siRNA electroporation til modulere Autofagi i herpes simplex virus type 1-infiserte monocytt-avledet dendrittiske celler

Vår protokoll beskriver metoder for effektivt å forstyrre HSV-1 indusert autofagisk omsetning i dendrittiske celler. Og spesielt sammenligner vi en inhibitorbasert med en siRNA-basert strategi for å blokkere autofagi før infeksjon. Mens den inhibitorbaserte interferensen med autofagi omfatter potensielle og spesifikke off-target effekter, er vår utviklede siRNA-baserte strategi mer målspesifikk.

Viktigere, begge presenterte teknikker påvirker ikke modningsstadiene av sykdommen. Å demonstrere prosedyren vil være Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, og Alexandra Duthorn, en gradstudent, fra laboratoriet mitt. Begynn med å høste umodne dendrittiske celler eller iDCer ved å skylle de løst vederlige cellene forsiktig fra bunnen av cellekulturkolben på dag fire etterlevelse.

Legg modningscocktail til cellene for å generere modne dendrittiske celler eller mDCer. To dager etter induksjon av modning, skyll mDCene fra bunnen av cellekulturkolben. Gjenta skyll to ganger, og overfør deretter iDCene og mDCene til 50 milliliter rør i deres respektive kulturmedium.

Høst cellene via sentrifugering på 300 ganger g i fem minutter. Gjenoppus cellene forsiktig i fem til 10 milliliter RPMI 1640 per cellekulturkolbe og kombiner de respektive DC-suspensjonene i ett rør. Kvantifisere cellene ved hjelp av et tellekammer som sørger for å unngå temperaturendringer ved håndtering av DCs.

Overfør to millioner IDCer eller mDCer til et to milliliter rør, sentrifuger dem på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter og kast supernatanten. Forsiktig resuspend cellene i infeksjon medium. Hemm den autofagosomale lysosomale nedbrytningsveien ved å tilsette 10 mikromolar spautin-1 eller en mikromolar bafilomycin A1 til infeksjonsmediet en time før infeksjon.

Legg DMSO for ubehandlet kontroll og inkuber cellene på en varmeblokk ved 37 grader Celsius med risting ved 300 RPM. For infeksjonsstudier inokulerer cellene med HSV-1 virions ved et mangfold av infeksjon på to. Legg til det respektive volumet av MNT-buffer som en mock-kontroll og inkuber cellene på en varmeblokk ved 37 grader Celsius i en time med risting.

En time etter infeksjon, samle cellene via sentrifugering på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter, deretter aspirere inokulumet forsiktig og resuspend cellene i DC medium. Seed mock behandlet og HSV-1 infiserte celler i en endelig konsentrasjon av en million celler per milliliter i en seks-brønns plate. Ved 16 til 24 timer etter infeksjon, høst iDCer ved hjelp av en celleskraper eller mDCer ved skylling, overfør cellene til et 1,5 milliliter sikkert låserør og samle dem via sentrifugering på 3, 390 ganger g i 1-1/2 minutter.

Gjenta høsting og sentrifugering med de resterende cellene i brønnene, vask deretter pelleten en gang med en milliliter PBS og kraftig gjenbruk cellene i lysisblandingen. Inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i 10 minutter og varm deretter til 95 grader Celsius i 10 minutter. Utfør SDS-side og western blot analyse for å verifisere LC3B1 og LC3B2, P62, ICP0 og ICP5, og GAPDH proteinnivåer.

På dag 3,5 etterlevelse, overføre 12 millioner IDCer til en 50 milliliter tube, sentrifugere dem på 300 ganger g i fem minutter, og kast deretter supernatant. Parallelt utfører du flyttotokometrisk analyse for å overvåke modningsstatusen. Vask forsiktig idCene i fem milliliter opti-MEM uten fenolrød og sentrifuger dem ved 300 ganger g i fem minutter.

Kast de supernaturante og gjenoppusse cellene i 200 mikroliter opti-MEM justere cellekonsentrasjonen til seks millioner celler per 100 mikroliter. Tilsett 75 picomoles av enten FIP200 spesifikke eller krypterte siRNA til fire millimeter elektrokuvetater og overfør 100 mikroliter av cellefjæringen til den respektive cuvette. Puls idCene direkte ved hjelp av et elektroporasjonsapparat.

Etter elektroporasjon, overfør iDC-ene til seksbrønnsplater med friskt forvarmet DC-medium, så cellene ved en endelig konsentrasjon på en million celler per milliliter og legg dem i inkubatoren. Etter 48 timer, undersøke morfologien til de elektroporerte idCene mikroskopisk, og høst deretter cellene med celleskraperen og overfør dem til 15 milliliter rør. Skyll brønnene med ett milliliter PBS supplert med 0,1 % EDTA og overfør løsningen til de respektive rørene.

Del deretter cellene for hver siRNA-tilstand som beskrevet i manuskriptet. Bruk 500 000 celler til å vurdere modningsstatus og celle levedyktighet, bruk en million celler for vestlig flekkanalyse for å verifisere FIP200-spesifikk knockdown effektivitet og bruke de resterende cellene for HSV-1 infeksjonseksperimenter. De genererte idcene og mDCene ble fenotypisk analysert av strømningscytometri for å utelukke forurensning med andre celletyper og for å verifisere modningsstatusen.

Cellene ble farget med CD3 og CD14 antistoffer for å utelukke T-celle og monocytt forurensning henholdsvis. Cellene ble farget for CD11c som fungerer som en høyt uttrykt generell markør for DCer. For å vurdere modningsstatus ble CD80, CCR7, CD83 og MHCII-antistoffer brukt fordi disse molekylene er høyt uttrykt på modne DCer.

Fluorescensmikroskopi og strømningscytometri ble brukt til å bestemme infeksjon med EGFP som uttrykte HSV-1. Sterke GFP-signaler indikerer nesten fullstendig infeksjon av iDCer og mDCer. Western blot analyse ble brukt til å avgjøre om spautin-1 eller bafilomycin A1 hemme autofagisk fluks i HSV-1 infiserte celler.

I id-er er autofagisk fluks demonstrert av nedgangen i P62- og LC3B-uttrykk i fravær av henholdsvis spautin-1 og bafilomycin A1. HSV-1-infeksjon av mDCer i fravær av spautin-1 påvirker derimot ikke P62-uttrykk mens spautin-1- og BA1-behandling induserte en akkumulering av LC3B-II som gjenspeiler induksjon av autofagi, men en svikt i autofagisk omsetning i GC-er. Redusere FIP200 proteinnivåer med siRNA elektroporasjon forårsaker også en sterk reduksjon i autofagisk fluks i HSV-1 infiserte iDCer.

Denne siRNA-baserte elektroporasjonsprotokollen for hemming av autofagi påvirker ikke celle levedyktigheten, bildefenotypen eller etableringen av HSV-1 proteinuttrykk i idCer. Våre elektroporasjonsprotokoller gir mulighet til å levere distinkte DNA- eller RNA-arter til sykdom og andre primære celletyper. Deretter kan en rekke molekylære, funksjonelle og infeksjonsanalyser utføres.

Den siRNA-baserte strategien for uttrykksavaktivering i sykdom baner vei for å utforske funksjonen til ethvert protein av interesse, også kombinert med påfølgende funksjonelle analyser.