Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

Forfatterne takker Ute Zeitz og Nikole ginner for deres fremragende tekniske hjælp såvel som Vetcore og Animal Care personale for deres støtte.

Knoglevæv fra mus blev brugt i nøje overensstemmelse med gældende retningslinjer for dyrepleje og alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrs lidelser.
1. dyr og fryse indlejring
<ol><li>Husdyr under forhold med konstant rumtemperatur (RT; 24 °C) og 12 timer lys/12 h mørk cyklus med fri adgang til mad og vand. Bemærk: knoglevævet i dette studie blev opnået fra 3-måneders-gammel mandlig vildtype C57BL/6-mus.</li>
	<li>Ved nekropsy, afblødning mus fra abdom...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

Både RNA-kvalitet og-kvantitet kan påvirkes negativt i alle stadier af prøve præparatet, såsom vævs manipulation, LCM-proces og RNA-ekstraktion. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til efterfølgende analyse af genekspression.
For LCM bruger de fleste laboratorier sektioner 7 − 8 μm tyk2. Tykkere sektioner ville tillade mere materiale, der skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette reducere mikroskopisk opløs...

Væv består af heterogene og rummæssigt distribuerede celletyper. Forskellige celletyper i et givet væv kan reagere forskelligt på det samme signal. Derfor er det vigtigt at være i stand til at isolere specifikke cellepopulationer til vurdering af rollen af forskellige celletyper i både fysiologiske og patologiske forhold. Laser opsamling microdissection (LCM) tilbyder en relativt hurtig og præcis metode til isolering og fjernelse af specificerede celler fra komplekse væv1. LCM-systemer bruger kraften i en laserstråle til at adskille de celler af interesse fra histologiske vævs sektioner uden behov for enzymatisk behandling eller vækst i kulturen. Det betyder, at cellerne er i deres naturlige vævs habitat, og at vævs arkitekturen, herunder det geografiske forhold mellem forskellige celler, bevares. Morfologi af både de tilfangetagne celler og det resterende væv er velbevaret, og flere vævs komponenter kan udtages sekventielt fra samme slide. Isolerede celler kan derefter anvendes til efterfølgende analyse af deres RNA-, DNA-, protein-eller metabolit-indhold2,3.
For at analysere genekspression i forskellige cellepopulationer, eller efter forskellige behandlinger, er det nødvendigt at få mRNAs af tilstrækkelig kvalitet og mængde til den efterfølgende analyse4,5. I modsætning til DNA er RNAs mere følsomme over for fiksering, og brugen af frosset væv anbefales, når målet er at studere RNA. Da mRNAs hurtigt nedbrydes af allestedsnærværende ribonucleaser (RNase), er der behov for strenge RNase frie forhold under prøvehåndtering og klargøring og undgå opbevaring af prøver ved stuetemperatur. Desuden er hurtige teknikker uden længerevarende vandige fase trin afgørende for at forhindre RNA-nedbrydning6. RNA-udbyttet og-integriteten kan også påvirkes af LCM-processen, og LCM-systemet brugte7,8. I øjeblikket er fire LCM-systemer med forskellige driftsprincipper tilgængelige2. Metoden til RNA-ekstraktion kan også være vigtig, da forskellige RNA-isolations kits er blevet testet med betydelige forskelle i RNA-kvantitet og kvalitet7,8.
Enhver vævs præparationsmetode kræver at finde en balance mellem opnåelse af god morfologisk kontrast og opretholdelse af RNA-integritet til yderligere analyser. Til fremstilling af frosne sektioner fra knogler, en klæbende film blev udviklet og løbende forbedret9. Knogle sektionerne skæres og farves direkte på den selvklæbende film. Denne klæbende film gælder for mange typer af farvning, og kan anvendes til at isolere de celler af interesse fra knogle kryosektioner ved hjælp af LCM9,10,11,12,13, 14. Alle trinene, herunder kirurgisk fjernelse, indlejring, frysning, skæring og farvning kan afsluttes inden for mindre end en time. Det er vigtigt, at celler som osteoblaster, knogle foring celler og osteoklaster tydeligt kan identificeres9,10,11,12,13,14. Denne metode har den fordel at være hurtig og enkel. En alternativ metode til generering af knogle kryosektioner er at bruge tape transfersystemet15. Men sidstnævnte teknik er mere tidskrævende og kræver yderligere instrumentering, da afsnittene skal overføres fra Klæbebåndet til præbelagte membran glider ved ultraviolet (UV) Cross-Linking. Selv om tape transfersystemet er blevet kombineret med LCM16,17,18,19, skal det bemærkes, at den tvær tilknyttede belægning kan skabe et baggrundsmønster, der kan interferere med celle-type identifikation20.
Typisk udvindes kun små mængder af RNA fra mikrodissekerede celler, og RNA-kvalitet og-mængde vurderes ofte ved mikrokapillær elektroforese21. Et edb-program bruges til at tildele et kvalitetsindeks til RNA-ekstrakter kaldet RNA-integritets nummer (RIN). En RIN-værdi på 1,0 indikerer fuldstændig forringet RNA, hvorimod en værdi på 10,0 antyder, at RNA er fuldt intakt22. Normalt, indekser over 5 anses for tilstrækkelige til RNA-undersøgelser. Genekspressions mønstre i prøver med en RIN-værdi på 5,0 − 10,0 er blevet rapporteret til at korrelere godt med hinanden23. Selv om følsomheden af denne metode er høj, da så lidt som 50 PG/μL af total RNA kan påvises, det kan være meget vanskeligt at opnå en kvalitetsvurdering, hvis RNA koncentrationen i prøven er meget lav. For at vurdere RNA-kvaliteten anvendes den vævs sektion, der er tilbage efter LCM'EN, ofte til at udtrække RNA ved pipette Rings buffer på diaset24.
Selvom LCM har været anvendt i udstrakt grad på forskellige frosne væv, er RIN-værdierne af ekstraherede RNAs sjældent indberettet. Desuden er der ingen sammenlignende undersøgelser for at præcisere den mest hensigtsmæssige metode til at studere RNA i mus knogler. I nærværende undersøgelse blev frosne sektioner fra voksne mus skinneben er fuldstændig brugt til at optimere prøveforberedelse, LCM-protokol og RNA-ekstraktion for at opnå højkvalitets RNAs. Denne protokol blev optimeret specielt til LCM-systemet, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA-udbytte og-integritet er afgørende for RNA-analyse. Men, det er ofte teknisk udfordrende at opretholde RNA integritet gennem hele laser opsamling microdissection (LCM) procedure. Da LCM-studierne arbejder med lave mængder materiale, er bekymringerne om begrænsede RNA-udbytter også vigtige. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til analyse af genekspression i knogleceller. Virkningen af farvnings protokollen, tykkelsen af kryosektioner, mikrodissekeret vævs mængde, RNA-ekstraktions kit og LCM-system, der anvendes på RNA-udbytte og integritet opnået fra mikrodissekerede knogleceller, blev evalueret. Otte-μm-tykke frosne knogle sektioner blev lavet ved hjælp af en klæbende film og plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM plet. Prøven blev klemt inde mellem en polyethylenterephthalatmembran (PET) og den selvklæbende folie. Et LCM-system, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling og en kolonne baseret RNA-ekstraktionsmetode, blev brugt til at opnå tilstrækkelig udbytte af højkvalitets RNAs. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere in situ-genekspression i celler i ethvert hårdt væv i både fysiologiske forhold og sygdomsprocesser.

En LCM-protokol blev udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til analyse af genekspression i knogleceller i muse femurs. I den optimerede protokol, 8 μm-tykke frosne knogle sektioner blev skåret på en selvklæbende film og plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM frosne sektion bejdsen. Prøven blev klemt inde mellem PET-membranen og den selvklæbende folie. Mus knogleceller blev microdissekeret ved hjælp af en LCM system, der bruger tyngdekraften til prøveindsamling. ...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En laser Capture microdissection (LCM) protokol blev udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde af høj kvalitet RNA til genekspression analyse i knogleceller. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere genekspression i celler i ethvert hårdt væv.

En laser Capture Micro Dissection protokol, der giver høj kvalitet RNA fra fersk-frosne mus knogler

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Har du nogensinde tænkt på at udnytte styrken i laser fange mikrodissektion til analyse af genekspression i specifikke knogleceller i deres naturlige miljø? Her beskriver vi en protokol, der vil gøre dig i stand til at opnå tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA fra kryosektioner af museknogler. Denne teknologi er et fantastisk værktøj til at undersøge ændringer i genekspression i specifikke knogleceller i gensplejsede musemodeller eller i sygdomsmodeller.Den protokol, der er beskrevet her, er fokuseret på museknogler, men kan bruges til at studere in situ et genekspression i celler af hårdt væv i enhver art. Med til at demonstrere denne procedure, vil være Christiane Schueler, en tekniker fra mit laboratorium. Efter euthanizing mus ved exsanguination under generel anæstesi, fjerne hele lårben hurtigt.Brug en skalpel og papirservietter til at rense lårben af de omkringliggende bløde væv. Dernæst hæld optimal skæretemperatur sammensatte i indlejring skimmel og placere lårben i bunden af indlejring forme. Snap fryse prøverne i flydende nitrogen.Når prøverne er helt frosset, pak dem i folie og overføre dem på tøris til en fryser. Opbevar dem på minus 80 grader Celsius, indtil de er klar til videre behandling. Først indstilles temperaturen i kryostaten til minus 19 grader Celsius og temperaturen på blokholderen til minus 17 grader Celsius.Dernæst tørre det indre af kryostaten med 70% ethanol. Placer engangsbladet til hårdt væv, glasdias og et monteringsværktøj i kryostaten for at køle af, og hold dem inde i kryostaten under hele sektionen. Den frosne vævsblok overføres på tøris til kryostaten, og den skal ligevægte i mindst 10 minutter.Tryk derefter på bunden af indlejringsformen for at skubbe OLT-blokken ud af formen. Påfør nok OCT medium til blokken indehaveren til at overholde blokken til det og vente, indtil OLT medium fryser helt. Derefter skal blokholderen i objektholderen sættes i objektholderen, og den strammes på plads.Juster klingepositionen, og beskære blokken i 15-mikrometerskæretrin for at fjerne OLT, der dækker prøven. Juster kryostaten for at generere otte mikrometersektioner og skær to til tre kryosektioner, der vil blive kasseret. Placer klæbefilm på blokken og bruge monteringsværktøjet til at holde filmen til blokken.Nu gør et snit langsomt og ved konstant hastighed, mens du holder afsnittet af filmen. Anvend filmen med prøven opad på et forkølet glasrutsjebane på kryopanelet i kryostaten for at undgå optøning af prøven. Brug tape til at fastgøre filmen til glasrutsjebanen for at gøre det nemmere at farvning.I en røghætte skal du forberede de nødvendige opløsninger af ethanol, RNase-frit vand og xylen på is som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber sektionerne i 95% ethanol i 30 sekunder. Derefter skal du forsigtigt dyppe sektionerne i RNase-frit vand i 30 sekunder for helt at fjerne OLT.Dernæst dispenseres 50 mikroliter kommerciel lcm frossen sektionsplet på sektionen og inkuberes ved stuetemperatur i 10 sekunder. Hæld vandet fra sektionen ved at placere kanten af sliden på absorberende silkepapir. Skyl afsnittet i 100% ethanol i 30 sekunder for at fjerne overskydende pletter.Nedsænk knoglesektionerne i et andet rør, der indeholder 100%ethanol i 30 sekunder, og overfør dem derefter til 100% xylen i 30 sekunder. Sæt selvklæbende film på et tørt glas dias som en støtte, idet du skal passe på at placere filmen så flad som muligt. Derefter skal du placere en PET membran ramme dias på filmen og kort trykke en behandsket finger på membranen til at fastgøre den til filmen.Denne prøve vil blive klemt inde mellem membranen og klæbefilmen. Den selvklæbende film bør ikke foldes eller rynkes, og der bør ikke være luftbobler mellem filmen og membranen. Start med at bruge overfladedekontamineringsmiddel til at rengøre hætteholderen i fasen.Læg slidlet ind i lysslideren og hætterne i holderen. Juster derefter fokus og få et diasoversigt med 1,25x-målet. Skift til 40x-målsætningen, og juster fokus.Vælg det interesseområde, der er vist, ved hjælp af slideoversigten. Juster derefter laserparametrene som vist her, og sørg for at optimere disse parametre for hvert mål. Hvis laseren ikke skærer prøven, skal du øge lasereffekten.Vælg osteoblast, osteoturer og knogleforingsceller i distale femorale cancellous eller kortikale knogler baseret på morfologiske kriterier. Tegn en linje til laserstien længere væk fra målcellerne for at minimere skaden ved UV-laseren. Hvis laseren ikke skærer prøven, skal du anvende laseren mere end én gang eller inspicere målet for pletter af ufuldstændige snit og bruge flytte og skære mulighed for at skære vævet i disse pletter.Hver celletype opsamls i en separat 0,5 milliliter rørhætte. Først skal der dispenseres 50 mikroliter af lysisbufferen indeholdende beta mercaptoethanol i hætten på opsamlingsrøret. Lyse prøven ved at pippetting det op og ned i hætten i et minut.Drej derefter lysatet ned og tilsæt 00 mikroliter af lysisbufferen, der indeholder beta-mercaptoethanol, til røret. For hvert dias tilberedes et mærket mikrocentrifugerør med 350 mikroliter af lysisbufferen, der indeholder beta mercaptoethanol. Brug de resterende sektioner efter LCM til at udtrække RNA.Fjern forsigtigt filmen fra membranen og lyser prøven ved langsomt at pippetting lysis bufferen på sektionen flere gange. Derefter sættes lysatprøverne på tøris og opbevar dem på minus 80 grader Celsius. Når du er klar til at fortsætte, optø lysaterne ved stuetemperatur.Herefter overføres lysaterne fra LCM-høstede celler i opsamlingsrørene til nye mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, og RNA trækkes ud i overensstemmelse med producentens anvisninger. I denne undersøgelse udvikles en LCM-protokol for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til genekspressionsanalyse i knogleceller i muse lårben. LCM udføres ved hjælp af et LCM-system, der bruger tyngdekraften til prøveindsamling.Udbyttet og integriteten af isoleret RNA blev målt ved hjælp af mikrokapillær elektroforese. Forskellen i RNA-kvalitet og -kvantitet opnået ved hjælp af forskellige lysisprotokoller kan ses her i den repræsentative gel og elektrofærografier. Når prøven lyses ved pippetting op og ned i hætten i et minut, er det muligt at isolere ca 8,5 nanogram RNA fra en kvadratnillimeter mikrodissected knoglevæv.RIN-værdien er 8,60. Alternativt udføres LCM ved hjælp af et LCM-system, der bruger en defocused laserpuls, som katapulterer materialet ind i den overhængende klæbehætte. For friske frosne knogler er det muligt at isolere ca. 1,6 nanogram RNA fra en kvadratmillimeter mikrodissected knoglevæv.RIN-værdien er én. Afslutningsvis er de vigtigste ting at huske i denne procedure anvende den stående protokol på den rigtige måde, forhindre fuldstændig tørring af sektioner i sandwich kompleks, bruge en passende LCM system, og ikke overskrider de frister for høst af cellerne. Når du har isoleret RNA fra de tilfangetagne celler, kan du bruge RNA'et til udtryksprofilering, for eksempel ved RNA-søge.Endelig vil vi gerne minde om, at xylen og beta-mercaptoethanol er farlige stoffer, der skal håndteres under en hætte. Derudover skal du tage passende forholdsregler ved håndtering af flydende nitrogen og også kryotombladene.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolation fra Mouse Pancreas: en ribonuklease-rige væv

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

En Web værktøj til at generere høj kvalitet maskinlæsbare biologiske veje

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

En simpel højeffektiv protokol til den pankreatiske ø-isolation fra mus

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser fange Microdissection af yderst rene trabekelværket fra mus øjne for gen Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...