siRNA elektroporation att modulera autofagi i herpes simplex virus typ 1-infekterade Monocyte-derived dendritiska celler

Vårt protokoll beskriver metoder för att effektivt störa HSV-1 inducerad autophagic omsättning i dendritiska celler. Och i synnerhet jämför vi en hämmare-baserad med en siRNA-baserad strategi för att blockera autofagi före infektion. Medan den hämmare-baserade interferensen med autofagi omfattar potentiella och specifika off-target effekter, vår utvecklade siRNA-baserad strategi är mer målspecifik.

Viktigt, både presenterade tekniker påverkar inte mognadsstadsstaderna av sjukdom. Demonstrera förfarandet kommer att Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, och Alexandra Duthorn, en grad student, från mitt laboratorium. Börja med att skörda omogna dendritiska celler eller iDC genom att försiktigt skölja de löst vidhäftande cellerna från botten av cellodlingkolven på dag fyra efter följsamhet.

Lägg mognadscocktail till cellerna för att generera mogna dendritiska celler eller mDCs. Skölj mdvderna från botten av cellodlingskolven två dagar efter induktion av mognad. Upprepa sköljningen två gånger och överför sedan iDC och MDCs till 50 milliliterrör i deras respektive odlingsmedium.

Skörda cellerna via centrifugeringen vid 300 gånger g i fem minuter. Försiktigt återanvänd cellerna i fem till 10 milliliter RPMI 1640 per cellodlingskolv och kombinera respektive DC-suspensioner i ett rör. Kvantifiera sedan cellerna med hjälp av en räknekammare se till att undvika temperaturförändringar vid hantering av DCs.

Överför två miljoner iDC eller mDCs i ett två milliliterrör, centrifug dem på 3, 390 gånger g i 1-1/2 minuter och kassera supernatanten. Försiktigt resuspend cellerna i infektion medium. Hämma autophagosomal lysosomala nedbrytningsvägen genom att lägga till 10 micromolar spautin-1 eller en micromolar bafilomycin A1 till infektionsmediet en timme före infektion.

Tillsätt DMSO för den obehandlade kontrollen och inkubera cellerna på ett värmeblock vid 37 grader Celsius med skakningar vid 300 RPM. För infektionsstudier, inokulera cellerna med HSV-1 virions vid en multiplicity av infektion av två. Tillsätt respektive volym MNT-buffert som en mockkontroll och inkubera cellerna på ett värmeblock i 37 grader Celsius i en timme med skakningar.

En timme efter infektion, samla cellerna via centrifugeringen vid 3, 390 gånger g i 1-1/2 minuter, sedan aspirera inokulet försiktigt och resuspend cellerna i DC medium. Seed mock behandlade och HSV-1 infekterade celler vid en slutlig koncentration av en miljon celler per milliliter i en sex-brunn tallrik. Vid 16 till 24 timmar efter infektion, skörda iDC med hjälp av en cell skrapa eller mDCs genom sköljning, överföra cellerna till en 1,5 milliliter safe-lock rör och samla dem via centrifuger vid 3, 390 gånger g för 1-1/2 minuter.

Upprepa skörd och centrifugering med de återstående cellerna i brunnarna, tvätta sedan pelleten en gång med en milliliter PBS och kraftigt resuspend cellerna i lysblandning. Inkubera proverna vid 37 grader Celsius i 10 minuter och värm sedan till 95 grader Celsius i 10 minuter. Utför SDS-sida och Western blot-analys för att verifiera LC3B1 och LC3B2, P62, ICP0 och ICP5 och GAPDH-proteinnivåer.

På dag 3,5 post följsamhet, överföra 12 miljoner iDCs till en 50 milliliter rör, centrifug dem på 300 gånger g i fem minuter, och sedan kasta supernatant. Parallellt, utföra flödescytmetrisk analys för att övervaka mognadsstatus. Tvätta försiktigt iDC:erna i fem milliliter Opti-MEM utan fenolrött och centrifugera dem vid 300 gånger g i fem minuter.

Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 200 mikroliter av Opti-MEM justera cellkoncentrationen till sex miljoner celler per 100 mikroliter. Lägg till 75 picomoles av antingen FIP200 specifika eller förvrängda siRNA till fyra millimeters elektrocuvettes och överföra 100 mikroliter av cellen suspensionen i respektive cuvette. Direkt pulsen iDCS med hjälp av en elektroporering apparat.

Efter elektroporation, överför iDC till sex-brunns plattor med färska förvörd DC medium, sådd cellerna i en slutlig koncentration av en miljon celler per milliliter och placera dem i inkubatorn. Efter 48 timmar, undersöka morfologi av elektroporerade iDCs mikroskopiskt, sedan skörda cellerna med cellskrapan och överföra dem till 15 milliliter rör. Skölj brunnarna med en milliliter PBS kompletterad med 0,1%EDTA och överför lösningen till respektive rör.

Dela sedan cellerna för varje siRNA-tillstånd enligt beskrivningen i manuskriptet. Använd 500, 000 celler för att bedöma mognadsstatus och cellens livskraft, använd en miljon celler för western blot-analys för att verifiera FIP200 specifik knockdown-effektivitet och använda de återstående cellerna för HSV-1-infektionsexperiment. De genererade idc och mDCs var phenotypically analyseras av flödet cytometry i syfte att utesluta kontaminering med andra celltyper och att verifiera deras mognad status.

Cellerna var färgas med CD3 och CD14 antikroppar för att utesluta T-cell och monocyt kontaminering respektive. Cellerna var färgas för CD11c som fungerar som en mycket uttryckt allmän markör för DCs. För att bedöma mognadsstatus användes CD80- , CCR7- cd83- och MHCII-antikroppar eftersom dessa molekyler är mycket uttryckta på mogna DC.

Fluorescens mikroskopi och flöde cytometry användes för att bestämma infektion med EGFP uttrycker HSV-1. Starka GFP-signaler indikerar nästan fullständig infektion av iDC och MDCs. Western blot analys användes för att avgöra om spautin-1 eller bafilomycin A1 hämmar autophagic flux i HSV-1 infekterade celler.

I iDCs, autophagic flux framgår av nedgången av P62 och LC3B uttryck i avsaknad av spautin-1 och bafilomycin A1 respektive. HSV-1-infektion av MDCs i avsaknad av spautin-1 påverkar däremot inte P62-uttryck medan behandling med spautin-1 och BA1 inducerade en ackumulering av LC3B-II som återspeglar induktion av autofagi men ett misslyckande av autofagisk omsättning i mDCs. MinskaNDE AVNP200 proteinnivåer med siRNA elektroporation orsakar också en stark minskning av autophagisk flux i HSV-1-infekterade iDC.

Detta siRNA-baserade elektroporationsprotokoll för hämning av autofagi påverkar inte cellens livskraft, bildens fenotyp eller inrättandet av HSV-1-proteinuttryck i iDC. Våra elektroporationsprotokoll erbjuder möjligheten att leverera distinkta DNA- eller RNA-arter till sjukdomar och andra primära celltyper. Därefter kan en mängd molekylära, funktionella och infektion analyser utföras.

Den siRNA-baserade strategin för uttrycksdämning vid sjukdom banar väg för att utforska funktionen hos något protein av intresse, även kombinerat med efterföljande funktionsanalyser.