Name: sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det tyska forskningsrådet (DFG) via projektet STE 432/11-1 tilldelas som och av ELAN programmet från medicinska fakulteten (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via projektet 18-12-21-1, beviljats LG.

Monocyte-härledda DCs genererades från leukaferes produkter av friska donatorer. För detta har en positiv röst från den lokala etikkommittén erhållits (referensnummer 4556). Experimenten i den aktuella studien utfördes i enlighet med rekommendationerna från etikkommittén för "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (referensnummer 4556). Alla givare godkände ett skriftligt informerat samtycke, inklusive i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
1. generering och hantering av omogen dendritiska celler (iDCs) och mogna dendritiska celler (mDCs)
<ol><li>Isolera humana perifert blod mononukleära celler (pbmcs) från leukoreduktion system kammare (lrscs) som tidigare beskrivits27. Undvik kryopreservation av PBMCs och använda dem direkt vid isolering för att få högre DC-avkastning.</li>
	<li>Generera mänskliga DCS från pbmcs av olika friska donatorer i T175 cellodling kolvar som tidigare beskrivits10,27. Kortfattat, Använd 350-400 miljoner PBMCs i 30 mL DC-medium (RPMI 1640 utan L-glutamin, 1% (v/v) AB-serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 0,4 mM L-glutamin, 10 mM HEPES) per cellodling kolv för isolering av monocyter genom följsamhet. Efter 1 h, tvätta bort nonadherent fraktion med RPMI 1640. Tillsätt färskt DC-medium kompletterat med 800 U/mL GM-CSF och 250 U/mL IL-4, och inkubera i 3 dagar.<ol>
<li>På dag 3 post följsamhet, tillsätt 5 mL färskt DC-medium som innehåller GM-CSF och IL-4 med en slutlig koncentration av 400 U/mL och 250 U/mL per cell odlings flaska, respektive, för DC differentiering.</li>
		<li>För att skörda iDCs, skölj försiktigt löst sittande iDCs från botten av cell odlings kol ven, på dag 4 efter följsamhet. Upprepa detta steg 2 gånger. För generering av mDCs, tillsätt mogning cocktail sammansatt enligt följande: GM-CSF (slutlig koncentration: 40 U/mL), IL-4 (slutlig koncentration: 250 U/mL), IL-6 (slutlig koncentration: 1000 U/mL), IL-1 β (slutlig koncentration: 200 U/ml), TNF-α (slutkoncentration: 10 ng/ mL), prostaglandin E2 (PGE2; slutlig koncentration: 1 μg/mL).</li>
		<li>Sex dagar efter anslutning (två dagar efter induktion av mognad med hjälp av en cytokin cocktail), skölj mDCs från botten av cellen kultur kolv. Upprepa det här steget två gånger. Anmärkning: omogen och mogna DCs kan genereras sekventiellt från identiska givare i 1 cellodling kolv. För att göra detta, (i) separera lämpligt antal iDCs och (II) inducera mogningen av de återstående cellerna i kolvar med hjälp av den cytokin cocktail som anges i steg 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Överför iDCs eller mDCs i respektive cellodlingsmedium till 50 mL-rör. Skörda cellerna via centrifugering vid 300 x g i 5 min.<ol>
<li>Försiktigt Omsuspendera (= tvätta) DCs i 5-10 mL RPMI 1640 per cell odlings kolv. Kombinera respektive DC suspensioner i ett rör.</li>
		<li>Definiera cellnumret med hjälp av en inventerings kammare eller en alternativ metod. Undvik temperaturförändringar vid hantering av iDCs, för att minska risken för fenotypiska förändringar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. flödescytometriska analyser för att övervaka den fenotypiska mogningen
<ol><li>Överför iDCs eller mDCs (0,5 x 106) från steg 1.3.1 till en 1,5 ml tub. Skörda cellerna via centrifugering vid 3390 x g för 1,5 min. Tvätta cellerna en gång med FACS buffert (PBS kompletteras med 2% fetalt kalv serum (FCS)).</li>
	<li>Omsuspendera cellerna i 100 μL av antikropps färgning lösning (FACS buffert) som innehåller specifika fluorkrom-märkta antikroppar mot definierade ytmolekyler.<ol>
<li>Använd följande antikroppar för att kontrollera renhet (CD3-FITC, CD14-PE) samt mogning status för DCs (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).</li>
		<li>Förbered ett omålat prov i 100 μL av FACS-bufferten som en kontroll.</li>
		<li>Färga cellerna på is i mörker i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Därefter tvätta cellerna två gånger i 1 mL FACS buffert och centrifugera vid 3390 x g för 1,5 min.</li>
	<li>Slutligen, Omsuspendera cellerna i 200 μL av FACS-bufferten kompletterad med 2% PFA och analysera cellerna med flödescytometri. Fasta celler kan förvaras vid 4 ° C i mörker upp till 2 dagar.</li>
</ol>3. infektions förfarande av DCs med herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) och interferens av HSV-1-inducerad autofagi Flux via spautin-1 eller bafilomycin-a1
Anmärkning: stammen HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) som används i denna studie erhölls från laboratoriet stam HSV-1 stam 17 +. HSV-1 EGFP-stammen uttrycker det förstärkta gröna fluorescerande proteinet (EGFP) som har satts in i UL43 Genlocus under kontroll av CMV-promotorn. EGFP fungerar som en markör för HSV-1-infektion. Dessutom, stammen HSV1-RFPVP26 användes för DC infektion studier (tidigare beskrivits i Turan et al., 2019). Detta virus uttrycker kapsid ytan protein VP26 smält till monomer rött fluorescerande protein (MRFP).
<ol><li>Överför iDCs eller mDCs (2 x 106) från steg 1,3 till en 2 ml tub. Därefter Centrifugera cellerna vid 3390 x g för 1,5 min och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera cellerna försiktigt i infektions mediet (RPMI 1640 kompletterat med 20 mM HEPES).<ol>
<li>För att hämma den autofagi-lysosomala nedbrytningsvägen, förbehandla DCs med spautin-1 eller bafilomycin-a1 1 h före infektion. Tillsätt antingen 10 μM spautin-1 eller 1 μM BA1, eller DMSO som obehandlad kontroll, till infektionen mediet. Inkubera cellerna i en värmeblock vid 300 rpm skakning vid 37 ° c för 1 h.</li>
		<li>För infektion studier, Inokulera cellerna med HSV-1 virioner på en multiplicity av infektion (Moi) av 2. Tillsätt motsvarande volym MNT-buffert (30 mM 2-(N-morpholino) etansulfonsyra (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) som mock-kontroll. Inkubera cellerna i en värmeblock vid 300 rpm skakning vid 37 ° c för 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 h post infektion (HPI), samla in cellerna vid 3390 x g för 1,5 min. Aspirera inokulum och försiktigt Omsuspendera cellerna i DC-medium som innehåller 40 u/ml av GM-CSF, 250 U/ml av Il-4 och antingen 10 μm spautin-1, 1 μm Ba1, eller DMSO som kontroll. Frö mock-behandlade och HSV-1-infekterade celler vid en slutlig koncentration av 1 x 106/ml till en 6-brunn tallrik.</li>
	<li>Vid 16-24 HPI, skörda cellerna genom att skölja (mDCs) eller använda en cell skrapa (iDCs). Överför cellerna till ett 1,5 mL safelock-rör.<ol>
<li>Samla in cellerna via centrifugering vid 3390 x g för 1,5 min och tvätta pelleten en gång genom att tillsätta 1 ml PBS.</li>
		<li>Omsuspendera cellerna kraftigt i Lys blandningen som innehåller 29 μL 2x Roti-belastning, 1 μL 100 mM MgCl2 och 12,5 U/ml benzonase.</li>
		<li>För cell Lys och DNA-nedbrytning med hjälp av benzonase, inkubera proverna vid 37 ° c i 10 min. Därefter denaturera proteinerna vid 95 ° c i 10 min.</li>
		<li>Utför SDS-PAGE och Western blot-analyser för att kontrollera proteinnivåerna i LC3BI/II, P62, ICP0/5 och GAPDH.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interferens av HSV-1-inducerad autofagi Flux via elektroporation av iDCs med FIP200-siRNA
Anmärkning: det nuvarande protokollet för siRNA-elektroporation ändrades från Prechtel et al. (2007) och gerer et al. (2017).
<ol><li>Överför iDCs (12 x 106) på dag 3,5 efter anslutning till en 50 ml tub. Därefter Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min och Kassera supernatanten. Parallellt, utföra flödescytometrisk analys för att övervaka mogningen status som beskrivs i steg 2 (Använd Life/Dead Violet i stället för CD80-PacBlue).</li>
	<li>Tvätta försiktigt iDCs i 5 mL OptiMEM utan fenolrött och centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten och försiktigt Omsuspendera idcs i 200 μl optimem utan fenolrött, och justera en cell koncentration på 6 x 106/100 μl. Placera inte cellerna på isen och Undvik temperaturförändringar. Gå vidare snabbt och Undvik långa inkubations perioder av iDCs i OptiMEM utan fenolrött.</li>
	<li>Överför antingen 75 pmol av FIP200-specifik siRNA eller 75 pmol av äggröra siRNA, som en kontroll, till 4 mm elektrocuvetter och tillsätt 100 μL (6x106 celler) av cellsuspensionen. Direkt puls iDCs använda elektroporation apparaten I, tillämpa följande inställningar: 500 V för 1 MS.<ol>
<li>Bered siRNA-suspensionerna före försöksförfarandet enligt tillverkarens anvisningar och förvara dem vid-20 ° c. Tina och håll dem på is när du använder dessa siRNAs för elektroporation. Före elektroporering av proverna, utför en test puls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter elektroporation, överför direkt iDC till 6-brunn-plattor med färskt förvärmda DC-medel (kompletterat med 40 U/mL GM-CSF och 250 U/mL av IL-4). Frö cellerna vid en slutlig koncentration av 1 x 106/ml och placera dem i en inkubator. Skölj inte av cellerna ur elektrokuvette.</li>
	<li>Efter 48 h, först undersöka morfologin av elektroporated iDCs mikroskopiskt. Sedan skörda cellerna med hjälp av en cell Scrapper och överföra dem till 15 mL rör. Skölj brunnarna med 1 mL PBS kompletterad med 0,01% EDTA och överför lösningen i respektive rör.</li>
	<li>Därefter dela 6 x 106 idcs per siRNA villkor som beskrivs i nästa steg.<ol>
<li>Använd 0,5 x 106 -celler för att bedöma mognadsstatus och cellernas livskraft enligt beskrivningen i steg 2. Använd följande antikroppar: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 och Life/Dead Violet.</li>
		<li>Använd 1 x 106 celler för Western blot-analyser för att verifiera FIP200-specifik knockdown-effektivitet. Överför och skörda cellerna i ett 1,5 ml safelock-rör genom centrifugering vid 3390 x g för 1,5 min. Förbered cell celllysat enligt beskrivningen i steg 3,4 och utför västerländska blot-analyser.</li>
		<li>Använd de återstående cellerna (4,5 x 106) för experiment med HSV-1-infektion. För varje försöks tillstånd, överföra 2,25 x 106 idcs i 2 ml rör och antingen infektera dem med hsv1 på en Moi av 2 eller lägga mnt buffert som en mock kontroll. Utför infektionen enligt beskrivningen i steg 3,3.</li>
		<li>Vid 20 HPI, skörda cellerna med hjälp av en cell skrapa och förbereda cell celllysat för Western blot analyser som beskrivs i steg 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. modulering av den autofagi-lysosomala vägen i HSV-1-infekterade MDCs med KIF1B/2a-siRNA elektroporation
<ol><li>Överför iDCs (24 x 106) vid dag 4 efter anslutning till en 50 ml tub. Därefter Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera försiktigt (= tvätta) iDCs i 8 mL PBS för att justera en slutlig cell koncentration av 3 x 106/ml. Överför 3 x 106 celler till 1,5 ml rör och skörda cellerna vid 3390 x g för 1,5 min.</li>
	<li>Omsuspendera iDCs i 100 μL buffert P3 som innehåller tilläggs blandningen (enligt tillverkarens anvisningar, elektroporeringssats apparat II) och antingen (i) 75 pmol av KIF1B-specifik siRNA, (II) 75 pmol av KIF2A-specifik siRNA, eller (III) båda. Använd (IV) respektive mängd kodade siRNA som kontroll. Bered två tuber för varje siRNA-tillstånd (6 x 106 celler) och överför suspensionerna till separata elektrocuvetter. Direkt puls iDCs tillämpa pulsen "EH-100" med hjälp av elektroporation apparaten II.<ol>
<li>Bered siRNA-suspensionerna före försöksförfarandet enligt tillverkarens anvisningar och förvara dem vid-20 ° c. Tina och håll dem på is när du använder dessa siRNAs för elektroporation. Placera inte iDCs på is och Undvik temperaturförändringar. Gå vidare snabbt och Undvik långa inkubation av iDCs i PBS eller buffert P3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Direkt efter elektroporation, tillsätt 500 μL av pre-warmed RPMI 1640 till Electro cuvettes. Inkubera cellerna i en inkubator för 5-10 min. överför iDCs till 6-well plattor med färskt förvärmda DC-medium (kompletteras med 40 U/mL av GM-CSF och 250 U/mL av IL-4). Kombinera respektive villkor i en brunn, frö cellerna vid en slutlig koncentration av 1 · 106/ml och placera dem i en inkubator.</li>
	<li>4 h efter inkubering, tillsätt mogningen cocktail som innehåller de cytokiner som anges i steg 1.2.2. Anmärkning: Förbered ett prov från icke-elektroporerade DCs (1 x 106) som kontroll för flödescytometriska analyser 2 dagar efter elektroporation. Behandla kontrollceller analogt med elektroporerade prover.</li>
	<li>Två dagar efter elektroporation, skörd celler genom resuspension och överföring till 15 mL rör. Skölj brunnarna med 1 mL PBS och överför suspensionerna i respektive rör. Split 6 · 106 DCS per siRNA-tillstånd enligt beskrivningen i följande steg:<ol>
<li>Använd 0,25 x 106 DCS (elektroporerad och icke-elektroporerad) för att kontrollera mognadsstatus och cellernas livskraft enligt beskrivningen i steg 2. Använd följande antikroppar: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7, och Life/Dead Violet.</li>
		<li>Använd 0,75 x 106 celler för Western blot-analyser för att bedöma KIF1B/2a-specifik knockdown-effektivitet. Samla in cellerna i ett 1,5 ml safelock-rör genom centrifugering vid 3390 x g för 1,5 min. Förbered cell celllysat enligt beskrivningen i steg 3,4 och utför västerländska blot-analyser.</li>
		<li>Använd de återstående cellerna (5 x 106) från varje siRNA tillstånd och utföra HSV-1-infektionsexperiment. För varje försöks tillstånd, överföra 2,5 x 106 idcs i 2 ml rör och antingen infektera dem med HSV-1 på en Moi av 2 eller lägga mnt buffert som en mock kontroll. Utför infektionen enligt beskrivningen i steg 3,3.</li>
		<li>Vid 20 h post infektion, skörda cellerna genom resuspension och förbereda cell celllysat för Western blot analyser för att kontrollera induktion av HSV-1-inducerad autofagi omsättning, som beskrivs ovan i steg 3,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro.">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).</li><li>Kummer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+induces+CD83+degradation+in+mature+dendritic+cells+with+immediate-early+kinetics+via+the+cellular+proteasome.">Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome.</a> Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).</li><li>Kruse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infected+with+herpes+simplex+virus+type+1+exhibit+inhibited+T-cell+stimulatory+capacity.">Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity.</a> Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).</li><li>Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dendritic+cell+maturation+by+herpes+simplex+virus.">Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus.</a> European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).</li><li>Prechtel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+mature+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+dramatically+reduces+lymphoid+chemokine-mediated+migration.">Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration.</a> Journal of General Virology. 86, 1645-1657 (2005).</li><li>Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+induces+rapid+degradation+of+CYTIP,+thereby+modulating+adhesion+and+migration.">Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration.</a> Blood. 118 (1), 107-115 (2011).</li><li>Cohrs, R. J., Gilden, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+herpesvirus+latency.">Human herpesvirus latency.</a> Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).</li><li>Grinde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses:+latency+and+reactivation+-+viral+strategies+and+host+response.">Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response.</a> Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).</li><li>Whitley, R. J., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+infections.">Herpes simplex virus infections.</a> The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).</li><li>Turan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+degradation+of+lamins+facilitates+the+nuclear+egress+of+herpes+simplex+virus+type+1.">Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).</li><li>Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+yeast+demonstrated+with+proteinase-deficient+mutants+and+conditions+for+its+induction.">Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction.</a> The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).</li><li>Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+machinery+and+regulation.">Autophagy: machinery and regulation.</a> Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).</li><li>Bodemann, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RalB+and+the+exocyst+mediate+the+cellular+starvation+response+by+direct+activation+of+autophagosome+assembly.">RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly.</a> Cell. 144 (2), 253-267 (2011).</li><li>Bjorkoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+GABARAP+and+GATE16+localize+to+autophagosomal+membrane+depending+on+form-II+formation.">LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation.</a> Journal of Cell Science. 117, 2805-2812 (2004).</li><li>Pankiv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+binds+directly+to+Atg8/LC3+to+facilitate+degradation+of+ubiquitinated+protein+aggregates+by+autophagy.">p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).</li><li>Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+autophagy+by+lysosomal+positioning.">Regulation of autophagy by lysosomal positioning.</a> Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+quantitative+high-throughput+image+screening+identified+novel+autophagy+modulators.">A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators.</a> Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Cellular+Spheroid-Based+Autophagy+Screen+Applying+Live+Fluorescence+Microscopy+Identifies+Nonactin+as+a+Strong+Inducer+of+Autophagosomal+Turnover.">A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).</li><li>Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+compound+database:+A+resource+connecting+autophagy-modulating+compounds,+their+potential+targets+and+relevant+diseases.">Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases.</a> Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin1+controls+the+levels+of+p53+by+regulating+the+deubiquitination+activity+of+USP10+and+USP13.">Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13.</a> Cell. 147 (1), 223-234 (2011).</li><li>Mauvezin, C., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+disrupts+autophagic+flux+by+inhibiting+both+V-ATPase-dependent+acidification+and+Ca-P60A/SERCA-dependent+autophagosome-lysosome+fusion.">Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion.</a> Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).</li><li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1,+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H(+)-ATPase,+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells.">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li><li>Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mRNA+as+Universal+Technology+Platform+to+Transfect+a+Variety+of+Primary+Cells+with+Antigens+and+Functional+Proteins.">Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).</li><li>Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+knockdown+in+monocyte-derived+dendritic+cells+by+small+interfering+RNA+leads+to+a+diminished+T+cell+stimulation.">CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.</a> The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).</li><li>Pfeiffer, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukoreduction+system+chambers+are+an+efficient,+valid,+and+economic+source+of+functional+monocyte-derived+dendritic+cells+and+lymphocytes.">Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes.</a> Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).</li><li>Villadangos, J. A., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle,+migration+and+antigen+presenting+functions+of+spleen+and+lymph+node+dendritic+cells:+limitations+of+the+Langerhans+cells+paradigm.">Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm.</a> Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).</li><li>Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD83+on+dendritic+cells:+more+than+just+a+marker+for+maturation.">CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation.</a> Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).</li><li>Yang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+interpretation+of+current+autophagy+inhibitors+and+activators.">Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).</li><li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons.">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biology. 11, 73-81 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+induces+caspase-independent+cell+death+in+hepatocellular+carcinoma+cells+via+targeting+of+autophagy+and+MAPK+pathways.">Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways.</a> Scientific Reports. 6, 37052 (2016).</li><li>Hale, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+modulators+of+autophagic+flux+in+an+image-based+high+content+siRNA+screen.">Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen.</a> Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).</li><li>Lipinski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+reveals+multiple+mTORC1+independent+signaling+pathways+regulating+autophagy+under+normal+nutritional+conditions.">A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions.</a> Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).</li><li>Orvedahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+genome-wide+siRNA+screen+identifies+selective+autophagy+factors.">Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors.</a> Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).</li><li>Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+autophagy+by+shRNA+knockdown:+cautions+and+recommendations.">Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations.</a> Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+modulates+p53+activity+to+regulate+cell+cycle+and+survival+during+metabolic+stress.">Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress.</a> Science. 336 (6078), 225-228 (2012).</li><li>Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin-1+is+required+for+chromosome+congression+and+proper+outer+kinetochore+assembly.">Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly.</a> EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).</li><li>Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+behind+autophagy:+the+unconventional+roles+of+ATG+proteins.">Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins.</a> Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).</li><li>Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+divergent+functions+of+Beclin+1+and+Beclin+2.">Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2.</a> Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Tillämpningsområdet för detta protokoll omfattar (i) hantering av humana monocyte-härledda iDCs samt mDCs, (II) deras infektion med HSV-1, (III) deras behandling med substanser som är kända för att hämma autofagi, och (IV) deras elektroporation med siRNA med två olika tekniska inställningar. Med hjälp av det nuvarande protokollet kan autofagi Flux antingen blockeras i HSV-1-infekterade iDCs eller induceras i HSV-1-infekterade mDCs.
Eftersom DCs, och särskilt iDCs, är mycket sårbara celler, arbetar med dessa celler innebär ganska känsliga steg. För DC-generationen, rekommenderar vi att använda nyligen isolerade PBMCs, och för att undvika deras kryopreservation, för att få högre cell avkastning. Dessutom, vid hantering av iDCs under experiment, inklusive efterföljande odling, förhindra hårda eller långvariga temperaturförändringar. Annars kan iDCs genomgå fenotypiska förändringar och därför är det nödvändigt att kontrollera deras omogna fenotyp med flödescytometri. I motsats till sina mogna motsvarigheter saknar idcs distinkta markörer, till exempel CD80, CD83 och CD8628,29. Infektionen av idcs och MDCs med HSV-1 är en väletablerad metod2,3,4,5,6,10. Vi och andra visade att DCs är mycket mottagliga för HSV-1 infektion, när en MOI av 1 eller 2 har använts (figur 2). I våra händer, att hålla volymen av infektionen mediet på låga nivåer (1-3 x 106 celler i 250-350 μl) kommer att leda till bättre infektions effektivitet.
En klassisk metod för att störa en given distinkt cellulära väg är användningen av specifika föreningar. En mängd olika modulatorer av autofagi, dvs aktivatorer och hämmare, finns för närvarande30. När det gäller HSV-1-inducerad autofagi i DCs, Turan et al., (2019) visade nyligen de hämmande effekterna av spautin-1 och bafilomycin-a1 (BA1) på autofagi omsättning i iDCs10. Denna teknik för autofagi hämning är lämplig för kombinationen med en efterföljande HSV-1 infektion, eftersom varken infektionsfrekvensen eller mogningen status DCs (särskilt iDCs) är nedsatt. I framtida tillämpningar, detta inhibitionsbaserade tillvägagångssätt kan tillämpas även i kombination med andra smittämnen, stress villkor, såsom svält, samt för olika celltyper. Men när man använder hämmare, begränsningar uppstår vid bestämning av lämplig koncentration för effektiv autofagi hämning, utan att allvarligt påverka cellernas lönsamhet. Den största begränsningen vid användning av hämmare är dock förekomsten av potentiella off-Target eller negativa effekter, vilket kan leda till vilseledande resultat31,32.
Den andra metoden för att störa autofagi, som omfattas av detta protokoll, är den specifika knockdown med siRNA33,34,35. Å ena sidan använde vi elektroporation apparaten jag att specifikt avlägsna uttrycket av FIP200, och därmed hämma HSV-1-inducerad autofagi omsättning i idcs. Å andra sidan tystade vi två olika KIF proteiner (dvs KIF1B och KIF2A), med hjälp av elektroporation apparaten II, för att underlätta autofagi Flux i HSV-1-infekterade mDCs. Både elektroporation protokoll resulterade i en nästan fullständig ablation av FIP200 i iDCs, och KIF1B/KIF2A i mDCs, som kontrollerades via Western blot analyser (figur 4a, figur 5a). I motsats till elektroporationsapparaten i, som inte påverkar DCs, resulterar elektroporering av mDCs med hjälp av elektroporationapparaturen II i något högre frekvens av döda celler (figur 4b, figur 5b ). Därför, i framtida tillämpningar, den elektroporation apparat jag bör företrädesvis användas för både, iDCs och mDCs. Anmärkningsvärt, båda siRNA-baserade tekniker, att modulera autofagi Flux, är förenliga med efterföljande HSV-1 infektion av antingen iDCs eller mDCs. Vidare ändras inte heller den omogna fenotypen av iDCs eller den mogna fenotypen för mDCs efter elektroporation.
Elektroporation av iDCs med FIP200-specifik siRNA är en effektiv och mycket specifik metod för genknockdown samt hämning av autofagi Flux vid HSV-1-infektion. Förutom den specifika Tystning av FIP200, kan detta protokoll anpassas för att tysta andra autofagi komponenter, deltar i olika steg under autofagi kaskad. Men att identifiera lämpliga mål för effektiv siRNA-medierad hämning av autofagi omfattar flera aspekter av oro. För det första, knockdown effektivitet av autofagi-relaterade gener (ATG) inte nödvändigtvis positivt korrelerar med effektiv hämning av autofagi och är starkt beroende av den specifika ATG protein som är tystade36. För det andra, distinkta ATG proteiner är dessutom involverade i vägar som skiljer sig från autofagi, vilket deras ablation kan också leda till negativa biverkningar37,38,39. För det tredje kan olika ATGs ha redundanta funktioner, vilket innebär att en komponent inte kan vara tillräcklig för att hämma autofagi (t. ex. beclin-1 och beclin-2)40.
Dessutom är elektroporation apparat I-baserade elektroporation protokoll av DCs också lämplig för mRNAs, och kan användas för en mängd ytterligare primära celltyper, såsom PBMCs25. Detta system ger således en allmän strategi för att leverera distinkta RNA-arter till olika primära celltyper. Sammanfattningsvis presenterar vi två protokoll för att hämma autofagi Flux, genom att antingen använda en inhibitor-eller siRNA-baserad metod kombinerat med efterföljande HSV-1 infektion av iDCs. Dessutom beskriver vi en siRNA elektroporation metod för att inducera autofagi Flux i mDCs vid HSV-1 infektion.

Generering av Human monocyte-härledda dendritiska celler (DCs) utgör en lämplig in vitro-modell för att studera funktioner och biologi av denna viktiga immun cells typ. Isolering samt differentiering av monocyter i DCS har varit väl etablerad under de senaste åren1,2. Infektion av DCS med α-herpesvirus herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) fungerar som ett modellsystem för att studera HSV-1-medierade modulationer av DC-biologi2,3,4,5,6 . Detta är särskilt viktigt att belysa hur herpesviruses dämpa eller hämma potenta antivirala immunsvar, att etablera latens i immun-privilegierade nischer inne i Host7,8. I detta avseende är herpesviruses mycket framgångsrika patogener som är brett spridda över hela befolkningen når en sero-prevalens av upp till 90% enligt den geografiska regionen9. Att förstå och möjligen förhindra detta, mer insikter i HSV-1-medierade modulationer av värdens immunförsvar, och särskilt av immunceller såsom DCs, krävs.
En helt ny observation om samspelet mellan DCs och HSV-1 publicerades nyligen av Turan et al.10. Författarna visade att utförandet av HSV-1 replikering är strikt beroende av mogningen status DCs. I iDCs, är fullständig replikering av HSV-1 underlättas av autofagi-beroende mekanismer. Medan HSV1 inducerar autofagi i både, iDCs och mDCs, autofagi flöde observeras endast i iDCs. Detta i sin tur underlättar nukleära avstigning av viral capsids via autofagi nedbrytning av nukleära laminer i iDCs. För att få mekanistiska insikter i denna HSV-1-inducerad nedbrytning väg i iDCs kontra mDCs, nya och effektiva strategier är avgörande för att undersöka autofagi Flux.
Macroautofagi (autofagi) är en väl bevarad i flera steg process riktad intracellulära proteiner eller hela organeller för lysosomala nedbrytning11. Förenklat kan autofagi delas in i (i) initiering, (II) membran kärnbildning, (III) vesikler expansion, och (IV) autofagi-lysosome fusion fas12. Under initiering (i) är komponenter som det aktiverade ULK1/2-kinaskomplexet, som innehåller det fokala adhesionkinasfamiljen som interagerar med proteinet 200 kD (FIP200), avgörande för att aktivera komplexet beclin-1-Vps34-AMBRA1. Därefter initierar membran kärnbildning (II) phagophore formation13, som uppslukar cytoplasmiska laster som kännetecknas av molekyler som P6214. Under vesikler expansion och autofagi mognad (III) Microtubule-Associated protein ljus Chain 3 (LC3)-jag omvandlas till dess lipidated form LC3-II som sätts in i autofagi membranet. Sålunda, LC3-I till-II omräkningskurserna är en indikator för autofagi induktion genom att spegla bildandet av mogna autofagi15,16. Vid autofagi-lysosome fusion (IV), inte bara den autofagi lasten utan också tillhörande P62 och LC3-II proteiner genomgår nedbrytning (e.g., genom hydrolys). Således, förlust av P62 och LC3-II fungera som markörer för autofagi Flux17. Den fusion av autofagi med lysosomer, och därmed efter autofagi omsättning, är starkt beroende av den intracellulära lysosomala lokalisering. Detta är bland annat reglerat av kinesinet familjemedlemmar KIF1B och KIF2A, som visade sig inverka negativt på autofagi-lysosome fusion18. Intressant, proteinuttryck av KIF1B och KIF2A induceras på DC mognad och är därmed ansvarig för ineffektiv autofagi Flux i HSV-1-infekterade mDCs, som hämmar komplett HSV-1 replikering10.
Experimentella försök att modulera autofagi inkluderar användning av föreningar kända för att inducera eller hämma denna väg19,20,21. I denna studie beskriver vi två inhibitionsbaserade strategier för att blockera autofagi omsättning i HSV-1-infekterade iDCs. Den första föreningen som används i våra experiment är specifik och potent autofagi inhibitor-1 (spautin-1), som beskrevs för att främja beclin-1-Vps34-AMBRA1 komplex nedbrytning under inledningsfasen av autofagi22. Den andra föreningen som används i den aktuella studien är bafilomycin-a1 (Ba1), en V-ATPas hämmare som blockerar de sena autofagi händelser (dvs., autofagi-lysosome fusion samt autolysosome försurning)23,24. Användningen av någon av dessa två hämmare före iDC-infektion med HSV-1 hämmar kraftigt autofagi, men stör inte effektivt viral genuttryck. Sålunda, denna hämmare-baserade strategi före HSV-1 infektion erbjuder ett kraftfullt verktyg för att hämma HSV-1-inducerad autofagi flöde som lätt kan utökas för en uppsjö av olika celltyper och virus, som också potentiellt inducera autofagi.
För att övervinna en stor nackdel med en inhibitor-baserad metod (dvs. ospecifik off-mål effekter), utvecklade vi en siRNA-baserad metod för att blockera autofagi Flux i (HSV-1-infekterade) idcs. Tekniken för siRNA elektroporation representerar en kraftfull alternativ strategi, via selektiv ablation av uttrycket av distinkta proteiner (dvs, autofagi komponenter). I våra experiment var iDCs electroporated med FIP200-specifika siRNA använda elektroporation apparaten I (se tabell över material) och ett modifierat protokoll som beskrivs av gerer et al. (2017) och Prechtel et al. (2007), att hämma autofagi under inledande fas25,26. Denna teknik tillät oss att specifikt knockdown FIP200 uttryck i iDCs, utan att störa cellernas lönsamhet och deras omogen fenotyp två dagar efter elektroporation. Anmärkningsvärt, HSV-1 infektion fastställdes i dessa elektroporated iDCs speglas av effektiva virala proteinuttryck. Denna siRNA-baserade teknik erbjuder en unik fördel (dvs. att en mängd olika autofagi komponenter, även i kombination), kan vara särskilt riktade för ablation av deras uttryck.
I denna studie, beskriver vi ytterligare en siRNA-baserad metod för att inducera autofagi Flux även i HSV-1-infekterade mDCs. I detta fall var iDCs electroporated med siRNA riktade mot KIF1B och KIF2A före DC mogningen med hjälp av elektroporation apparaten II (se tabell över material). Eftersom båda proteiner är uppreglerad under DC mognad och kända för att negativt reglera fusion av autofagi med lysosomer10,18, deras knockdown starkt inducerad autofagi Flux i MDCs vid HSV-1 infektion. Den siRNA-baserade tekniken gjorde det möjligt för oss att specifikt inducera autofagi-omsättningen genom att störa KIF-proteinuttrycket i mDCs, och därmed kunna efterlikna deras uttrycks nivåer i iDCs.
Sammanfattnings, presenterar vi två olika metoder för att hämma autofagi Flux i HSV-1-infekterade iDCs. Medan den första inhibitorbaserade metoden utgör ett enkelt, Billigt och snabbt sätt att störa autofagi-nedbrytning, är den andra siRNA-baserade tekniken mer specifik och en mycket lämplig metod för att stödja och kontrollera resultaten av inhibitorbaserade Experiment. Dessutom beskriver vi en metod för att inducera autofagi Flux även i HSV-1-infekterade mDCs, via siRNA-medierad knockdown av två KIF proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB-Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Dendritic cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>9007281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Western Blot Detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7074</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>tlrl-baf1</td>
			<td>inhibition of autophagy and lysosomal degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Chamber Fastblot B44</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>557648</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: G043H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>561692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: B-ly6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555398</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (mouse, FITC)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555332</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 (mouse, V450)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>560442</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: L307.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 (mouse, APC)</td>
			<td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>17-0839-41</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: HB15e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>553692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging</td>
			<td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIP200 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>12436</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D10D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (mouse)</td>
			<td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB2302</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:5000 
			Clone: MAB374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td>
			<td>BioRad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>165-2112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF (4x104 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA&#8208;DR (mouse, APC-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>307618</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td>
			<td>BioVex</td>
			<td></td>
			<td>DC infection 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP0 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 11060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP5 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-56989</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946; (0.1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1404-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF1B (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-376246</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: E-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF2A (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-271471</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>3868</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>L34964</td>
			<td>L/D staining in Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td>
			<td>04-03-9391/01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 2.0 RS</td>
			<td>Heraeus (Hanau, Germany)</td>
			<td>75015505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Brand (Wertheim, Germany)</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td>
			<td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p62 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>88588</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D5L7G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16 %</td>
			<td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectSpin 24 Plus</td>
			<td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td>
			<td>C2500-R-PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (1 mg/mL)</td>
			<td>Pfizer (Berlin, Germany)</td>
			<td>BE130681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel system MiniProtean II</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>1652960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform wt 15</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>042-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A151.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1 (4x)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>K929.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; (10 &#956;g/mL)</td>
			<td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 0.2 &#956;m nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>10600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td>
			<td>3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells

Herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) inducerar autofagi i båda, omogen dendritiska celler (iDCs) samt mogna dendritiska celler (mDCs), medan autofagi Flux endast observeras i iDCs. För att få mekanistiska insikter, utvecklade vi effektiva strategier för att störa HSV-1-inducerad autofagi omsättning. En hämmare-baserad strategi, att modulera HSV-1-inducerad autofagi, utgör det första valet, eftersom det är en enkel och snabb metod. För att kringgå potentiella ospecifika off-mål effekter av sådana föreningar, vi utvecklat en alternativ siRNA-baserad strategi, att modulera autofagi omsättning i iDCs på HSV-1 infektion. Faktum är att elektroporation av iDCs med FIP200-specifika siRNA före HSV-1 infektion är en mycket specifik och framgångsrik metod för att ablera FIP200 proteinuttryck och därmed hämma autofagi Flux. Båda presenterade metoder resultera i en effektiv hämning av HSV-1-inducerad autofagi omsättning i iDCs, varvid siRNA-baserade tekniken är mer målspecifika. En ytterligare siRNA-baserade strategi utvecklades för att selektivt tysta protein uttrycket av KIF1B och KIF2A, vilket underlättar autofagi omsättning vid HSV-1 infektion i mDCs. Sammanfattningsvis, tekniken för siRNA elektroporation representerar en lovande strategi, att selektivt avlägsna uttrycket av distinkta proteiner och att analysera deras inflytande på en HSV-1 infektion.

I det här manuskriptet beskriver vi metoder för att störa HSV-1-inducerad autofagi i dendritiska celler. Detta inkluderar generering av Human monocyte-härledda iDCs och mDCs, som var fenotypiskt analyseras med flödescytometri (figur 1). På dag 4 post följsamhet, DCs visar en omogen fenotyp kännetecknas av svaga uttryck för CD80, CCR7, och CD83 samt hög CD11c och mellanliggande MHCII uttryck. Eftersom CD3 och CD14 signaler saknas, T-cell och monocyt föroreningar kan uteslutas. På dag 6 post adherencen (i.e., dag 2 post induktion av mognaden), DCs utställning en mogen fenotyp reflekterat vid en betydande öka i CD80, CCR7, CD83, och MHC-II yta uttryck. Infektion med en eGFP-uttrycker HSV-1-stam(figur 2) resulterar i en nästan fullständig infektion av antingen idcs (figur 2en övre panel) eller MDCs (figur 2en lägre panel, figur 2B), baserad på starka GFP-signaler analyseras med fluorescensmikroskopi och flödescytometri.
Som framgår av vår senaste rapport, inducerar HSV-1 autofagi både i iDCs och mDCs, men autofagi omsättningen sker i iDCs endast10. I ett första tillvägagångssätt behandlade vi iDCs och mDCs med spautin-1 (figur 3a)-att blockera autofagi initiering-eller bafilomycin-a1 (Ba1; Figur 3B)-för att hämma Final autofagi-lysosome fusion. Vid HSV-1 infektion av iDCs i avsaknad av spautin-1 och BA1, autofagi Flux är speglas av minskningen av P62 och LC3B uttryck, respektive. HSV-1-infektion av mDCs i avsaknad av spautin-1 påverkar däremot inte P62 uttryck, medan spautin-1-och BA1-behandling inducerar en ackumulering av LC3B-II. Detta återspeglar induktion av autofagi men ett misslyckande av autofagi omsättning i mDCs. I iDCs, spautin-1 förbehandling återställer starkt autofagi nedbrytning av P62 vid HSV-1 infektion, på grund av hämning av autofagi under inledningsfasen. Vid förbehandling med BA1, Mock-och HSV-1-infekterade iDCs visar en stark ackumulering av LC3B-II proteinnivåer, vilket indikerar en lyckad hämning av autofagi omsättning genom att blockera sena autofagi-lysosome fusion. I enlighet med detta, spautin-1 och BA1 förbehandling av mDCs resulterar också i stabila P62 och ökade LC3B-II proteinnivåer, respektive.
I en andra metod för att försämra autofagi Flux, siRNA elektroporation inriktning FIP200 undersöks om dess förmåga att blockera autofagi Flux i HSV-1-infekterade iDCs. Som visas i figur 4A, kraftigt reducerad FIP200 proteinnivåer upptäcktes i idcs 48 h efter elektroporation, jämfört med kontroll siRNA. Vid denna tidpunkt visar inte iDCs några tecken på celldöd (figur 4B) och bibehåller sin omogna fenotyp (figur 4C). Infektion av FIP200-tystade iDCs med HSV-1 visar en stark minskning av autofagi flöde jämfört med deras kontroll siRNA-behandlade motsvarigheter (figur 4D). Detta åtföljs av ökade proteinnivåer i LC3B samt P62 när FIP200 tystas i HSV-1-infekterade iDCs.
I ett omvänt försök, vi studerade om siRNA-medierad ablation av KIF1B och KIF2A proteinuttryck möjliggör autofagi-lysosomal omsättning också i HSV-1-infekterade mDCs. Således var iDCs electroporated med hjälp av specifika siRNAs inriktning antingen ett eller båda av dessa proteiner, och celler därefter mognat (figur 5). 2 dagar efter elektroporation, mDCs visar en stark minskning av KIF1B och/eller KIF2A proteinuttryck, när specifika siRNAs användes (figur 5a). Denna metod ledde inte heller till någon framträdande celldöd (figur 5B) eller till förändringar i deras fenotypiska mogningsstatus (figur 5C). Att stödja vikten av KIF1B och KIF2A under autofagi-lysosomal nedbrytning, deras utarmning före HSV-1 infektion underlättar en ökad autofagi Flux i mDCs. Detta återspeglas av minskade kvarvarande P62 proteinnivåer, i motsats till respektive kontroll tillstånd (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg"> Figur 1: fenotypisk karaktärisering av humana monocyte-härledda idcs-och MDC-ämnen med flödescytometri. DCs genererades och färgas med specifika antikroppar för att kontrollera deras renhet: (a) CD3 för att utesluta T cell förorening, (B) CD14 att utesluta kontaminering med monocyter, och (C) CD11c som en markör för DCS. För att bedöma deras fenotypiska mogtationsstatus användes följande antikroppar:D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83 och (G) mhcii. Dessa molekyler är mycket uttrycks på mDCs och därmed möjliggöra diskriminering mellan omogen och mogen DC fenotyp. Data analyserades med FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg"> Figur 2: mikroskopiska samt flödescytometriska analyser av HSV-1-infekterade idcs och MDCs. iDCs och mDCs var infekterade med en HSV-1 stam som uttrycker EGFP (HSV-1 EGFP), för att möjliggöra kvantifiering av infektionsfrekvensen baserat på GFP-signalen. (A) mikroskopiska analyser av GFP-positiva HSV-1-infekterade idcs-och MDCs-infekterade i en Moi på 2, jämfört med deras icke-infekterade motsvarigheter, vid 24 HPI. För att visualisera infekterade celler övervakades GFP-fluorescens. Skalstapeln motsvarar 400 μm.Bflödescytometrisk mätning av de mock-eller HSV-1-infekterade MDCs under infektionskinetik. Övre paneler (svart fodrad histograms) Visa håna skick, nedre paneler (svart fyllda histogram) Visa HSV-1-infekterade celler efter den angivna tiden punkter efter infektion. Data analyserades med FCS Express 5,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg"> Figur 3: Spautin-1 och b afilomycin-a1 modulera den autofagi Flux i HSV-1-infekterade iDCs. iDCs och mDCs behandlades med (a) spautin-1 eller (B) Bafilomycin-a1 (Ba1) för 1 h före infektion. Celler var därefter mock-eller HSV-1-infekterade (HSV1-RFPVP26) med hjälp av en MOI av 2. Efter 16-18 h, var DCS skördas och protein celllysat utsattes för Western blotting att bestämma uttrycket av P62 eller LC3B-I/-II som autofagi markörer, ICP0 som Infection Control, och GAPDH som lastning kontroll. LC3B-I och LC3B-II proteinnivåer kvantifierades och normaliserades till referensproteinet GAPDH med Bio1D (optisk densitet). Förhållandet mellan normaliserade LC3B-II och normaliserade LC3B-I-signaler visas. Denna siffra har modifierats och anpassats från © 2019 Turan et al. ursprungligen publicerad i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg"> Figur 4: analys av autofagi Flux i HSV-1-infekterade iDCs vid FIP200-siRNA elektroporation. iDCs var elektroporated med kontroll siRNA eller FIP200-specifik siRNA med hjälp av elektroporation apparaten I. (a) DCS analyserades om effektiviteten hos FIP200 knockdown 48 h efter elektroporation, genom att utföra Western blot-analyser. B) cellernas lönsamhet och (C) mognadsstatus analyserades före elektroporation (ljusblå histogram) och 48 h stolpe (mörkblå och grå histogram) elektroporation med flödescytometri. Median värden för tre olika givare visas. Efter att ha bekräftat effektiv knockdown av FIP200 och omogna fenotyp, celler HSV-1-infekterade (HSV-1 EGFP) med hjälp av en MOI av 2. Data analyserades med FCS Express 5,0. Dvid 20 timmar efter infektion utsattes celler för Western blot-analyser för att bestämma uttrycket för LC3B-I/-II och P62 som autofagi-markörer. ICP5 upptäcktes som infektionskontroll, och GAPDH som lastning kontroll. Panelerna A och D har modifierats och anpassats från © 2019 Turan et al. ursprungligen publicerad i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg"> Figur 5: siRNA-medierad ablation av KIF1B och/eller KIF2A modulerar autofagi omsättningen i HSV-1-infekterade mDCs. iDCs var elektroporated med KIF1B-specifika och/eller KIF2A-specifika siRNA, samt kontroll siRNA, med hjälp av elektroporation apparaturen II. Vid 4 h post Electroporation, mognad var inducerad genom tillsats av en mogning cocktail. Vid 48 h post Electroporation, DCs analyserades om (a) effektiviteten i KIF knockdown via Western blotting, (B) cellernas lönsamhet samt deras (C) fenotypisk mognadsstatus med hjälp av flödescytometriska analyser (två olika givare visas). "w/o EP" innebär utan elektroporation, men efter induktion av mognad; "post Control EP" betyder post elektroporation med kontroll siRNA; "post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2a EP" betyder post elektroporation med KIF1B-och/eller KIF2A-specifika siRNA. Efter att ha bekräftat effektiv knockdown av KIF1B och/eller KIF2A och den mogna fenotyp, celler HSV-1-infekterade (HSV-1 EGFP) med hjälp av en MOI av 2. Data analyserades med FCS Express 5,0. (D) celler utsattes för Western blot analyserar 20 h post infektion, för att bedöma uttrycket av P62 som en autofagi markör. ICP5 användes som en infektionskontroll, och GAPDH som lastning kontroll. Figurerna A och D har modifierats och anpassats från © 2019 Turan et al. som ursprungligen publicerades i JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

I denna studie presenterar vi hämmare-och siRNA-baserade strategier för att störa autofagi Flux i herpes simplex virus typ-1 (HSV-1)-infekterade monocyte-härledda dendritiska celler.

siRNA elektroporation att modulera autofagi i herpes simplex virus typ 1-infekterade Monocyte-derived dendritiska celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Vårt protokoll beskriver metoder för att effektivt störa HSV-1 inducerad autophagic omsättning i dendritiska celler. Och i synnerhet jämför vi en hämmare-baserad med en siRNA-baserad strategi för att blockera autofagi före infektion. Medan den hämmare-baserade interferensen med autofagi omfattar potentiella och specifika off-target effekter, vår utvecklade siRNA-baserad strategi är mer målspecifik.Viktigt, både presenterade tekniker påverkar inte mognadsstadsstaderna av sjukdom. Demonstrera förfarandet kommer att Petra Muhl-Zurbes, en tekniker, och Alexandra Duthorn, en grad student, från mitt laboratorium. Börja med att skörda omogna dendritiska celler eller iDC genom att försiktigt skölja de löst vidhäftande cellerna från botten av cellodlingkolven på dag fyra efter följsamhet.Lägg mognadscocktail till cellerna för att generera mogna dendritiska celler eller mDCs. Skölj mdvderna från botten av cellodlingskolven två dagar efter induktion av mognad. Upprepa sköljningen två gånger och överför sedan iDC och MDCs till 50 milliliterrör i deras respektive odlingsmedium.Skörda cellerna via centrifugeringen vid 300 gånger g i fem minuter. Försiktigt återanvänd cellerna i fem till 10 milliliter RPMI 1640 per cellodlingskolv och kombinera respektive DC-suspensioner i ett rör. Kvantifiera sedan cellerna med hjälp av en räknekammare se till att undvika temperaturförändringar vid hantering av DCs.Överför två miljoner iDC eller mDCs i ett två milliliterrör, centrifug dem på 3, 390 gånger g i 1-1/2 minuter och kassera supernatanten. Försiktigt resuspend cellerna i infektion medium. Hämma autophagosomal lysosomala nedbrytningsvägen genom att lägga till 10 micromolar spautin-1 eller en micromolar bafilomycin A1 till infektionsmediet en timme före infektion.Tillsätt DMSO för den obehandlade kontrollen och inkubera cellerna på ett värmeblock vid 37 grader Celsius med skakningar vid 300 RPM. För infektionsstudier, inokulera cellerna med HSV-1 virions vid en multiplicity av infektion av två. Tillsätt respektive volym MNT-buffert som en mockkontroll och inkubera cellerna på ett värmeblock i 37 grader Celsius i en timme med skakningar.En timme efter infektion, samla cellerna via centrifugeringen vid 3, 390 gånger g i 1-1/2 minuter, sedan aspirera inokulet försiktigt och resuspend cellerna i DC medium. Seed mock behandlade och HSV-1 infekterade celler vid en slutlig koncentration av en miljon celler per milliliter i en sex-brunn tallrik. Vid 16 till 24 timmar efter infektion, skörda iDC med hjälp av en cell skrapa eller mDCs genom sköljning, överföra cellerna till en 1,5 milliliter safe-lock rör och samla dem via centrifuger vid 3, 390 gånger g för 1-1/2 minuter.Upprepa skörd och centrifugering med de återstående cellerna i brunnarna, tvätta sedan pelleten en gång med en milliliter PBS och kraftigt resuspend cellerna i lysblandning. Inkubera proverna vid 37 grader Celsius i 10 minuter och värm sedan till 95 grader Celsius i 10 minuter. Utför SDS-sida och Western blot-analys för att verifiera LC3B1 och LC3B2, P62, ICP0 och ICP5 och GAPDH-proteinnivåer.På dag 3,5 post följsamhet, överföra 12 miljoner iDCs till en 50 milliliter rör, centrifug dem på 300 gånger g i fem minuter, och sedan kasta supernatant. Parallellt, utföra flödescytmetrisk analys för att övervaka mognadsstatus. Tvätta försiktigt iDC:erna i fem milliliter Opti-MEM utan fenolrött och centrifugera dem vid 300 gånger g i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 200 mikroliter av Opti-MEM justera cellkoncentrationen till sex miljoner celler per 100 mikroliter. Lägg till 75 picomoles av antingen FIP200 specifika eller förvrängda siRNA till fyra millimeters elektrocuvettes och överföra 100 mikroliter av cellen suspensionen i respektive cuvette. Direkt pulsen iDCS med hjälp av en elektroporering apparat.Efter elektroporation, överför iDC till sex-brunns plattor med färska förvörd DC medium, sådd cellerna i en slutlig koncentration av en miljon celler per milliliter och placera dem i inkubatorn. Efter 48 timmar, undersöka morfologi av elektroporerade iDCs mikroskopiskt, sedan skörda cellerna med cellskrapan och överföra dem till 15 milliliter rör. Skölj brunnarna med en milliliter PBS kompletterad med 0,1%EDTA och överför lösningen till respektive rör.Dela sedan cellerna för varje siRNA-tillstånd enligt beskrivningen i manuskriptet. Använd 500, 000 celler för att bedöma mognadsstatus och cellens livskraft, använd en miljon celler för western blot-analys för att verifiera FIP200 specifik knockdown-effektivitet och använda de återstående cellerna för HSV-1-infektionsexperiment. De genererade idc och mDCs var phenotypically analyseras av flödet cytometry i syfte att utesluta kontaminering med andra celltyper och att verifiera deras mognad status.Cellerna var färgas med CD3 och CD14 antikroppar för att utesluta T-cell och monocyt kontaminering respektive. Cellerna var färgas för CD11c som fungerar som en mycket uttryckt allmän markör för DCs. För att bedöma mognadsstatus användes CD80- , CCR7- cd83- och MHCII-antikroppar eftersom dessa molekyler är mycket uttryckta på mogna DC.Fluorescens mikroskopi och flöde cytometry användes för att bestämma infektion med EGFP uttrycker HSV-1. Starka GFP-signaler indikerar nästan fullständig infektion av iDC och MDCs. Western blot analys användes för att avgöra om spautin-1 eller bafilomycin A1 hämmar autophagic flux i HSV-1 infekterade celler.I iDCs, autophagic flux framgår av nedgången av P62 och LC3B uttryck i avsaknad av spautin-1 och bafilomycin A1 respektive. HSV-1-infektion av MDCs i avsaknad av spautin-1 påverkar däremot inte P62-uttryck medan behandling med spautin-1 och BA1 inducerade en ackumulering av LC3B-II som återspeglar induktion av autofagi men ett misslyckande av autofagisk omsättning i mDCs. MinskaNDE AVNP200 proteinnivåer med siRNA elektroporation orsakar också en stark minskning av autophagisk flux i HSV-1-infekterade iDC.Detta siRNA-baserade elektroporationsprotokoll för hämning av autofagi påverkar inte cellens livskraft, bildens fenotyp eller inrättandet av HSV-1-proteinuttryck i iDC. Våra elektroporationsprotokoll erbjuder möjligheten att leverera distinkta DNA- eller RNA-arter till sjukdomar och andra primära celltyper. Därefter kan en mängd molekylära, funktionella och infektion analyser utföras.Den siRNA-baserade strategin för uttrycksdämning vid sjukdom banar väg för att utforska funktionen hos något protein av intresse, även kombinerat med efterföljande funktionsanalyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporal analys av det kärn-till-Cytoplasmatisk translokationen av en Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescerande konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Svin hornhinnans vävnad explant för att studera effekten av Herpes Simplex Virus-1 Antivirala läkemedel

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Tillväxt, rening och titrering av onkolytisk herpes simplex virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing av herpes simplexvirus

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...