगों में, इस अवरोधक आधारित दृष्टिकोण भी अन्य संक्रामक एजेंटों के साथ संयोजन में लागू किया जा सकता है, तनाव की स्थिति, जैसे भुखमरी के रूप में, साथ ही विभिन्न सेल प्रकार के लिए. हालांकि, inhibitors का उपयोग करते समय, सीमाओं सेल व्यवहार्यता को गंभीर रूप से प्रभावित किए बिना, कुशल autophagy अवरोध के लिए उपयुक्त एकाग्रता का निर्धारण करने में उत्पन्न होते हैं। तथापि, अवरोधकों का उपयोग करते समय प्रमुख सीमा संभावित ऑफ-लक्ष्य या प्रतिकूल प्रभावों की घटना है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम31,32हो सकते हैं.
वर्तमान प्रोटोकॉल में शामिल ऑटोफैगी में हस्तक्षेप करने का दूसरा दृष्टिकोण, सिराना33,34,35का उपयोग करते हुए विशिष्ट नॉकडाउन है . एक तरफ, हम इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण मैं विशेष रूप से FIP200 की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए इस्तेमाल किया, जिससे iDCs में एचएसवी-1 प्रेरित autophagic कारोबार को बाधित. दूसरी ओर, हम दो अलग KIF प्रोटीन मौन (यानी, KIF1B और KIF2A), विद्युत उपकरण द्वितीय का उपयोग कर, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में autophagic प्रवाह की सुविधा के लिए. दोनों इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप आईडीसी में FIP200 का लगभग पूर्ण अपाहिज हो गया, और एमडीसी में KIF1B/KIF2A, जिसे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ों के माध्यम से सत्यापित किया गया था (चित्र 4ए, चित्र 5ए)। इलेक्ट्रोपोट्रेशन उपकरण I के विपरीत, जो डीसी की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है, विद्युत उपकरण II का उपयोग करके एमडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन का परिणाम मृत कोशिकाओं की थोड़ी अधिक दरों में होता है(चित्र 4ठ, चित्र 5ठ ). इसलिए, भविष्य के अनुप्रयोगों में, इलेक्ट्रोपोर्शन उपकरण मैं वरीयता दोनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, iDCs और mDCs. उल्लेखनीय है, दोनों siRNA आधारित तकनीक, autophagic प्रवाह को मॉड्युलेट करने के लिए, या तो आईडीसी या mDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, न तो आईडीसी के अपरिपक्व phenotype और न ही एमडीसी के परिपक्व phenotype पोस्ट इलेक्ट्रोपोट्रेशन बदल दिया है.
FIP200-विशिष्ट siRNA का उपयोग कर iDCs के विद्युतीकरण जीन knockdown के लिए एक कुशल और अत्यधिक विशिष्ट विधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic प्रवाह के निषेध है. FIP200 के विशिष्ट silencing के अलावा, इस प्रोटोकॉल autophagic झरना के दौरान विभिन्न चरणों में भाग लेने, अन्य autophagic घटकों मौन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. तथापि, ऑटोफैगी के कुशल siRNA-मध्यस्थ निषेध के लिए उपयुक्त लक्ष्य की पहचान करने में चिंता के कई पहलू शामिल हैं। सबसे पहले, autophagy से संबंधित जीन (ATG) की दस्तक दक्षता जरूरी autophagy के कुशल निषेध के साथ सकारात्मक सहसंबंधित नहीं है और विशिष्ट ATG प्रोटीन है कि मौन36है पर अत्यधिक निर्भर है. दूसरे , अलग ATG प्रोटीन अतिरिक्त autophagy से अलग रास्ते में शामिल कर रहे हैं, इस प्रकार उनके ablation भी प्रतिकूल दुष्प्रभाव हो सकता है37,38,39. तीसरे, विभिन्न ATGs अनावश्यक कार्य हो सकता है, इस प्रकार एक घटक की दस्तक autophagy को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है(उदा., beclin-1 और beclin-2)40.
इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरिओशन तंत्र मैं आधारित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल डीसी के mRNAs के लिए भी उपयुक्त है, और अतिरिक्त प्राथमिक सेल प्रकार की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे PBMCs25. इस प्रकार यह प्रणाली अलग-अलग प्राथमिक कोशिकाओं में भिन्न आरएनए प्रजातियों को वितरित करने के लिए एक सामान्य कार्यनीति प्रदान करती है। अंत में, हम autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए दो प्रोटोकॉल मौजूद, या तो एक अवरोध करनेवाला का उपयोग करके- या iRNA आधारित iDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयुक्त दृष्टिकोण. इसके अलावा, हम एचएसवी-1 संक्रमण पर एमडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स पैदा करने के लिए एक siRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।

मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) की पीढ़ी इस महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के कार्यों और जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त का गठन करती है। हाल केवर्षोंमें 1,2में अलग - अलग और डीसी में मोनोसाइट्स का विभेद अच्छी तरह से स्थापित किया गया है . जेड-हर्पीवायरस हर्पस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) के साथ डीसी का संक्रमण डीसी जीव विज्ञान2,3,4,5,6 के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है . यह विशेष रूप से स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दादवायरस कैसे नम या शक्तिशाली एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बाधित करते हैं, मेजबान7,8 के अंदर प्रतिरक्षा-सुविधा प्राप्त niches में विलंबता स्थापित करनेकेलिए । इस संबंध में, हर्पीवायरस बहुत सफल रोगजनक हैं जो भौगोलिक क्षेत्र9के अनुसार 90 प्रतिशत तक की सीरो-एरो-एरोसिस तक पहुंचने वाली आबादी में व्यापक रूप से फैले हुए हैं। समझने के लिए और संभवतः इस को रोकने के लिए, मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन में अधिक अंतर्दृष्टि, और विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे डीसी की आवश्यकता है।
एचएसवी-1 के साथ डीसी की परस्पर क्रिया के बारे में एक पूरी तरह से नया अवलोकन हाल ही में ट्यूरन एट अल10द्वारा प्रकाशित किया गया था। लेखकों का प्रदर्शन किया है कि एचएसवी-1 प्रतिकृति की उपलब्धि सख्ती से डीसी की परिपक्वता स्थिति पर निर्भर है. आईडीसी में, एचएसवी -1 की पूरी प्रतिकृति ऑटोफैगी-निर्भर तंत्र द्वारा सुविधा प्रदान की जाती है। जबकि एचएसवी 1 दोनों, आईडीसी और एमडीसी में ऑटोफैगता पैदा करता है, ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। यह बदले में iDCs में परमाणु lamins के autophagic गिरावट के माध्यम से वायरल capsids के परमाणु उत्सर्जन की सुविधा. आईडीसी बनाम एमडीसी में इस एचएसवी-1-प्रेरित गिरावट मार्ग में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, ऑटोफैगिक फ्लक्स की जांच करने के लिए नई और कुशल रणनीतियों महत्वपूर्ण हैं।
मैक्रोऑटोफैगी (ऑटोफैगी) एक अच्छी तरह से संरक्षित बहुचरण प्रक्रिया है जो लाइसोसोमल पाचन11के लिए इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन या पूरे ऑर्गेनाइन्स को लक्षित करती है। सिम्पलिस्टिक रूप से, स्वभोजिता को (i) दीक्षा, (पप) झिल्ली नाभिक, (पपप) आशय विस्तार, और (iv) स्व-भोजन-lysosome संलयन चरण12में विभाजित किया जा सकता है। दीक्षा के दौरान (i), सक्रिय ULK1/2 kinase परिसर के रूप में घटक, 200 केडी (FIP200) के फोकल आसंजन kinase परिवार बातचीत प्रोटीन युक्त, beclin-1-Vps34-AMBRA1 परिसर को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसके बाद, झिल्ली नाभिक (पप) फागोफोर गठन13की शुरुआत करती है जो कोशिकाद्रव्यी कार्गोओं को घेर लेती है जो च6214जैसे अणुओं से चिह्नित होती हैं। आशय विस्तार और ऑटोफैगोफोर परिपक्वता के दौरान (iii) microtubule-संबद्ध प्रोटीन प्रकाश श्रृंखला 3 (LC3)-मैं अपने lipidated रूप LC3-II है कि autophagosomal झिल्ली में डाला जाता है में परिवर्तित कर दिया जाता है. इस प्रकार, एलसी 3-I से -II रूपांतरण दर परिपक्व स्वाक्षरी के गठन को प्रतिबिंबित करके स्वभोजी प्रेरण के लिए एक संकेतक है15,16. ऑटोफागोसम-लाइसोम संलयन (iv) पर, न केवल ऑटोफैगिक कार्गो बल्कि जुड़े p62 और LC3-II प्रोटीन भी निम्नीकरण से गुजरना (जैसे, हाइड्रोलिसिस द्वारा)। इस प्रकार च62 तथा एलसी 3-II की हानि स्वाक्षाभी फ्रलक्स17के लिए मार्कर के रूप में कार्य करती है। लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम का संलयन, और इस प्रकार स्वाक्षाभ कारोबार के बाद, इंट्रासेल्यूलर लाइसोसोमल स्थानीयकरण पर अत्यधिक निर्भर है। यह है, दूसरों के अलावा, kinesin परिवार के सदस्यों KIF1B और KIF2A द्वारा विनियमित, जो नकारात्मक autophagosome-lysosome संलयन18को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था. दिलचस्प है, KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति डीसी परिपक्वता पर प्रेरित है और इस तरह एचएसवी -1 संक्रमित mDCs में अक्षम autophagic प्रवाह के लिए जिम्मेदार है, जो पूरा एचएसवी -1 प्रतिकृति10बाधा.
स्वत: भोजन को रोकने के प्रायोगिक प्रयासों में इस विशेष मार्ग को प्रेरित करने या बाधित करने के लिए जाने जाने वाले यौगिकों का उपयोग19,20,21शामिल है . इस अध्ययन में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक कारोबार को रोकने के लिए दो अवरोधक-आधारित रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हमारे प्रयोगों में प्रयुक्त पहला यौगिक विशिष्ट और शक्तिशाली autophagy अवरोध करनेवाला-1 (spautin-1) है, जो beclin-1-Vps34-AMBRA1 जटिल गिरावट को बढ़ावा देने के लिए वर्णित किया गया था autophagy22के दीक्षा चरण के दौरान . वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त दूसरा यौगिक bafilomycin-A1 (BA1), एक वी-ATPase अवरोध करनेवाला है कि देर autophagic घटनाओं ब्लॉक(यानी, autophagosome-lysosome संलयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से autolysosome अम्लीकरण)23,24. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी संक्रमण से पहले इन दोनों अवरोधकों में से किसी का उपयोग पर्याप्त रूप से ऑटोफैगी को रोकता है, लेकिन कुशल वायरल जीन अभिव्यक्ति को परेशान नहीं करता है। इस प्रकार, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले यह अवरोधक-आधारित रणनीति एचएसवी -1-प्रेरित ऑटोफैगिक फ्लक्स को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है जिसे आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों और वायरस के ढेर सारे के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जो संभावित रूप से ऑटोफैगी को भी प्रेरित करता है।
एक अवरोधक आधारित दृष्टिकोण (यानी, विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभाव) के एक प्रमुख नकारात्मक पक्ष को दूर करने केलिए, हमने एक siRNA-आधारित विधि विकसित की है ताकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स को अवरुद्ध किया जा सके (एचएसवी-1-संक्रमित) iDCs. SiRNA इलेक्ट्रोपोरिकेशन की तकनीक एक शक्तिशाली वैकल्पिक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के चयनात्मक ablation के माध्यम से (यानी, autophagic घटकों). हमारे प्रयोगों में iDCs FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण I का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) और एक संशोधित प्रोटोकॉल Gerer एट अल द्वारा वर्णित (2017) और Prechtel एट अल (2007), के दौरान autophagy को बाधित करने के लिए दीक्षा चरण25,26. इस तकनीक हमें विशेष रूप से iDCs में FIP200 अभिव्यक्ति दस्तक करने के लिए अनुमति दी, सेल व्यवहार्यता और उनके अपरिपक्व phenotype दो दिन के बाद electroporation के साथ हस्तक्षेप के बिना. ध्यान देने योग्य, एचएसवी-1 संक्रमण इन इलेक्ट्रोपोरेटेड आईडीडीसी में स्थापित किया गया था जो कुशल वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति से प्रतिबिंबित होता है। इस siRNA आधारित तकनीक एक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है (यानी, कि विभिन्न autophagic घटकों की एक किस्म, यहां तक कि संयोजन में), विशेष रूप से उनकी अभिव्यक्ति के ablation के लिए लक्षित किया जा सकता है.
इस अध्ययन में, हम आगे एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक siRNA आधारित विधि का वर्णन. इस मामले में, iDCs को इलेक्ट्रोपोरेशन II का उपयोग करके डीसी परिपक्वता से पहले KIF1B और KIF2A के विरुद्ध लक्षित siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। चूंकि दोनों प्रोटीन डीसी परिपक्वता के दौरान विनियमित होते हैं और lysosomes10,18के साथ autophagosomes के संलयन को नकारात्मक रूप से विनियमित करने के लिए जाना जाता है , उनके knockdown दृढ़ता से प्रेरित HSV-1 संक्रमण पर mDCs में autophagic प्रवाह. इस प्रकार, siRNA आधारित तकनीक हमें विशेष रूप से mDCs में KIF प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से autophagic कारोबार प्रेरित करने के लिए सक्षम है, और इस तरह iDCs में अपनी अभिव्यक्ति के स्तर की नकल कर सकता है.
संक्षेप में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स को बाधित करने के लिए दो अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करते हैं। जबकि पहले अवरोधक आधारित दृष्टिकोण autophagic गिरावट के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक आसान, सस्ते और तेजी से तरीका का गठन, दूसरी siRNA आधारित तकनीक अधिक विशिष्ट और समर्थन और अवरोधकरनेवाला के परिणामों को सत्यापित करने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त तरीका है आधारित प्रयोगों. इसके अलावा, हम दो KIF प्रोटीन के siRNA-मध्यस्थ दस्तक के माध्यम से, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB-Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Dendritic cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>9007281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Western Blot Detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7074</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>tlrl-baf1</td>
			<td>inhibition of autophagy and lysosomal degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Chamber Fastblot B44</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>557648</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: G043H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>561692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: B-ly6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555398</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (mouse, FITC)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555332</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 (mouse, V450)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>560442</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: L307.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 (mouse, APC)</td>
			<td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>17-0839-41</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: HB15e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>553692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging</td>
			<td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIP200 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>12436</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D10D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (mouse)</td>
			<td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB2302</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:5000 
			Clone: MAB374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td>
			<td>BioRad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>165-2112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF (4x104 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA&#8208;DR (mouse, APC-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>307618</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td>
			<td>BioVex</td>
			<td></td>
			<td>DC infection 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP0 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 11060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP5 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-56989</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946; (0.1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1404-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF1B (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-376246</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: E-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF2A (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-271471</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>3868</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>L34964</td>
			<td>L/D staining in Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td>
			<td>04-03-9391/01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 2.0 RS</td>
			<td>Heraeus (Hanau, Germany)</td>
			<td>75015505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Brand (Wertheim, Germany)</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td>
			<td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p62 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>88588</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D5L7G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16 %</td>
			<td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectSpin 24 Plus</td>
			<td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td>
			<td>C2500-R-PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (1 mg/mL)</td>
			<td>Pfizer (Berlin, Germany)</td>
			<td>BE130681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel system MiniProtean II</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>1652960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform wt 15</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>042-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A151.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1 (4x)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>K929.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; (10 &#956;g/mL)</td>
			<td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 0.2 &#956;m nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>10600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td>
			<td>3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells

हरपीज सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) दोनों में ऑटोफैगी प्रेरित करता है, अपरिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (आईडीसी) के साथ-साथ परिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (एमडीसी), जबकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगिक टर्नओवर के साथ हस्तक्षेप करने के लिए कुशल रणनीति विकसित की है। एक अवरोधक आधारित रणनीति, एचएसवी -1 प्रेरित autophagy को व्यवस्थित करने के लिए, यह एक आसान और तेजी से विधि है, क्योंकि पहली पसंद का गठन किया। ऐसे यौगिकों के संभावित विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हमने एचएसवी-1 संक्रमण पर आईडीसी में ऑटोफैगिक टर्नओवर को मोडाने के लिए एक वैकल्पिक siRNA-आधारित रणनीति विकसित की है। दरअसल, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ आईडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन FIP200 प्रोटीन अभिव्यक्ति को समाप्त करने के लिए एक बहुत ही विशिष्ट और सफल तरीका है और इस तरह autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए। दोनों प्रस्तुत तरीकों iDCs में एचएसवी -1 प्रेरित autophagic कारोबार के कुशल निषेध में परिणाम है, जिससे siRNA आधारित तकनीक अधिक लक्ष्य विशिष्ट है. एक अतिरिक्त siRNA आधारित दृष्टिकोण चुनिंदा KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति मौन करने के लिए विकसित किया गया था, mDCs में एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic कारोबार की सुविधा. अंत में, siRNA इलेक्ट्रोपोर्शन की तकनीक एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, चुनिंदा अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए और एक एचएसवी -1 संक्रमण पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए.

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siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

इस अध्ययन में, हम दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार-1 (एचएसवी-1) संक्रमित मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं में ऑटोफैगिक फ्रलक्स के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अवरोधक- और siRNA आधारित रणनीतियों प्रस्तुत करते हैं।

सिरियाना इलेक्ट्रोपोरिओशन हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1-संक्रमित मोनोसाइट-रिडेरिड डेन्ड्रिटिक सेल में ऑटोफैगी को मॉडूलेट करने के लिए

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

हमारा प्रोटोकॉल एचएसवी-1 प्रेरित ऑटोफैजिक टर्नओवर के साथ डेंड्रिटिक कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक हस्तक्षेप करने के तरीकों का वर्णन करता है। और विशेष रूप से, हम संक्रमण से पहले ऑटोफैगी को ब्लॉक करने के लिए एक सिरना-आधारित रणनीति के साथ एक अवरोधक-आधारित तुलना करते हैं। जबकि ऑटोफैगी के साथ अवरोधक-आधारित हस्तक्षेप में संभावित और विशिष्ट ऑफ-टारगेट प्रभाव शामिल हैं, हमारी विकसित सिरना-आधारित रणनीति अधिक लक्ष्य विशिष्ट है।महत्वपूर्ण बात, दोनों प्रस्तुत तकनीकों रोग के परिपक्वता चरणों को प्रभावित नहीं करते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन पेट्रा Muhl-Zurbes, एक तकनीशियन, और एलेक्जेंड्रा Duthorn, एक स्नातक छात्र, मेरी प्रयोगशाला से होगा । चार के बाद पालन पर कोशिका संस्कृति फ्लास्क के नीचे से शिथिल अनुयायी कोशिकाओं को धीरे से धोना द्वारा अपरिपक्व डेंड्रिटिक कोशिकाओं या iDCs की कटाई से शुरू करें।परिपक्व डेंड्रिटिक कोशिकाओं या एमडीसी उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं में परिपक्वता कॉकटेल जोड़ें। परिपक्वता के शामिल होने के दो दिन बाद, सेल कल्चर फ्लास्क के नीचे से एमडीसी को खंगालें। कुल्ला को दो बार दोहराएं, फिर अपने-अपने कल्चर मीडियम में 50 मिलीलीटर ट्यूब में आईसी और एमडीसी ट्रांसफर करें।पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को फसल। धीरे-धीरे आरपीएमआई 1640 प्रति सेल संस्कृति फ्लास्क के पांच से 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और संबंधित डीसी निलंबन को एक ट्यूब में जोड़ें। फिर डीसी को संभालते समय तापमान परिवर्तन से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए एक गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की मात्रा ।दो मिलियन आईसी या एमडीसी को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्री करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें। धीरे-धीरे संक्रमण माध्यम में कोशिकाओं को फिर से व्यतीप करें। संक्रमण से एक घंटे पहले संक्रमण माध्यम में 10 माइक्रोमोलर स्पॉटिन-1 या एक माइक्रोमोलर बाफिलोमाइसिन A1 जोड़कर ऑटोफैगोसोमल लिसोसोमल रक्षित मार्ग को रोकें।अनुपचारित नियंत्रण के लिए DMSO जोड़ें और ३०० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट । संक्रमण अध्ययन के लिए, दो के संक्रमण की बहुलता पर एचएसवी-1 विरियंस के साथ कोशिकाओं को टीका लगाएं। एक नकली नियंत्रण के रूप में एमएनटी बफर की संबंधित मात्रा जोड़ें और मिलाते हुए के साथ एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।संक्रमण के एक घंटे बाद, 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा करें, फिर धीरे-धीरे इनोकुलम को एस्पिरेट करें और डीसी माध्यम में कोशिकाओं को फिर से व्यतीत करें। बीज नकली इलाज और एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं को एक छह अच्छी तरह से थाली में मिलीलीटर प्रति १,०,० कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर । संक्रमण के बाद 16 से 24 घंटे में, एक सेल स्क्रैपर या एमडीसी का उपयोग करके फसल iDCs, कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें 1-1/2 मिनट के लिए 3, 390 बार जी पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से एकत्र करें।कुओं में शेष कोशिकाओं के साथ कटाई और अपकेंद्रित्र दोहराएं, फिर पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ एक बार गोली धोएं और लाइसिस मिश्रण में कोशिकाओं को तेजी से फिर से खर्च करें। नमूनों को 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस तक गर्मी । एलसी 3बी1 और LC3B2, P62, ICP0 और ICP5, और GAPDH प्रोटीन के स्तर को सत्यापित करने के लिए SDS पृष्ठ और पश्चिमी दाग विश्लेषण करें।पालन के बाद 3.5 दिन, 12 मिलियन आईसी को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्री करें, और फिर सुपरनैट्रेशन को त्याग दें। समानांतर में, परिपक्वता स्थिति की निगरानी के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें। धीरे-धीरे ऑप्टी-एमईएम के पांच मिलीलीटर में आईआईडीसी को बिना फिनॉल लाल और अपकेंद्रित्र के पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर धोएं।सुपरनेट को त्यागें और ऑप्टी-एमईएम के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें जो कोशिका एकाग्रता को प्रति 100 माइक्रोलीटर छह मिलियन कोशिकाओं में समायोजित करते हैं। चार मिलीमीटर इलेक्ट्रोक्यूवेट में या तो FIP200 विशिष्ट या तले हुए सिरना के 75 पिकोमोल्स जोड़ें और सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर को संबंधित क्यूवेट में स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रोपाउनेशन उपकरण का उपयोग करके सीधे आईसीई को पल्स करें।इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, आईसीई को ताजा पूर्व-गर्म डीसी माध्यम के साथ छह-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं को प्रति मिलीलीटर दस लाख कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर सीडिंग करें और उन्हें इनक्यूबेटर में रखें। 48 घंटे के बाद, इलेक्ट्रोपेटेड आईसी की आकृति विज्ञान की जांच करें सूक्ष्म रूप से, फिर कोशिका स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को फसल करें और उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कुओं कुल्ला 0.1% EDTA के साथ पूरक और संबंधित ट्यूबों के लिए समाधान हस्तांतरण।फिर पांडुलिपि में वर्णित प्रत्येक सिराना स्थिति के लिए कोशिकाओं को विभाजित करें। परिपक्वता की स्थिति और कोशिका व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए 500, 000 कोशिकाओं का उपयोग करें, FIP200 विशिष्ट नॉकडाउन दक्षता को सत्यापित करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए दस लाख कोशिकाओं का उपयोग करें और एचएसवी-1 संक्रमण प्रयोगों के लिए शेष कोशिकाओं का उपयोग करें। उत्पन्न आईसी और एमडीसी को अन्य सेल प्रकारों के साथ संदूषण को बाहर करने और उनकी परिपक्वता स्थिति को सत्यापित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोथिपिक रूप से विश्लेषण किया गया था।कोशिकाओं को क्रमशः टी-सेल और मोनोसाइट संदूषण को बाहर करने के लिए सीडी 3 और सीडी 14 एंटीबॉडी से सना हुआ था। कोशिकाओं CD11c जो डीसी के लिए एक उच्च व्यक्त सामांय मार्कर के रूप में कार्य करता है के लिए दाग थे । परिपक्वता की स्थिति का आकलन करने के लिए, सीडी80, सीसीआर 7, सीडी 83, और MHCII एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था क्योंकि इन अणुओं को परिपक्व डीसी पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है।फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग एचएसवी-1 को व्यक्त करते हुए ईजीएफपी के साथ संक्रमण निर्धारित करने के लिए किया गया था। मजबूत जीएफपी संकेतों से आईसीसी और एमडीसी के लगभग पूर्ण संक्रमण का संकेत मिलता है। पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या स्पॉटिन-1 या बाफिलोमाइसिन ए 1 एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं में ऑटोफैजिक फ्लक्स को रोकता है।आईसी में, क्रमशः स्पॉटिन-1 और बाफिलोमाइसिन ए 1 की अनुपस्थिति में पी 62 और एलसी 3बी अभिव्यक्ति की गिरावट से ऑटोफैजिक फ्लक्स का प्रदर्शन किया जाता है। इसके विपरीत, स्पॉटिन-1 के अभाव में एमडीसी के एचएसवी-1 संक्रमण P62 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है जबकि स्पॉटिन-1 और बीए1 उपचार ने एलसी 3बी-II के संचय को प्रेरित किया जो ऑटोफैगी के प्रडक्शन को दर्शाता है लेकिन एमडीसीएस में ऑटोफैजिक कारोबार की विफलता । सिरना इलेक्ट्रोपॉरेशन के साथ FIP200 प्रोटीन के स्तर को कम करने से एचएसवी-1 संक्रमित टीडीसी में ऑटोफैजिक फ्लक्स में भी जोरदार कमी आती है।ऑटोफैगी के अवरोध के लिए यह सिरना-आधारित इलेक्ट्रोप्यूशन प्रोटोकॉल कोशिका व्यवहार्यता, छवि फेनोटाइप या आईसीसी में एचएसवी-1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थापना को प्रभावित नहीं करता है। हमारे इलेक्ट्रोपाउशन प्रोटोकॉल रोग और अन्य प्राथमिक कोशिका प्रकारों में अलग डीएनए या आरएनए प्रजातियों को वितरित करने का अवसर प्रदान करते हैं। इसके बाद, विभिन्न प्रकार के आणविक, कार्यात्मक और संक्रमण विश्लेषण किए जा सकते हैं।रोग में मुंह बंद अभिव्यक्ति के लिए सिरना आधारित रणनीति ब्याज के किसी भी प्रोटीन के कार्य का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त करती है, बाद में कार्यात्मक परख के साथ भी संयुक्त होती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

हरपीज के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति सिस्टम वायरस लेटेंसी और पुनर्सक्रियण सिंप्लेक्स

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

सक्रियण और मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में आईएल 1β का प्रयोग NLRP3 inflammasome गतिविधि की माप

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 के साथ Murine एपिडर्मिस के पूर्व vivo संक्रमण

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

पूरे रक्त से मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

एक दाद सिंप्लेक्स वायरस के परमाणु-cytoplasmic Translocation के लौकिक विश्लेषण Immunofluorescent फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 1 प्रोटीन

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

दाद सिंप्लेक्स वायरस-1 एंटीवायरल की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पोर्सिन कॉर्नियल ऊतक एक्सप्लांट

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

ओंकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस का विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

हरपीज सिंप्लेक्स वायरस की Plaquing

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

गोजातीय मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं का उपयोग करके वैक्सीन इम्युनोजेनेसिटी का निर्धारण

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...