Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

ويشكر المؤلفان أوتي زيتز ونيكول جينر على مساعدتهما التقنية الممتازة، فضلاً عن موظفي فيتكور ومراقبة الحيوانات على دعمهما.

وقد استخدمت أنسجة العظام من الفئران في التقيد الصارم مع المبادئ التوجيهية السائدة لرعاية الحيوانات، وبذلت جميع الجهود للحد من معاناة الحيوانات.
1. الحيوانات وتجميد التضمين
<ol><li>منزل الحيوانات في ظروف من درجة حرارة الغرفة ثابتة (RT؛ 24 درجة مئوية) ودورة مظلمة 12 ساعة/ 12 ساعة مع ...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

يمكن أن تتأثر كل من نوعية وكمية الحمض النووي الريبي سلبا في جميع مراحل إعداد العينة مثل التلاعب في الأنسجة، عملية LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني اللاحقة.
بالنسبة ل...

تتكون الأنسجة من أنواع الخلايا غير المتجانسة والموزعة مكانياً. قد تستجيب أنواع الخلايا المختلفة في نسيج معين بشكل مختلف لنفس الإشارة. ولذلك، فمن الضروري أن تكون قادرة على عزل مجموعات محددة من الخلايا لتقييم دور أنواع الخلايا المختلفة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. يوفر استئصال الليزر الجزئي (LCM) طريقة سريعة ودقيقة نسبيًا لعزل وإزالة خلايا محددة من الأنسجة المعقدة1. تستخدم أنظمة LCM قوة شعاع الليزر لفصل الخلايا ذات الأهمية عن أقسام الأنسجة النسيجية دون الحاجة إلى المعالجة الأنزيمية أو النمو في الثقافة. وهذا يعني أن الخلايا في موطن الأنسجة الطبيعية، وأنه يتم الاحتفاظ بنية الأنسجة بما في ذلك العلاقة المكانية بين الخلايا المختلفة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا كل من الخلايا التي تم التقاطها والأنسجة المتبقية بشكل جيد، ويمكن أخذ عينات من العديد من مكونات الأنسجة بالتتابع من نفس الشريحة. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة للتحليل اللاحق لمحتوى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب2و3.
من أجل تحليل التعبير الجيني في مختلف مجموعات الخلايا، أو بعد علاجات مختلفة، فمن الضروري الحصول على mRNAs من نوعية وكمية كافية للتحليل اللاحق4،5. على النقيض من الحمض النووي، RNAs هي أكثر حساسية للتثبيت ويوصى باستخدام الأنسجة المجمدة عندما يكون الهدف هو دراسة الحمض النووي الريبي. وبما أن هذه الحالات تتدهور بسرعة بسبب الريبونوكليس (RNase) في كل مكان، فإن هناك حاجة إلى شروط صارمة خالية من RNase أثناء مناولة العينات وإعدادها وتجنب تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التقنيات السريعة دون أي خطوات مرحلة مائية طويلة هي حاسمة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي6. ويمكن أيضا أن تتأثر العائد RNA والنزاهة من قبل عملية LCM ونظام LCM المستخدمة7،8. حاليا، أربعة أنظمة LCM مع مبادئ التشغيل المختلفة متاحة2. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أيضا أن تكون مهمة، منذ تم اختبار مجموعات العزل RNA مختلفة مع اختلافات كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي ونوعية7،8.
أي طريقة لإعداد الأنسجة تتطلب إيجاد توازن بين الحصول على تباين مورفولوجي جيد والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لمزيد من التحليلات. لإعداد أقسام المجمدة من العظام، تم تطوير فيلم لاصق وتحسينها باستمرار9. يتم قطع أقسام العظام وملطخة مباشرة على فيلم لاصق. هذا الفيلم لاصق ينطبق على العديد من أنواع تلطيخ، ويمكن استخدامها لعزل الخلايا ذات الفائدة من استئصال التبريد العظام باستخدام LCM9،10،11،12،13، 14. جميع الخطوات بما في ذلك الإزالة الجراحية، والتضمين، وتجميد، وقطع وتلطيخ يمكن أن تكتمل في أقل من ساعة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد الخلايا مثل osteoblasts، خلايا بطانة العظام، وosteoclasts بوضوح9،10،11، 12،13،14. هذه الطريقة لديها ميزة كونها سريعة وبسيطة. وهناك طريقة بديلة لتوليد العظام التبريد هو استخدام نظام نقل الشريط15. ومع ذلك، فإن هذه التقنية الأخيرة هي أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أجهزة إضافية، حيث أن الأقسام يجب أن تنقل من شريط لاصق على الشرائح غشاء المغلفة مسبقا عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) عبر الربط. على الرغم من أن نظام نقل الشريط قد اقترن بنجاح مع LCM16،17،18،19،تجدر الإشارة إلى أن طلاء عبر مرتبطة يمكن أن تخلق نمط الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع خلية من نوع تعريف20.
عادة، يتم استخراج كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي من الخلايا المجهرية، وغالبا ما يتم تقييم نوعية وكمية الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعيرات الدقيقة21. يتم استخدام برنامج كمبيوتر لتعيين فهرس الجودة لمقتطفات RNA يسمى رقم تكامل RNA (RIN). تشير قيمة RIN البالغة 1.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور تمامًا، بينما تشير قيمة 10.0 إلى أن الحمض النووي الريبي سليم تمامًا22. عادة, اعتبرت فهرسات على 5 كاف ل [رنا] دراسات. وقد تم الإبلاغ عن أنماط التعبير الجيني في عينات تبلغ قيمتها RIN 5.0-10.0 لترتبط بشكل جيد مع بعضها البعض23. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة عالية، حيث يمكن الكشف عن أقل من 50 pg/μL من إجمالي الحمض النووي الريبي، فإنه يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على تقييم الجودة إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي في العينة منخفض جدا. لذلك، من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي، وغالبا ما يستخدم قسم الأنسجة المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA، عن طريق أنبوب العازلة على الشريحة24.
على الرغم من أن LCM قد استخدمت على نطاق واسع على أنسجة مجمدة مختلفة، نادرا ما يتم الإبلاغ عن قيم RIN من RNAs المستخرجة. وعلاوة على ذلك، لا توجد دراسات مقارنة لتوضيح الطريقة الأنسب لدراسة الحمض النووي الريبي في عظام الماوس. في هذه الدراسة، تم استخدام أقسام مجمدة من عظم الفخذ الماوس الكبار لتحسين إعداد العينة، بروتوكول LCM واستخراج الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على جودة عالية RNAs. وقد تم تحسين هذا البروتوكول بشكل خاص بالنسبة لنظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

[رنا] عائد ة ونزاهة حاسمة ل [رنا] تحليل. ومع ذلك، غالباً ما يكون من الصعب من الناحية الفنية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء كامل ليزر التقاط microdissection (LCM) الإجراء. بما أنّ [لكم] دراسات يعمل مع [لوو كمّوتس] المادة, اهتمامات حول محدودة [رنا] غلة أيضا مهمّة. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. تم تقييم تأثير بروتوكول تلطيخ، وسمك التبريد، وكمية الأنسجة المجهرية، ومجموعة استخراج الحمض النووي الريبي، ونظام LCM المستخدمة في العائد RNA والسلامة التي تم الحصول عليها من خلايا العظام microdissected. تم إجراء ثمانية ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة باستخدام فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية. كانت العينة تقع بين غشاء تيريفثالات البولي إثيلين (PET) والفيلم اللاصق. وقد استخدم نظام LCM يستخدم الجاذبية لجمع العينات وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNAs عالية الجودة ذات العائد الكافي. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الموقع في الخلايا من أي أنسجة صلبة في كل من الظروف الفسيولوجية وعمليات المرض.

تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام من عظم الفخذ الماوس. في البروتوكول الأمثل، تم قطع 8 ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة على فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار القسم المجمدة LCM التجارية. وكان?...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

تم تطوير بروتوكول احتجاز الليزر microdissection (LCM) للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا من أي أنسجة صلبة.

بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

هل فكرت في أي وقت من قبل حول تسخير قوة التقاط الليزر microdissection لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام محددة داخل بيئتها الطبيعية؟ هنا، ونحن وصف بروتوكول من شأنها أن تمكنك من الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة من اكيات من عظام الماوس. هذه التكنولوجيا هي أداة عظيمة لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في خلايا العظام محددة في نماذج الماوس المعدلة وراثيا أو في نماذج المرض.ويركز البروتوكول الموصوف هنا على عظام الفأر، ولكن يمكن استخدامه لدراسة التعبير الجيني في الموقع في خلايا أي أنسجة صلبة في أي نوع. تساعد على إثبات هذا الإجراء، وسوف يكون كريستيان شولر، وهو فني من مختبري. بعد القتل الرحيم الفئران عن طريق exsanguination تحت التخدير العام، وإزالة عظم الفخذ كله بسرعة.استخدم مشرط ومناشف ورقية لتنظيف عظم الفخذ من الأنسجة الرخوة المحيطة. المقبل، صب مركب درجة حرارة القطع الأمثل في قالب تضمين ووضع عظم الفخذ في الجزء السفلي من القوالب المضمنة. المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل.بمجرد تجميد العينات بالكامل ، لفها في احباط ونقلها على الجليد الجاف إلى ثلاجة. تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة. أولا، تعيين درجة الحرارة في التبريد إلى ناقص 19 درجة مئوية ودرجة حرارة حامل كتلة إلى ناقص 17 درجة مئوية.بعد ذلك، امسح الجزء الداخلي من التبريد مع 70٪ الإيثانول. ضع الشفرة التي يمكن التخلص منها للأنسجة الصلبة والشرائح الزجاجية وأداة مناسبة في الكودوستات لتبرد، واحفظها داخل الكرودوستات لمدة القطاعات. نقل كتلة الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف إلى التبريد والسماح لها لتكواد لمدة 10 دقائق على الأقل.ثم، اضغط على الجزء السفلي من القالب تضمين لدفع كتلة أكتوبر للخروج من القالب. تطبيق ما يكفي من أوكت المتوسطة إلى حامل كتلة للتمسك كتلة إليها والانتظار حتى يتجمد متوسطة أكتوبر تماما. بعد ذلك، ضع حامل الكتلة في حامل الجسم و شده في مكانه.ضبط موقف شفرة وتقليم كتلة في 15 ميكرومتر الزيادات قطع لإزالة OCT تغطي العينة. ضبط التبريد لتوليد ثمانية ميكرومتر أقسام وقطع اثنين إلى ثلاثة اقطات اكيتيونات التي سيتم التخلص منها. وضع فيلم لاصق على كتلة واستخدام أداة المناسب للتمسك الفيلم إلى كتلة.الآن، وجعل خفض ببطء وبسرعة ثابتة، في حين عقد القسم من الفيلم. ضع الفيلم مع العينة التي تواجه على شريحة الزجاج قبل تبريدها على cryobar داخل التبريد لتجنب ذوبان العينة. استخدام الشريط لإصلاح الفيلم إلى الشريحة الزجاجية لتسهيل تلطيخ.في غطاء الدخان، وإعداد الحلول اللازمة من الإيثانول، RNase خالية من المياه، والزيلين على الجليد كما هو مبين في بروتوكول النص. احتضان الأقسام في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. ثم، تراجع بعناية المقاطع في المياه الخالية من RNase لمدة 30 ثانية لإزالة تماما أكتوبر.المقبل، الاستغناء 50 ميكروليتر من LCM التجارية وصمة عار المقطع المجمدة على القسم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثانية. استنزاف القسم عن طريق وضع حافة الشريحة على ورق الأنسجة الماص. شطف القسم في 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية لإزالة أي وصمة عار الزائدة.اغمر أقسام العظام في أنبوب ثان يحتوي على 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية ثم قم بنقلها إلى 100٪ من الزيلين لمدة 30 ثانية. وضع فيلم لاصق على شريحة الزجاج الجاف كدعم، مع الحرص على وضع الفيلم شقة قدر الإمكان. بعد ذلك، ضع شريحة إطار غشاء PET على الفيلم واضغط لفترة وجيزة على إصبع قفاز على الغشاء لإرفاقه بالفيلم.وسوف تقع هذه العينة بين الغشاء والفيلم لاصق. لا ينبغي أن تكون مطوية أو التجاعيد فيلم لاصقة ، ويجب أن يكون هناك أي فقاعات الهواء بين الفيلم والغشاء. ابدأ باستخدام مطهر السطح لتنظيف حامل الغطاء النهائي للمرحلة.قم بتحميل الشريحة إلى حامل الشريحة والأحرف الكبيرة إلى حامل الغطاء. بعد ذلك، قم بضبط التركيز والحصول على نظرة عامة على الشريحة مع الهدف 1.25x. تغيير إلى الهدف 40x وضبط التركيز.باستخدام نظرة عامة على الشريحة، اختر منطقة الاهتمام. ثم، ضبط المعلمات الليزر كما هو مبين هنا، مع التأكد من تحسين هذه المعلمات لكل هدف. إذا فشل الليزر لقطع العينة، وزيادة قوة الليزر.حدد خلايا العظام والعظام والخلايا بطانة العظام في عظم الفخذ أو القشرية على أساس معايير morphologic. رسم خط لمسار الليزر أبعد من الخلايا المستهدفة لتقليل الضرر بواسطة الليزر الأشعة فوق البنفسجية. إذا فشل الليزر في قطع العينة، وتطبيق الليزر أكثر من مرة أو فحص الهدف للبقع من التخفيضات غير مكتملة واستخدام خيار التحرك وقطع لقطع الأنسجة في هذه البقع.جمع كل نوع خلية في 0.5 ملليلتر منفصلة أنبوب الغطاء. أولاً، الاستغناء عن 50 ميكروليتر من العازلة تحلل التي تحتوي على بيتا mercaptoethanol في قبعة أنبوب جمع. lyse العينة عن طريق pippetting عنه صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة دقيقة واحدة.المقبل، تدور أسفل lysate وإضافة 00 ميكرولتردات من العازلة تحلل التي تحتوي على بيتا-mercaptoethanol إلى الأنبوب. لكل شريحة، إعداد أنبوب microcentuge المسمى مع 350 ميكرولترات من العازلة تحلل تحتوي على mercaptoethanol بيتا. استخدم الأقسام المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA.فصل الفيلم بعناية من الغشاء وlyse العينة عن طريق pippetting ببطء العازلة تحلل على القسم عدة مرات. ثم، وضع عينات lysate على الجليد الجاف وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. عندما تكون على استعداد للمتابعة، ذوبان في lysates في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، نقل lysates من الخلايا التي يتم حصادها LCM في أنابيب جمع إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر microcentrifuge واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في هذه الدراسة، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في الخلايا العظمية من عظم الفخذ الماوس. يتم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.تم قياس العائد والسلامة من الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام الكهرباء الكابيلية الدقيقة. ويمكن رؤية الفرق في نوعية الحمض النووي الريبي وكميته التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكولات التحلل المختلفة هنا في الجل التمثيلي والكهرباء. عندما يتم lysed العينة بواسطة pippetting صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة دقيقة واحدة، فمن الممكن لعزل ما يقرب من 8.5 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي من ملليمتر مربع واحد من نسيج العظام microdissected.قيمة RIN هي 8.60. بدلا من ذلك، يتم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم نبض الليزر مزيل الأوجه، الذي ينقل المواد إلى غطاء لاصق معلقة. بالنسبة للعظام الطازجة المجمدة، من الممكن عزل حوالي 1.6 نانوجرام من الحمض النووي الريبي من ملليمتر مربع واحد من أنسجة العظام الجزئية.قيمة RIN هي واحدة. في الختام، أهم الأشياء التي يجب تذكرها في هذا الإجراء هي تطبيق البروتوكول الدائم بالطريقة الصحيحة، ومنع الجفاف الكامل من الأقسام في مجمع الساندويتش، واستخدام نظام LCM مناسب، ولا تتجاوز الحدود الزمنية لحصاد الخلايا. بمجرد أن يكون لديك عزل RNA من الخلايا الملتقطة، يمكنك استخدام الحمض النووي الريبي للتعبير التنميط، على سبيل المثال، بواسطة RNA تسعى.وأخيراً، نود أن نذكركم بأن الزيلين وبيتا ميركابتوتانول هما من المواد الخطرة التي تحتاج إلى التعامل معها تحت غطاء محرك السيارة. بالإضافة إلى ذلك، يرجى اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع النيتروجين السائل وكذلك شفرات التبريد.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

أداة الويب لتوليد عالية الجودة آلة قابل للقراءة البيولوجية مسارات

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...