Name: sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Council (DFG) via prosjektet STE 432/11-1 tildelt AS og av ELAN program fra det medisinske fakultet (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via prosjektet 18-12-21-1, gitt til LG.

Monocytt-avledede DCs ble generert fra leukaferese produkter av sunne donorer. For dette er en positiv stemme fra den lokale etikk komiteen er innhentet (referansenummer 4556). Eksperimentene i denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra etikk komitéen til «Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg» (referansenummer 4556). Alle givere godkjente et skriftlig informert samtykke, inkludert i samsvar med Declaration of Helsinki.
1. generering og håndtering av umodne dendrittiske celler (iDCs) og modne dendrittiske celler (mDCs)
<ol><li>Isoler humant perifere blod mononukleære celler (Pbmc) fra leukoreduction system kamre (LRSCs) som tidligere beskrevet27. Unngå kryonisk bevaring av Pbmc og bruk dem direkte ved isolering for å oppnå høyere DC-utbytte.</li>
	<li>Generere menneskelige DCS fra pbmc av forskjellige sunne donorer i T175 Cell kultur flasker som tidligere beskrevet10,27. Kort, bruk 350-400 millioner av Pbmc i 30 mL DC medium (RPMI 1640 uten L-glutamin, 1% (v/v) AB-serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 0,4 mM L-glutamin, 10 mM HEPES) per cellekultur kolbe for isolering av monocytter ved tilslutning. Etter 1 time, vask av nonadherent fraksjon med RPMI 1640. Tilsett friskt DC-medium supplert med 800 U/mL GM-CSF og 250 U/mL IL-4, og ruge for 3 dager.<ol>
<li>På dag 3 innlegg tilslutning, tilsett 5 mL friskt DC medium som inneholder GM-CSF og IL-4 med en endelig konsentrasjon av 400 U/mL og 250 U/mL per cellekultur kolbe, henholdsvis for DC differensiering.</li>
		<li>Å høste iDCs, forsiktig skylle løst-tilhenger iDCs fra bunnen av cellen kulturen kolbe, på dag 4 innlegg tilhørighet. Gjenta dette trinnet to ganger. For generering av mDCs, Legg til modnings cocktail komponert som følger: GM-CSF (siste konsentrasjon: 40 U/mL), IL-4 (siste konsentrasjon: 250 U/mL), IL-6 (siste konsentrasjon: 1000 U/mL), IL-1β (siste konsentrasjon: 200 U/ml), TNF-α (siste konsentrasjon: 10 ng/ mL), prostaglandin E2 (PGE2; sluttkonsentrasjon: 1 μg/mL).</li>
		<li>Seks dager etter tilslutning (to dager etter induksjon av modning ved hjelp av en cytokin cocktail), skyll mDCs fra bunnen av cellen kulturen kolbe. Gjenta dette trinnet to ganger. Merk: umodne og modne DCs kan sekvensielt generert fra identiske givere i 1 cellekultur kolbe. For å gjøre dette, (i) skille riktig antall iDCs og (II) indusere modning av de resterende cellene i flaskene ved hjelp av cytokin cocktail oppført i trinn 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør iDCs eller mDCs i det respektive cellekultur mediet til 50 mL rør. Høste cellene via sentrifugering på 300 x g i 5 min.<ol>
<li>Forsiktig resuspend (= vask) DCs i 5-10 mL RPMI 1640 per cellekultur kolbe. Kombiner respektive DC suspensjoner i ett rør.</li>
		<li>Definer celle nummeret ved hjelp av et opptellings kammer eller en alternativ metode. Unngå temperaturendringer ved håndtering av iDCs, for å redusere risikoen for fenotypiske endringer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Flow analytiske analyser for å overvåke fenotypiske modning status
<ol><li>Overfør iDCs eller mDCs (0,5 x 106) fra trinn 1.3.1 til et 1,5 ml rør. Harvest cellene via sentrifugering på 3390 x g for 1,5 min. vaske cellene en gang med FACS buffer (PBS supplert med 2% fosterets kalv serum (FCS)).</li>
	<li>Resuspend cellene i 100 μL av antistoff farge oppløsning (FACS buffer) som inneholder spesifikke fluorokromkonjugert antistoffer mot definerte overflate molekyler.<ol>
<li>Bruk følgende antistoffer for å verifisere renhet (CD3-FITC, CD14-PE) i tillegg til modnings status for DCs (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).</li>
		<li>Forbered en unstained prøve i 100 μL av FACS buffer som en kontroll.</li>
		<li>Stain cellene på isen i mørket i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vask deretter cellene to ganger i 1 mL FACS buffer og sentrifuger ved 3390 x g for 1,5 min.</li>
	<li>Til slutt, resuspend cellene i 200 μL av FACS buffer supplert med 2% PFA og analysere cellene ved flyt flowcytometri. Faste celler kan lagres ved 4 ° C i mørket opp til 2 dager.</li>
</ol>3. infeksjon prosedyre av DCs med herpes simplex virus type-1 (HSV-1) og interferens av HSV-1-indusert autophagic Flux via spautin-1 eller bafilomycin-a1
Merk: belastningen HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) som ble brukt i denne studien ble innhentet fra laboratorie belastningen HSV-1-belastning 17 +. Den HSV-1 EGFP belastningen uttrykker forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) som har blitt satt inn i UL43 genet geometriske under kontroll av CMV promoter. EGFP fungerer som en markør for HSV-1-smitte. I tillegg ble belastningen HSV1-RFPVP26 brukt til studier av DC-smitte (tidligere beskrevet i Turan et al., 2019). Dette viruset uttrykker kapsid overflate protein VP26 smeltet til monomer rødt fluorescerende protein (mRFP).
<ol><li>Overfør iDCs eller mDCs (2 x 106) fra trinn 1,3 til et 2 ml rør. Deretter sentrifuger cellene på 3390 x g for 1,5 min og forkaste supernatanten.</li>
	<li>Resuspend forsiktig cellene i infeksjon medium (RPMI 1640 supplert med 20 mM HEPES).<ol>
<li>For å hemme autophagosomal-lysosomal degradering sti, pre-behandle DCs med spautin-1 eller bafilomycin-a1 1 h før infeksjon. Tilsett enten 10 μM spautin-1 eller 1 μM BA1, eller DMSO som ubehandlet kontroll, til smitte mediet. Ruge cellene i en varme blokk ved 300 RPM risting ved 37 ° c for 1 time.</li>
		<li>For infeksjon studier, vaksinere cellene med HSV-1 virions på et mangfold av smitte (MOI) av 2. Tilsett det respektive volumet av MNT buffer (30 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) som mock kontroll. Ruge cellene i en varme blokk ved 300 RPM risting ved 37 ° c for 1 time.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 h innlegg infeksjon (HPI), samle cellene ved 3390 x g for 1,5 min. aspirer inokulum og forsiktig resuspend CELLENE i DC medium som inneholder 40 U/ml GM-CSF, 250 U/ml Il-4 og enten 10 μM spautin-1, 1 μM BA1, eller DMSO som kontroll. Seed mock-behandlet og HSV-1-infiserte celler ved en endelig konsentrasjon av 1 x 106/ml i en 6-brønn plate.</li>
	<li>Ved 16-24 HPI, høste cellene ved skylling (mDCs) eller ved hjelp av en celle skraper (iDCs). Overfør cellene til en 1,5 mL safelock tube.<ol>
<li>Samle cellene via sentrifugering på 3390 x g for 1,5 min og vask pellet gang ved å legge til 1 ml PBS.</li>
		<li>Kraftig resuspend cellene i lyse Rings blanding som inneholder 29 μL av 2x Roti-Load, 1 μL 100 mM MgCl2 og 12,5 U/ml benzonase.</li>
		<li>For cellelyse og DNA-fordøyelsen ved hjelp av benzonase, ruge prøvene ved 37 ° c i 10 min. Deretter denaturere proteinene ved 95 ° c i 10 min.</li>
		<li>Utfør SDS-PAGE og Western Blot analyser for å verifisere proteinnivåer av LC3BI/II, p62, ICP0/5, og GAPDH.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interferens med HSV-1-indusert autophagic Flux via electroporation av iDCs bruker FIP200-siRNA
Merk: den nåværende protokollen for siRNA-electroporation ble modifisert fra Prechtel et al. (2007) og gerer et al. (2017).
<ol><li>Overfør iDCs (12 x 106) ved dag 3,5 innlegg tilslutning til en 50 ml tube. Deretter sentrifuger cellene på 300 x g i 5 min og kast supernatanten. Parallelt utfører du flyt analytiske analyse for å overvåke modnings statusen som beskrevet i trinn 2 (bruk Life/Dead Violet i stedet for CD80-PacBlue).</li>
	<li>Vask forsiktig iDCs i 5 mL OptiMEM uten fenol rød og sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 min. kast supernatanten og forsiktig resuspend iDCs i 200 ΜL av OptiMEM uten fenol rød, og Juster en celle konsentrasjon på 6 x 106/100 μL. Ikke plasser cellene på isen og unngå temperaturendringer. Beveg deg raskt og unngå lange inkubasjons perioder med iDCs i OptiMEM uten at fenol er rød.</li>
	<li>Overfør enten 75 pmol av FIP200-spesifikke siRNA eller 75 pmol av forvrengt siRNA, som en kontroll, til 4 mm elektro kyvetter og tilsett 100 μL (6x106 celler) av celle fjæringen. Direkte puls iDCs bruke electroporation apparatet jeg, bruke følgende innstillinger: 500 V for 1 MS.<ol>
<li>Før den eksperimentelle prosedyren, forberede siRNA suspensjoner i henhold til produsentens instruksjon, alikvot og lagre dem ved-20 ° c. Tin og holde dem på isen når du bruker disse siRNAs for electroporation. Før du electroporating prøvene, Utfør en test puls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter electroporation, direkte overføre iDC i 6-brønn plater med friskt forvarmet DC medium (supplert med 40 U/mL av GM-CSF og 250 U/mL av IL-4). Seed cellene i en endelig konsentrasjon av 1 x 106/ml og plassere dem i en inkubator. Ikke skyll cellene ut av elektro Cuvette.</li>
	<li>Etter 48 h, først undersøke morfologi av electroporated iDCs mikroskopisk. Deretter høster cellene ved hjelp av en celle Scrapper og overføre dem til 15 mL rør. Skyll brønnene med 1 mL PBS supplert med 0,01% EDTA og overføre løsningen i de respektive rørene.</li>
	<li>Deretter deles 6 x 106 IDCs per siRNA tilstand som beskrevet i de neste trinnene.<ol>
<li>Bruk 0,5 x 106 celler for å vurdere modnings status og celle levedyktighet som beskrevet i trinn 2. Bruk følgende antistoffer: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 og Life/Dead fiolett.</li>
		<li>Bruk 1 x 106 celler for Western Blot analyser for å verifisere FIP200-spesifikk knockdown effektivitet. Overfør og høste cellene i en 1,5 mL safelock rør ved sentrifugering ved 3390 x g for 1,5 min. forberede celle lysater som beskrevet i trinn 3,4 og utføre Western Blot analyser.</li>
		<li>Bruk de resterende cellene (4,5 x 106) til eksperimenter med HSV-1-smitte. For hver eksperimentell tilstand, overføre 2,25 x 106 iDCs i 2 ml rør og enten infisere dem med HSV1 på en Moi av 2 eller legge mnt buffer som en uekte kontroll. Utfør infeksjonen som beskrevet i trinn 3,3.</li>
		<li>Ved 20 HPI, høste cellene ved hjelp av en celle skraper og forberede celle lysater for Western Blot analyser som beskrevet i trinn 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. modulering av autophagosome-lysosomal Pathway i HSV-1-infiserte mDCs med KIF1B/2A-siRNA electroporation
<ol><li>Transfer iDCs (24 x 106) ved dag 4 innlegg tilslutning til en 50 ml tube. Deretter sentrifuger cellene på 300 x g i 5 min og kast supernatanten.</li>
	<li>Forsiktig resuspend (= vask) iDCs i 8 mL PBS, for å justere en endelig celle konsentrasjon på 3 x 106/ml. Overfør 3 x 106 celler til 1,5 ml rør og høste cellene ved 3390 x g for 1,5 min.</li>
	<li>Resuspend iDCs i 100 for μL av buffer P3 som inneholder tilleggs miksen (i henhold til produsentens anvisninger; electroporation sett apparat II) og enten (i) 75 pmol av KIF1B spesifikke siRNA, (II) 75 pmol av KIF2A-spesifikke siRNA, eller (III) begge. Bruk (IV) den respektive mengden kryptert siRNA som en kontroll. Forbered to rør for hver siRNA tilstand (6 x 106 celler) og overføre suspensjoner i separate elektro kyvetter. Direkte puls iDCs bruke pulsen "EH-100" ved hjelp av electroporation apparater II.<ol>
<li>Før den eksperimentelle prosedyren, forberede siRNA suspensjoner i henhold til produsentens instruksjon, alikvot og lagre dem ved-20 ° c. Tin og holde dem på isen når du bruker disse siRNAs for electroporation. Ikke plasser iDCs på is og unngå temperaturendringer. Flytt på raskt og unngå lange inkubasjons av iDCs i PBS eller buffer P3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rett etter electroporation, tilsett 500 μL av pre-varmet RPMI 1640 til elektro kyvetter. Ruge cellene i en inkubator for 5-10 min. Overfør iDCs til 6-brønn plater med friskt forvarmet DC-medium (supplert med 40 U/mL GM-CSF og 250 U/mL av IL-4). Kombiner respektive forhold til en brønn, frø cellene i en endelig konsentrasjon av 1 · 106/ml og plasser dem i en inkubator.</li>
	<li>4 h etter inkubasjons, tilsett modnings cocktail som inneholder cytokiner som er listet opp i trinn 1.2.2. Merk: Forbered en prøve fra ikke-electroporated DCs (1 x 106) som kontroll for flyt analytiske analyser 2 dager etter electroporation. Behandle kontroll celler analogt til electroporated prøver.</li>
	<li>To dager etter electroporation, høste celler ved blanding og overføre til 15 mL rør. Skyll brønnene med 1 mL PBS og Overfør suspensjonen i de respektive rørene. Split 6 · 106 DCS per siRNA tilstand som beskrevet i følgende trinn:<ol>
<li>Bruk 0,25 x 106 DCS (electroporated og ikke-electroporated) for å kontrollere modnings status og celle levedyktighet som beskrevet i trinn 2. Bruk følgende antistoffer: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7, og Life/Dead fiolett.</li>
		<li>Bruk 0,75 x 106 celler for Western Blot-analyser for å vurdere KIF1B/2a-spesifikk knockdown effektivitet. Samle cellene i en 1,5 mL safelock rør ved sentrifugering ved 3390 x g for 1,5 min. forberede celle lysater som beskrevet i trinn 3,4 og utføre Western Blot analyser.</li>
		<li>Bruk de resterende cellene (5 x 106) fra hver siRNA tilstand og utføre HSV-1 infeksjon eksperimenter. For hver eksperimentell tilstand, overføre 2,5 x 106 iDCs i 2 ml rør og enten infisere dem med HSV-1 på en Moi av 2 eller legge mnt buffer som en uekte kontroll. Utfør infeksjonen som beskrevet i trinn 3,3.</li>
		<li>Ved 20 h post infeksjon, høste cellene ved blanding og forberede celle lysater for Western Blot analyser for å verifisere induksjon av HSV-1-indusert autophagic omsetning, som beskrevet ovenfor i trinn 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro.">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).</li><li>Kummer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+induces+CD83+degradation+in+mature+dendritic+cells+with+immediate-early+kinetics+via+the+cellular+proteasome.">Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome.</a> Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).</li><li>Kruse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infected+with+herpes+simplex+virus+type+1+exhibit+inhibited+T-cell+stimulatory+capacity.">Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity.</a> Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).</li><li>Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dendritic+cell+maturation+by+herpes+simplex+virus.">Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus.</a> European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).</li><li>Prechtel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+mature+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+dramatically+reduces+lymphoid+chemokine-mediated+migration.">Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration.</a> Journal of General Virology. 86, 1645-1657 (2005).</li><li>Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+induces+rapid+degradation+of+CYTIP,+thereby+modulating+adhesion+and+migration.">Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration.</a> Blood. 118 (1), 107-115 (2011).</li><li>Cohrs, R. J., Gilden, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+herpesvirus+latency.">Human herpesvirus latency.</a> Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).</li><li>Grinde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses:+latency+and+reactivation+-+viral+strategies+and+host+response.">Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response.</a> Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).</li><li>Whitley, R. J., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+infections.">Herpes simplex virus infections.</a> The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).</li><li>Turan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+degradation+of+lamins+facilitates+the+nuclear+egress+of+herpes+simplex+virus+type+1.">Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).</li><li>Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+yeast+demonstrated+with+proteinase-deficient+mutants+and+conditions+for+its+induction.">Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction.</a> The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).</li><li>Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+machinery+and+regulation.">Autophagy: machinery and regulation.</a> Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).</li><li>Bodemann, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RalB+and+the+exocyst+mediate+the+cellular+starvation+response+by+direct+activation+of+autophagosome+assembly.">RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly.</a> Cell. 144 (2), 253-267 (2011).</li><li>Bjorkoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+GABARAP+and+GATE16+localize+to+autophagosomal+membrane+depending+on+form-II+formation.">LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation.</a> Journal of Cell Science. 117, 2805-2812 (2004).</li><li>Pankiv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+binds+directly+to+Atg8/LC3+to+facilitate+degradation+of+ubiquitinated+protein+aggregates+by+autophagy.">p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).</li><li>Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+autophagy+by+lysosomal+positioning.">Regulation of autophagy by lysosomal positioning.</a> Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+quantitative+high-throughput+image+screening+identified+novel+autophagy+modulators.">A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators.</a> Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Cellular+Spheroid-Based+Autophagy+Screen+Applying+Live+Fluorescence+Microscopy+Identifies+Nonactin+as+a+Strong+Inducer+of+Autophagosomal+Turnover.">A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).</li><li>Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+compound+database:+A+resource+connecting+autophagy-modulating+compounds,+their+potential+targets+and+relevant+diseases.">Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases.</a> Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin1+controls+the+levels+of+p53+by+regulating+the+deubiquitination+activity+of+USP10+and+USP13.">Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13.</a> Cell. 147 (1), 223-234 (2011).</li><li>Mauvezin, C., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+disrupts+autophagic+flux+by+inhibiting+both+V-ATPase-dependent+acidification+and+Ca-P60A/SERCA-dependent+autophagosome-lysosome+fusion.">Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion.</a> Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).</li><li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1,+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H(+)-ATPase,+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells.">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li><li>Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mRNA+as+Universal+Technology+Platform+to+Transfect+a+Variety+of+Primary+Cells+with+Antigens+and+Functional+Proteins.">Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).</li><li>Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+knockdown+in+monocyte-derived+dendritic+cells+by+small+interfering+RNA+leads+to+a+diminished+T+cell+stimulation.">CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.</a> The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).</li><li>Pfeiffer, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukoreduction+system+chambers+are+an+efficient,+valid,+and+economic+source+of+functional+monocyte-derived+dendritic+cells+and+lymphocytes.">Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes.</a> Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).</li><li>Villadangos, J. A., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle,+migration+and+antigen+presenting+functions+of+spleen+and+lymph+node+dendritic+cells:+limitations+of+the+Langerhans+cells+paradigm.">Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm.</a> Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).</li><li>Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+on+dendritic+cells:+more+than+just+a+marker+for+maturation.">CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation.</a> Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).</li><li>Yang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+interpretation+of+current+autophagy+inhibitors+and+activators.">Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).</li><li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons.">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biology. 11, 73-81 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+induces+caspase-independent+cell+death+in+hepatocellular+carcinoma+cells+via+targeting+of+autophagy+and+MAPK+pathways.">Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways.</a> Scientific Reports. 6, 37052 (2016).</li><li>Hale, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+modulators+of+autophagic+flux+in+an+image-based+high+content+siRNA+screen.">Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen.</a> Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).</li><li>Lipinski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+reveals+multiple+mTORC1+independent+signaling+pathways+regulating+autophagy+under+normal+nutritional+conditions.">A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions.</a> Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).</li><li>Orvedahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+genome-wide+siRNA+screen+identifies+selective+autophagy+factors.">Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors.</a> Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).</li><li>Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+autophagy+by+shRNA+knockdown:+cautions+and+recommendations.">Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations.</a> Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+modulates+p53+activity+to+regulate+cell+cycle+and+survival+during+metabolic+stress.">Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress.</a> Science. 336 (6078), 225-228 (2012).</li><li>Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin-1+is+required+for+chromosome+congression+and+proper+outer+kinetochore+assembly.">Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly.</a> EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).</li><li>Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+behind+autophagy:+the+unconventional+roles+of+ATG+proteins.">Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins.</a> Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).</li><li>Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+divergent+functions+of+Beclin+1+and+Beclin+2.">Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2.</a> Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Omfanget av denne protokollen inkluderer (i) håndtering av humant monocytt-avledet iDCs samt mDCs, (II) deres infeksjon med HSV-1, (III) deres behandling med forbindelser kjent for å hemme autofagi, og (IV) deres electroporation med siRNA bruker to forskjellige tekniske oppsett. Ved hjelp av denne protokollen, autophagic Flux kan enten blokkeres i HSV-1-infiserte iDCs eller indusert i HSV-1-infiserte mDCs.
Siden DCs, og spesielt iDCs, er svært sårbare celler, arbeider med disse cellene innebærer ganske delikate trinn. For DC generasjon, anbefaler vi å bruke fersk isolert Pbmc, og for å unngå deres kryonisk bevaring, for å oppnå høyere celle gir. Videre, når du håndterer iDCs under eksperimenter, inkludert deres påfølgende dyrking, forebygge harde eller langvarige temperaturendringer. Ellers iDCs kan gjennomgå fenotypiske endringer og dermed er det nødvendig å verifisere sine umodne fenotype ved flyt flowcytometri. Merk, i motsetning til sine eldre motparter, iDCs mangler distinkte markører, for eksempel CD80, CD83, og CD8628,29. Infeksjonen av iDCs og mDCs med HSV-1 er en veletablert metode2,3,4,5,6,10. Vi og andre viste at DCs er svært utsatt for HSV-1-smitte, når en MOI av 1 eller 2 har blitt brukt (figur 2). I våre hender, holde volumet av infeksjonen medium på lave nivåer (1-3 x 106 celler i 250-350 μL) vil føre til bedre smitte effektivitet.
En klassisk tilnærming for å forstyrre en gitt distinkte cellulære veien er bruken av spesifikke forbindelser. En variasjon av annerledes modulatorer av autofagi, i.e. aktivator likeledes idet hemmere, er aktuelle anvendelig30. Om HSV-1-indusert autofagi i DCs, Turan et al., (2019) nylig viste den hemmende effekten av spautin-1 og bafilomycin-a1 (BA1) på autophagic omsetning i iDCs10. Denne teknikken for autofagi hemming er egnet for kombinasjonen med en påfølgende HSV-1-infeksjon, siden verken infeksjons raten eller modnings status for DCs (spesielt iDCs) svekkes. I fremtidige programmer, kan denne inhibitor-baserte tilnærmingen brukes også i kombinasjon med andre smittsomme midler, stress forhold, slik som sult, så vel som for ulike celletyper. Men når du bruker hemmere, begrensninger oppstår i å bestemme egnet konsentrasjon for effektiv autofagi hemming, uten alvorlig påvirker celle levedyktighet. Den store begrensningen ved bruk av hemmere er imidlertid forekomsten av potensielle off-mål eller bivirkninger, som kan føre til villedende resultater31,32.
Den andre tilnærmingen til å forstyrre autofagi, dekket i den nåværende protokollen, er den spesifikke knockdown som bruker siRNA33,34,35. På den ene siden, brukte vi electroporation apparater jeg til spesielt ablate uttrykk for FIP200, og dermed hemme HSV-1-indusert autophagic omsetning i iDCs. På den annen side, vi taus to forskjellige KIF proteiner (dvs. KIF1B og KIF2A), ved hjelp av electroporation apparater II, for å lette autophagic Flux i HSV-1-infiserte mDCs. Begge electroporation protokollene resulterte i en nesten fullstendig ablasjon av FIP200 i iDCs, og KIF1B/KIF2A i mDCs, som ble verifisert via Western Blot-analyser (Figur 4a, figur 5a). I motsetning til electroporation apparater jeg, som ikke påvirker levedyktigheten til DCs, electroporation av mDCs bruker electroporation apparat II resulterer i litt høyere forekomst av døde celler (Figur 4b, figur 5b ). Derfor, i fremtidige programmer, electroporation apparater jeg skal fortrinnsvis brukes for både iDCs og mDCs. Bemerkelsesverdig, både siRNA-baserte teknikker, til modulere autophagic Flux, er kompatible med påfølgende HSV-1 infeksjon av enten iDCs eller mDCs. Videre er verken umodne fenotype av iDCs eller eldre fenotype av mDCs endres post electroporation.
Electroporation av iDCs ved hjelp av FIP200-spesifikke siRNA er en effektiv og svært spesifikk metode for gen knockdown samt hemming av autophagic Flux ved HSV-1-smitte. I tillegg til den spesifikke deaktivering av FIP200, kan denne protokollen tilpasses for å slå av andre autophagic komponenter, delta på ulike trinn under autophagic Cascade. Men å identifisere det aktuelle målet for effektiv siRNA-mediert hemming av autofagi omfatter flere aspekter av bekymring. For det første, knockdown effektivitet av autofagi gener (ATG) samsvarer ikke nødvendigvis med effektiv hemming av autofagi og er svært avhengig av det spesifikke ATG-proteinet som er taus36. Dernest er distinkte ATG proteiner i tillegg involvert i trasé skiller seg fra autofagi, og dermed deres ablasjon kan også føre til ugunstige bivirkninger37,38,39. For det tredje kan ulike ATGs har redundante funksjoner, og dermed knockdown av en komponent kan ikke være tilstrekkelig til å hemme autofagi (f. eks, beclin-1 og beclin-2)40.
I tillegg er den electroporation apparat I-basert electroporation protokoll for DCs også egnet for mRNAs, og kan brukes til en rekke andre primære celletyper, for eksempel Pbmc25. Dette systemet gir dermed en generell strategi for å levere distinkte RNA-arter i ulike primær celletyper. Avslutningsvis presenterer vi to protokoller for å hemme autophagic Flux, enten ved hjelp av en hemmer-eller siRNA-basert tilnærming kombinert med påfølgende HSV-1-smitte av iDCs. Videre beskriver vi en siRNA electroporation tilnærming for å indusere autophagic Flux i mDCs upon HSV-1-smitte.

Generering av menneskelige monocytt-avledede dendrittiske celler (DCs) utgjør en hensiktsmessig in vitro-modell for å studere funksjonene og biologi av denne viktige immun celletypen. Isolert sett samt differensiering av monocytter i DCS har vært godt etablert de siste årene1,2. Infeksjonen av DCS med α-herpesvirus herpes simplex virus type-1 (HSV-1) fungerer som en modell system for å studere HSV-1-mediert modulasjoner av DC Biology2,3,4,5,6 . Dette er spesielt viktig å belyse hvordan herpesviruses dempe eller hemme potent antiviral immunresponser, å etablere ventetid i uimottakelig-privilegert nisjer inne i verten7,8. I denne forbindelse er herpesviruses svært vellykkede patogener som er utbredt over hele befolkningen, og som har nådd en Sero på opptil 90% i henhold til geografisk område9. Å forstå og muligens hindre dette, mer innsikt i HSV-1-mediert modulasjoner av vertens immunsystem, og spesielt av immunceller som DCs, er nødvendig.
En helt ny observasjon om samspillet mellom DCs med HSV-1 ble nylig publisert av Turan et al.10. Forfatterne viste at gjennomføringen av HSV-1 replikering er strengt avhengig av modnings status av DCs. I iDCs, komplett replikering av HSV-1 er tilrettelagt av autofagi-avhengige mekanismer. Mens HSV1 induserer autofagi i begge, iDCs og mDCs, autophagic Flux er observert bare i iDCs. Dette i sin tur forenkler kjernefysisk utgående av viral capsids via autophagic nedbrytning av kjernefysiske lamins i iDCs. For å få mekanistisk innsikt i denne HSV-1-indusert degradering sti i iDCs versus mDCs, nye og effektive strategier er avgjørende for å undersøke autophagic Flux.
Macroautophagy (autofagi) er en godt bevart flertrinnsprosess rettet mot intracellulære proteiner eller hele organeller for lysosomal fordøyelse11. Simplistically, autofagi kan deles inn i (i) initiering, (II) membran kjernedannelse, (III) vesicle ekspansjon, og (IV) autophagosome-lysosome Fusion fase12. Under initiering (i), komponenter som den aktiverte ULK1/2 kinase kompleks, som inneholder fokus vedheft kinase familie samspill protein av 200 kD (FIP200), er avgjørende for å aktivere beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks. Deretter, membran kjernedannelse (II) initierer phagophore formasjon13, som engulfs cytoplasmatiske cargos som er preget av molekyler som p6214. Under vesicle ekspansjon og autophagophore modning (III) mikrotubulinettverket-assosiert protein lys kjede 3 (LC3)-Jeg er konvertert til sin lipidated form LC3-II som er satt inn i autophagosomal membranen. Således, LC3-jeg å-II omdanne ratene er en indikatoren for autofagi induksjon av speilet dannelsen av modne autophagosomes15,16. Ved autophagosome-lysosome fusjon (IV), ikke bare autophagic lasten, men også forbundet p62 og LC3-II proteiner nedbrytning (f. eks, av hydrolyse). Således, tap av p62 og LC3-II tjene som markører for autophagic Flux17. Fusjonen av autophagosomes med lysosomer, og dermed etter autophagic omsetning, er svært avhengig av intracellulære lysosomal lokalisering. Dette er blant annet regulert av kinesin familiemedlemmer KIF1B og KIF2A, som ble vist å negativt påvirke autophagosome-lysosome Fusion18. Interessant, protein uttrykk for KIF1B og KIF2A er indusert på DC modning og er dermed ansvarlig for ineffektiv autophagic Flux i HSV-1-infiserte mDCs, som hemmer komplett HSV-1 replikering10.
Eksperimentelle forsøk på å modulere autofagi inkludere bruk av forbindelser kjent for å indusere eller hemme denne bestemte Pathway19,20,21. I denne studien beskriver vi to hemmer-baserte strategier for å blokkere autophagic omsetning i HSV-1-infiserte iDCs. Den første sammensatte brukes i våre eksperimenter er spesifikk og potent autofagi inhibitor-1 (spautin-1), som ble beskrevet for å fremme beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks degradering i initiering fasen av autofagi22. Den andre sammensatte brukes i denne studien er bafilomycin-a1 (BA1), en V-ATPase inhibitor som blokkerer sent autophagic hendelser (dvs. autophagosome-lysosome Fusion samt autolysosome forsuring)23,24. Bruken av en av disse to hemmere før iDC infeksjon med HSV-1 potently hemmer autofagi, men forstyrrer ikke effektiv viral genuttrykk. Således, dette hemmer-basert strategi før HSV-1-smitte tilbyr et kraftig verktøy for å hemme HSV-1-indusert autophagic Flux som lett kan utvides for en mengde ulike celletyper og virus, som også potensielt indusere autofagi.
For å overvinne en stor downside av en inhibitor-basert tilnærming (dvs. løs off-Target effekter), utviklet vi en siRNA-basert metode for å blokkere autophagic Flux i (HSV-1-smittet) iDCs. Teknikken til siRNA electroporation representerer en kraftig alternativ strategi, via selektiv ablasjon av uttrykk for forskjellige proteiner (dvs. autophagic komponenter). I våre eksperimenter ble iDCs electroporated med FIP200-spesifikke siRNA ved hjelp av electroporation apparat I (se tabell over materialer) og en modifisert protokoll beskrevet av gerer et al. (2017) og Prechtel et al. (2007), for å hemme autofagi under Initiation Phase25,26. Denne teknikken tillot oss å spesifikt knockdown FIP200 uttrykk i iDCs, uten å forstyrre celle levedyktighet og deres umodne fenotype to dager etter electroporation. Bemerkelsesverdig, HSV-1 infeksjon ble etablert i disse electroporated iDCs speilet av effektive virus protein uttrykk. Denne siRNA-baserte teknikken gir en unik fordel (dvs. at en rekke forskjellige autophagic komponenter, selv i kombinasjon), kan være spesielt målrettet for ablasjon av deres uttrykk.
I denne studien, vi videre beskriver en siRNA-basert metode for å indusere autophagic Flux også i HSV-1-smittet mDCs. I dette tilfellet ble iDCs electroporated med siRNA rettet mot KIF1B og KIF2A før DC-modning ved hjelp av electroporation apparat II (se tabell over materialer). Siden begge proteinene er upregulated under DC modning og kjent for å negativt regulere fusjon av autophagosomes med lysosomer10,18, deres knockdown sterkt indusert autophagic Flux i mDCs upon HSV-1 infeksjon. Således gjorde den siRNA-baserte teknikken oss i stand til å spesielt indusere autophagic omsetning via forstyrrer KIF protein uttrykk i mDCs, og kan dermed etterligne deres uttrykks nivåer i iDCs.
Oppsummert presenterer vi to forskjellige metoder for å hemme autophagic Flux i HSV-1-infiserte iDCs. Mens den første hemmer-baserte tilnærmingen utgjør en enkel, billig og rask måte å forstyrre autophagic degradering, den andre siRNA-baserte teknikken er mer spesifikk og en svært egnet metode for å støtte og verifisere resultatene av hemmer-baserte Eksperimenter. I tillegg beskriver vi en metode for å indusere autophagic Flux også i HSV-1-infiserte mDCs, via siRNA-mediert knockdown av to KIF proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB-Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Dendritic cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>9007281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Western Blot Detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7074</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>tlrl-baf1</td>
			<td>inhibition of autophagy and lysosomal degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Chamber Fastblot B44</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>557648</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: G043H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>561692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: B-ly6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555398</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (mouse, FITC)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555332</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 (mouse, V450)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>560442</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: L307.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 (mouse, APC)</td>
			<td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>17-0839-41</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: HB15e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>553692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging</td>
			<td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIP200 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>12436</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D10D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (mouse)</td>
			<td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB2302</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:5000 
			Clone: MAB374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td>
			<td>BioRad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>165-2112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF (4x104 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA&#8208;DR (mouse, APC-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>307618</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td>
			<td>BioVex</td>
			<td></td>
			<td>DC infection 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP0 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 11060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP5 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-56989</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946; (0.1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1404-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF1B (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-376246</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: E-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF2A (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-271471</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>3868</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>L34964</td>
			<td>L/D staining in Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td>
			<td>04-03-9391/01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 2.0 RS</td>
			<td>Heraeus (Hanau, Germany)</td>
			<td>75015505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Brand (Wertheim, Germany)</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td>
			<td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p62 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>88588</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D5L7G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16 %</td>
			<td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectSpin 24 Plus</td>
			<td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td>
			<td>C2500-R-PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (1 mg/mL)</td>
			<td>Pfizer (Berlin, Germany)</td>
			<td>BE130681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel system MiniProtean II</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>1652960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform wt 15</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>042-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A151.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1 (4x)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>K929.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; (10 &#956;g/mL)</td>
			<td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 0.2 &#956;m nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>10600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td>
			<td>3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induserer autofagi i begge, umodne dendrittiske celler (iDCs) så vel som modne dendrittiske celler (mDCs), mens autophagic Flux er bare observert i iDCs. For å få mekanistisk innsikt utviklet vi effektive strategier for å forstyrre HSV-1-indusert autophagic omsetning. En hemmer-basert strategi, å modulere HSV-1-indusert autofagi, utgjør det første valget, siden det er en enkel og rask metode. For å omgå potensielle løs-effekter av slike forbindelser, utviklet vi en alternativ siRNA-basert strategi, for å modulere autophagic omsetning i iDCs ved HSV-1-smitte. Faktisk, electroporation av iDCs med FIP200-spesifikke siRNA før HSV-1-smitte er en svært spesifikk og vellykket metode for å ablate FIP200 protein uttrykk og dermed å hemme autophagic Flux. Begge presentert metoder resultere i effektiv hemming av HSV-1-indusert autophagic omsetning i iDCs, der siRNA-baserte teknikken er mer målrettet spesifikke. En ekstra siRNA-basert tilnærming ble utviklet for å selektivt slå protein uttrykk av KIF1B og KIF2A, tilrettelegge autophagic omsetning på HSV-1-smitte i mDCs. Som konklusjon, teknikken av siRNA electroporation representerer en lovende strategi, å selektivt ablate uttrykk for forskjellige proteiner og å analysere sin innflytelse på en HSV-1 infeksjon.

I dette manuskriptet beskriver vi metoder for å forstyrre HSV-1-indusert autofagi i dendrittiske celler. Dette inkluderer generering av humant monocytt-avledet iDCs og mDCs, som ble phenotypically analysert av Flow flowcytometri (figur 1). På dag 4 innlegg tilslutning, DCs viser en umoden fenotype preget av svake uttrykk for CD80, CCR7, og CD83 samt høy CD11c og middels MHCII uttrykk. Siden CD3 og CD14 signaler mangler, kan T celle og monocytt forurensninger utelukkes. På dag 6 innlegg tilslutning (dvs. dag 2 innlegg induksjon av modning), DCs viser en moden fenotype reflekteres av en betydelig økning i CD80, CCR7, CD83, og MHC-II overflate uttrykk. Infeksjon med en eGFP-uttrykker HSV-1-stamme(figur 2) resulterer i en nesten fullstendig infeksjon av enten IDCs (figur 2et øvre panel) eller mDCs (figur 2et nedre panel, figur 2B), basert på sterke GFP-signaler analysert av fluorescens mikroskopi, samt strømnings flowcytometri.
Som demonstrert i vår siste rapport, har HSV-1 induserer autofagi både i iDCs og mDCs, men autophagic omsetning forekommer i iDCs bare10. I en første tilnærming, behandlet vi iDCs og mDCs med spautin-1 (figur 3a)-for å blokkere autofagi initiering-eller Bafilomycin-a1 (BA1; Figur 3B)-for å hemme den endelige autophagosome-lysosome fusjon. Ved HSV-1 infeksjon av iDCs i fravær av spautin-1 og BA1, autophagic Flux er speilet av nedgangen av p62 og LC3B uttrykk, henholdsvis. I kontrast, HSV-1-smitte av mDCs i fravær av spautin-1 påvirker ikke p62 uttrykk, mens spautin-1 og BA1 behandling induserer en opphopning av LC3B-II. Dette reflekterer induksjon av autofagi, men en svikt i autophagic omsetning i mDCs. I iDCs, spautin-1 pre-Treatment gjenoppretter sterkt autophagic nedbrytning av p62 ved HSV-1-smitte, på grunn av hemming av autofagi under initiering fase. Ved pre-behandling med BA1, mock-og HSV-1-infiserte iDCs viser en sterk opphopning av LC3B-II proteinnivåer, indikerer vellykket hemming av autophagic omsetning via blokkering sen autophagosome-lysosome fusjon. I samsvar med dette, spautin-1 og BA1 pre-behandling av mDCs også resulterer i stabile p62 og økt LC3B-II proteinnivåer, henholdsvis.
I en annen metode for å svekke autophagic Flux, siRNA electroporation målretting FIP200 er undersøkt om dens evne til å blokkere autophagic Flux i HSV-1-infiserte iDCs. Som vist i Figur 4Able sterkt reduserte FIP200 proteinnivåer påvist i iDCs 48 h post electroporation, sammenlignet med kontroll siRNA. På dette tidspunktet punkt, iDCs ikke viser noen tegn til celle død (Figur 4B) og opprettholde sin umodne fenotype (Figur 4C). Infeksjon av FIP200-taus iDCs med HSV-1 avslører en sterk nedgang i autophagic Flux i forhold til deres kontroll siRNA-behandlet kolleger (Figur 4D). Dette er ledsaget av økt proteinnivåer av LC3B samt p62 når FIP200 er taus i HSV-1-infiserte iDCs.
I et omvendt forsøk, studerte vi om siRNA-mediert ablasjon av KIF1B og KIF2A protein uttrykk muliggjør autophagosomal-lysosomal omsetning også i HSV-1-infiserte mDCs. Dermed ble iDCs electroporated brukerspesifikke siRNAs målretting enten ett eller begge av disse proteinene, og cellene ble senere modnet (figur 5). 2 dager etter electroporation, mDCs viser en sterk reduksjon i KIF1B og/eller KIF2A protein uttrykk, når bestemte siRNAs ble brukt (figur 5a). Denne metoden også gjorde verken føre til fremtredende celle død (figur 5B) heller ikke til endringer i deres fenotypiske modning status (figur 5C). Å støtte viktigheten av KIF1B og KIF2A under autophagosomal-lysosomal degradering, deres nedbryting før HSV-1-infeksjon Letter en økt autophagic Flux i mDCs. Dette gjenspeiles av redusert rest p62 proteinnivåer, i motsetning til den respektive kontroll tilstand (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg"> Figur 1: fenotypiske karakterisering av humant monocytt-avledet iDCs og mDCs ved hjelp av strømnings flowcytometri. DCs ble generert og farget med spesifikke antistoffer for å verifisere deres renhet: (A) CD3 å ekskludere T-celle forurensninger, (B) CD14 å utelukke forurensning med monocytter, og (C) CD11c som en markør for DCS. For å vurdere sin fenotypiske modnings status ble følgende antistoffer brukt: (D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83, og (G) MHCII. Disse molekylene er svært uttrykt på mDCs og dermed tillate diskriminering mellom umodne og modne DC fenotype. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg"> Figur 2: mikroskopisk så vel som Flow analytiske analyser av HSV-1-infiserte iDCs og mDCs. iDCs og mDCs ble smittet med en HSV-1-belastning som uttrykker EGFP (HSV-1 EGFP), for å tillate kvantifisering av infeksjons raten basert på GFP-signalet. (A) mikroskopiske analyser av GFP-positive HSV-1-infiserte IDCs og mDCs smittet på en Moi av 2, sammenlignet med sine infiserte kolleger, ved 24 HPI. For å visualisere infiserte celler, ble GFP fluorescens overvåket. Scale bar representerer 400 μm. (B) Flow analytiske måling av mock-eller HSV-1-infiserte mDCs under infeksjon Kinetics. Øvre paneler (svart foret histogrammer) viser mock tilstand, lavere paneler (svart fylte histogrammer) viser HSV-1-infiserte celler etter den angitte tiden poeng etter smitte. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg"> Figur 3: Spautin-1 og b afilomycin-a1 modulere autophagic Flux i HSV-1-infiserte iDCs. iDCs og mDCs ble behandlet med (A) spautin-1 eller (B) BAFILOMYCIN-a1 (BA1) for 1 h før infeksjon. Celler ble senere mock-eller HSV-1-smittet (HSV1-RFPVP26) ved hjelp av en MOI av 2. Etter 16-18 h ble DCs høstet og protein lysater ble utsatt for vestlig blotting for å bestemme uttrykk for p62 eller LC3B-I/-II som autophagic markører, ICP0 som infeksjonskontroll og GAPDH som belastnings kontroll. LC3B-I og LC3B-II proteinnivåer ble kvantifisert og normalisert til referanse protein GAPDH bruker Bio1D (optisk tetthet). Forholdet mellom normalisert LC3B-II til normalisert LC3B-I signaler vises. Dette tallet er modifisert og tilpasset fra © 2019 Turan et al. opprinnelig publisert i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg"> Figur 4: analyse av autophagic Flux i HSV-1-infiserte iDCs upon FIP200-siRNA electroporation. iDCs var electroporated med kontroll siRNA eller FIP200-spesifikke siRNA ved hjelp av electroporation apparater I. (A) DCS ble analysert om effektiviteten av FIP200 knockdown 48 h post electroporation, ved å utføre Western Blot analyser. (B) celle levedyktighet samt (C) modning status ble analysert før electroporation (lyseblå histogrammer) og 48 h post (mørk blå og grå histogrammer) electroporation av flyt flowcytometri. Median verdier for tre ulike donorer vises. Etter å ha bekreftet effektiv knockdown av FIP200 og umodne fenotype, celler var HSV-1-smittet (HSV-1 EGFP) ved hjelp av en MOI av 2. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express 5,0. (D) ved 20 h post infeksjon, celler ble utsatt for Western Blot analyser for å bestemme uttrykk for LC3B-I/-II og p62 som autophagic markører. ICP5 ble oppdaget som infeksjonskontroll og GAPDH som belastnings kontroll. Paneler A og D er blitt modifisert og tilpasset fra © 2019 Turan et al. opprinnelig publisert i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg"> Figur 5: siRNA-mediert ablasjon av KIF1B og/eller KIF2A modulerer autophagic omsetning i HSV-1-infiserte mDCs. iDCs ble electroporated med KIF1B-spesifikke og/eller KIF2A-spesifikke siRNA, samt kontroll siRNA, ved hjelp av electroporation apparater II. Ved 4 h post electroporation, modning ble indusert via tilsetning av en modning cocktail. På 48 h post electroporation ble DCs analysert angående (A) effektiviteten av KIF knockdown via vestlig blotting, (B) celle levedyktighet samt deres (C) fenotypiske modnings status ved hjelp av Flow analytiske analyser (to forskjellige givere vises). "w/o EP" betyr uten electroporation, men etter induksjon av modning; "post Control EP" betyr post electroporation brukerkontroll siRNA; "post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP" betyr post electroporation ved hjelp av KIF1B-og/eller KIF2A-spesifikke siRNA. Etter å ha bekreftet effektiv knockdown av KIF1B og/eller KIF2A og de modne fenotype, celler var HSV-1-smittet (HSV-1 EGFP) ved hjelp av en MOI av 2. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express 5,0. (D) celler ble utsatt for Western Blot analyser 20 h innlegg infeksjon, for å vurdere uttrykk for p62 som en autophagic markør. ICP5 ble brukt som en infeksjonskontroll, og GAPDH som lasting kontroll. Tall A og D er blitt modifisert og tilpasset fra © 2019 Turan et al. opprinnelig publisert i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

I denne studien, presenterer vi hemmer-og siRNA-baserte strategier for å forstyrre autophagic Flux i herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infiserte monocytt-avledet dendrittiske celler.

siRNA electroporation til modulere Autofagi i herpes simplex virus type 1-infiserte monocytt-avledet dendrittiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Vår protokoll beskriver metoder for effektivt å forstyrre HSV-1 indusert autofagisk omsetning i dendrittiske celler. Og spesielt sammenligner vi en inhibitorbasert med en siRNA-basert strategi for å blokkere autofagi før infeksjon. Mens den inhibitorbaserte interferensen med autofagi omfatter potensielle og spesifikke off-target effekter, er vår utviklede siRNA-baserte strategi mer målspesifikk.Viktigere, begge presenterte teknikker påvirker ikke modningsstadiene av sykdommen. Å demonstrere prosedyren vil være Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, og Alexandra Duthorn, en gradstudent, fra laboratoriet mitt. Begynn med å høste umodne dendrittiske celler eller iDCer ved å skylle de løst vederlige cellene forsiktig fra bunnen av cellekulturkolben på dag fire etterlevelse.Legg modningscocktail til cellene for å generere modne dendrittiske celler eller mDCer. To dager etter induksjon av modning, skyll mDCene fra bunnen av cellekulturkolben. Gjenta skyll to ganger, og overfør deretter iDCene og mDCene til 50 milliliter rør i deres respektive kulturmedium.Høst cellene via sentrifugering på 300 ganger g i fem minutter. Gjenoppus cellene forsiktig i fem til 10 milliliter RPMI 1640 per cellekulturkolbe og kombiner de respektive DC-suspensjonene i ett rør. Kvantifisere cellene ved hjelp av et tellekammer som sørger for å unngå temperaturendringer ved håndtering av DCs.Overfør to millioner IDCer eller mDCer til et to milliliter rør, sentrifuger dem på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter og kast supernatanten. Forsiktig resuspend cellene i infeksjon medium. Hemm den autofagosomale lysosomale nedbrytningsveien ved å tilsette 10 mikromolar spautin-1 eller en mikromolar bafilomycin A1 til infeksjonsmediet en time før infeksjon.Legg DMSO for ubehandlet kontroll og inkuber cellene på en varmeblokk ved 37 grader Celsius med risting ved 300 RPM. For infeksjonsstudier inokulerer cellene med HSV-1 virions ved et mangfold av infeksjon på to. Legg til det respektive volumet av MNT-buffer som en mock-kontroll og inkuber cellene på en varmeblokk ved 37 grader Celsius i en time med risting.En time etter infeksjon, samle cellene via sentrifugering på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter, deretter aspirere inokulumet forsiktig og resuspend cellene i DC medium. Seed mock behandlet og HSV-1 infiserte celler i en endelig konsentrasjon av en million celler per milliliter i en seks-brønns plate. Ved 16 til 24 timer etter infeksjon, høst iDCer ved hjelp av en celleskraper eller mDCer ved skylling, overfør cellene til et 1,5 milliliter sikkert låserør og samle dem via sentrifugering på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter.Gjenta høsting og sentrifugering med de resterende cellene i brønnene, vask deretter pelleten en gang med en milliliter PBS og kraftig gjenbruk cellene i lysisblandingen. Inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i 10 minutter og varm deretter til 95 grader Celsius i 10 minutter. Utfør SDS-side og western blot analyse for å verifisere LC3B1 og LC3B2, P62, ICP0 og ICP5, og GAPDH proteinnivåer.På dag 3,5 etterlevelse, overføre 12 millioner IDCer til en 50 milliliter tube, sentrifugere dem på 300 ganger g i fem minutter, og kast deretter supernatant. Parallelt utfører du flyttotokometrisk analyse for å overvåke modningsstatusen. Vask forsiktig idCene i fem milliliter opti-MEM uten fenolrød og sentrifuger dem ved 300 ganger g i fem minutter.Kast de supernaturante og gjenoppusse cellene i 200 mikroliter opti-MEM justere cellekonsentrasjonen til seks millioner celler per 100 mikroliter. Tilsett 75 picomoles av enten FIP200 spesifikke eller krypterte siRNA til fire millimeter elektrokuvetater og overfør 100 mikroliter av cellefjæringen til den respektive cuvette. Puls idCene direkte ved hjelp av et elektroporasjonsapparat.Etter elektroporasjon, overfør iDC-ene til seksbrønnsplater med friskt forvarmet DC-medium, så cellene ved en endelig konsentrasjon på en million celler per milliliter og legg dem i inkubatoren. Etter 48 timer, undersøke morfologien til de elektroporerte idCene mikroskopisk, og høst deretter cellene med celleskraperen og overfør dem til 15 milliliter rør. Skyll brønnene med ett milliliter PBS supplert med 0,1 % EDTA og overfør løsningen til de respektive rørene.Del deretter cellene for hver siRNA-tilstand som beskrevet i manuskriptet. Bruk 500 000 celler til å vurdere modningsstatus og celle levedyktighet, bruk en million celler for vestlig flekkanalyse for å verifisere FIP200-spesifikk knockdown effektivitet og bruke de resterende cellene for HSV-1 infeksjonseksperimenter. De genererte idcene og mDCene ble fenotypisk analysert av strømningscytometri for å utelukke forurensning med andre celletyper og for å verifisere modningsstatusen.Cellene ble farget med CD3 og CD14 antistoffer for å utelukke T-celle og monocytt forurensning henholdsvis. Cellene ble farget for CD11c som fungerer som en høyt uttrykt generell markør for DCer. For å vurdere modningsstatus ble CD80, CCR7, CD83 og MHCII-antistoffer brukt fordi disse molekylene er høyt uttrykt på modne DCer.Fluorescensmikroskopi og strømningscytometri ble brukt til å bestemme infeksjon med EGFP som uttrykte HSV-1. Sterke GFP-signaler indikerer nesten fullstendig infeksjon av iDCer og mDCer. Western blot analyse ble brukt til å avgjøre om spautin-1 eller bafilomycin A1 hemme autofagisk fluks i HSV-1 infiserte celler.I id-er er autofagisk fluks demonstrert av nedgangen i P62- og LC3B-uttrykk i fravær av henholdsvis spautin-1 og bafilomycin A1. HSV-1-infeksjon av mDCer i fravær av spautin-1 påvirker derimot ikke P62-uttrykk mens spautin-1- og BA1-behandling induserte en akkumulering av LC3B-II som gjenspeiler induksjon av autofagi, men en svikt i autofagisk omsetning i GC-er. Redusere FIP200 proteinnivåer med siRNA elektroporasjon forårsaker også en sterk reduksjon i autofagisk fluks i HSV-1 infiserte iDCer.Denne siRNA-baserte elektroporasjonsprotokollen for hemming av autofagi påvirker ikke celle levedyktigheten, bildefenotypen eller etableringen av HSV-1 proteinuttrykk i idCer. Våre elektroporasjonsprotokoller gir mulighet til å levere distinkte DNA- eller RNA-arter til sykdom og andre primære celletyper. Deretter kan en rekke molekylære, funksjonelle og infeksjonsanalyser utføres.Den siRNA-baserte strategien for uttrykksavaktivering i sykdom baner vei for å utforske funksjonen til ethvert protein av interesse, også kombinert med påfølgende funksjonelle analyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Timelige analyse av kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon av et Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescent AC Confocal mikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Porcine hornhinnen vev Explant å studere effekten av Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Vekst, rensing og titrering av onkolytisk herpes Simplex Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing av Herpes Simplex Virus

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestemmelse av vaksineimmunogenisitet ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...