Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

De auteurs bedanken Ute Zeitz en Nikole Ginner voor hun uitstekende technische hulp, evenals de Vetcore en dierenverzorging voor hun steun.

Botweefsel van muizen werd gebruikt in strikte overeenstemming met de heersende richtlijnen voor dierenverzorging en alle inspanningen werden gedaan om dierenleed te minimaliseren.
1. dieren en inbedding bevriezen
<ol><li>Huisdieren in omstandigheden van constante kamertemperatuur (RT; 24 °C) en een 12 h licht/12 uur donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. Opmerking: bot weefsels in deze studie werden verkregen uit 3 maanden oude mannelijke wild type C57B...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

Zowel RNA-kwaliteit als kwantiteit kunnen negatief worden beïnvloed in alle stadia van de monstervoorbereiding, zoals weefsel manipulatie, LCM-proces en RNA-extractie. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor latere genexpressie analyse.
Voor LCM gebruiken de meeste laboratoria secties 7 − 8 μm dik2. Dikkere secties zou toelaten om meer materiaal te oogsten. Echter, als ze te dik, dit kan de microscopische resolutie verm...

Weefsels bestaan uit heterogene en ruimtelijk gedistribueerde celtypen. Verschillende celtypen in een bepaald weefsel kunnen verschillend reageren op hetzelfde signaal. Daarom is het essentieel om specifieke celpopulaties te isoleren voor de beoordeling van de rol van verschillende celtypen in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Laser Capture microdissection (LCM) biedt een relatief snelle en precieze methode voor het isoleren en verwijderen van gespecificeerde cellen uit complexe weefsels1. LCM-systemen gebruiken de kracht van een laserstraal om de cellen van belang van histologische weefsel secties te scheiden zonder de noodzaak voor enzymatische verwerking of groei in cultuur. Dit betekent dat de cellen in hun natuurlijke weefsel habitat, en dat weefsel architectuur met inbegrip van de ruimtelijke relatie tussen de verschillende cellen behouden blijft. Morfologie van zowel de gevangen cellen als het rest weefsel is goed bewaard gebleven, en verschillende weefsel componenten kunnen opeenvolgend uit dezelfde dia worden bemonsterd. Geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de daaropvolgende analyse van hun RNA-, DNA-, eiwit-of metaboliet gehalte2,3.
Om genexpressie in verschillende celpopulaties of na verschillende behandelingen te analyseren, is het noodzakelijk om mrna's van voldoende kwaliteit en kwantiteit te verkrijgen voor de daaropvolgende analyse4,5. In tegenstelling tot DNA zijn Rna's gevoeliger voor fixatie en wordt het gebruik van bevroren weefsel aanbevolen wanneer het doel is om RNA te bestuderen. Aangezien Mrna's snel worden afgebroken door alomtegenwoordige ribonucleases (RNase), zijn strenge RNase-vrije condities tijdens het hanteren en voorbereiden van het preparaat en het vermijden van opslag van monsters bij kamertemperatuur vereist. Bovendien zijn snelle technieken zonder verlengde waterige fase stappen cruciaal om RNA afbraak6te voorkomen. Het RNA-rendement en de integriteit kunnen ook worden beïnvloed door het LCM-proces en het LCM-systeem dat7,8wordt gebruikt. Momenteel zijn er vier LCM-systemen met verschillende werkingsprincipes beschikbaar2. De methode van RNA-extractie kan ook belangrijk zijn, omdat verschillende RNA-isolatiekits zijn getest met aanzienlijke verschillen in RNA-hoeveelheid en kwaliteit7,8.
Elke weefsel bereidingsmethode vereist het vinden van een evenwicht tussen het verkrijgen van een goed morfologisch contrast en het behoud van RNA-integriteit voor verdere analyses. Voor het klaarmaken van bevroren delen van bot, werd een zelfklevende film ontwikkeld en continu verbeterd9. De botten secties worden gesneden en direct op de zelfklevende folie gekleurd. Deze zelfklevende folie is toepasbaar op vele soorten vlekken, en kan worden gebruikt om de cellen van belang te isoleren van botcryosecties met behulp van LCM9,10,11,12,13, 14. Alle stappen, waaronder de chirurgische verwijdering, inbedding, invriezen, snijden en vlekken, kunnen binnen minder dan een uur worden voltooid. Belangrijk is dat cellen zoals osteoblasten, botvoercellen en osteoclasten duidelijk kunnen worden geïdentificeerd9,10,11,12,13,14. Deze methode heeft het voordeel dat het snel en eenvoudig is. Een alternatieve methode voor het genereren van botcryosecties is het gebruik van het tape transfersysteem15. De laatste techniek is echter meer tijdrovend en vereist extra instrumentatie, omdat de secties van de plakband moeten worden overgebracht naar voorgecoate membraan glaasjes door ultraviolette (UV) Cross-linking. Hoewel het tape transfersysteem met succes is gekoppeld aan LCM16,17,18,19, moet worden opgemerkt dat de kruislings gekoppelde coating een achtergrond patroon kan creëren dat kan interfereren met cel-type identificatie20.
Typisch, slechts kleine hoeveelheden van RNA worden geëxtraheerd uit micro-ontleed cellen, en RNA kwaliteit en kwantiteit worden vaak beoordeeld door micro-capillaire elektroforese21. Een computerprogramma wordt gebruikt om een index van kwaliteit toe te wijzen aan RNA-extracten die RNA-integriteits nummer (RIN) worden genoemd. Een RIN-waarde van 1,0 duidt volledig gedegradeerd RNA aan, terwijl een waarde van 10,0 suggereert dat het RNA volledig intact is22. Meestal worden indexen van meer dan 5 voldoende geacht voor RNA-studies. Genexpressie patronen in monsters met een RIN-waarde van 5,0 − 10,0 zijn gemeld om goed te correleren met elkaar23. Hoewel de gevoeligheid van deze methode hoog is, omdat er zo weinig als 50 pg/μL van totaal RNA kan worden gedetecteerd, kan het zeer moeilijk zijn om een kwaliteitsbeoordeling te verkrijgen als de RNA-concentratie in het monster zeer laag is. Daarom, om de kwaliteit van RNA te beoordelen, wordt de weefsel sectie die overblijft na de LCM vaak gebruikt om RNA te extraheren, door Pipetteer buffer op de dia24.
Hoewel LCM op grote schaal is gebruikt op verschillende bevroren weefsels, worden de RIN-waarden van geëxtraheerde Rna's zelden gerapporteerd. Bovendien zijn er geen vergelijkende studies om de meest geschikte methode voor het bestuderen van RNA in muis botten te verduidelijken. In de huidige studie werden bevroren delen van volwassen muis dijbeen gebruikt om de monstervoorbereiding, het LCM-protocol en de RNA-extractie te optimaliseren om hoge kwaliteit rna's te verkrijgen. Het huidige protocol is speciaal geoptimaliseerd voor het LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA-opbrengst en-integriteit zijn bepalend voor RNA-analyse. Echter, het is vaak technisch uitdagend om te handhaven RNA-integriteit gedurende de gehele Laser Capture microdissection (LCM) procedure. Aangezien LCM-studies werken met lage hoeveelheden materiaal, zijn bezorgdheid over beperkte RNA-opbrengsten ook belangrijk. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. Het effect van kleurings protocol, dikte van cryosecties, microdissected weefsel hoeveelheid, RNA-extractie Kit en LCM-systeem dat wordt gebruikt op RNA-opbrengst en integriteit verkregen uit microdissected-botcellen werd geëvalueerd. De diepgevroren botgedeelten van acht μm werden gemaakt met behulp van een zelfklevende folie en bevlekt met een snel protocol voor een commerciële LCM vlek. Het monster werd ingeklemd tussen een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en de zelfklevende folie. Een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname en een op kolom gebaseerde RNA-extractiemethode werden gebruikt om hoge kwaliteit Rna's van voldoende opbrengst te verkrijgen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Echter, de hier gerapporteerde LCM protocol kan worden gebruikt om te studeren in situ genexpressie in cellen van een hard weefsel in zowel fysiologische omstandigheden en ziekteprocessen.

Een LCM-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in Botcellen van muis femurs. In het geoptimaliseerde protocol werden 8 μm dikke diepgevroren botgedeelten op een zelfklevende film gesneden en gekleurd met behulp van een snel protocol voor een commerciële LCM bevroren sectie vlek. Het monster werd ingeklemd tussen het PET-membraan en de zelfklevende folie. Muis botcellen werden microdissected met behulp van een LCM-systeem dat zwaartekracht ge...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Heb je ooit nagedacht over het benutten van de kracht van laser capture microdissection voor analyse van genexpressie in specifieke botcellen binnen hun natuurlijke omgeving? Hier beschrijven we een protocol waarmee u voldoende hoeveelheden RNA van hoge kwaliteit verkrijgen uit cryosections van muisbotten. Deze technologie is een geweldig hulpmiddel voor het onderzoeken van veranderingen in genexpressie in specifieke botcellen in genetisch gemanipuleerde muismodellen of in ziektemodellen.Het hier beschreven protocol is gericht op muizenbotten, maar kan worden gebruikt om in situ een genexpressie te bestuderen in cellen van elk hard weefsel bij elke soort. Helpen om deze procedure aan te tonen, zal Worden Christiane Schueler, een technicus van mijn laboratorium. Na het euthanaseren van muizen door exsanguinatie onder algemene anesthesie, verwijder hele femurs snel.Gebruik een scalpel en papieren handdoeken om de femurs van de omliggende zachte weefsels schoon te maken. Giet vervolgens een optimale snijtemperatuurverbinding in de inbeddingsvorm en plaats de femurs in de bodem van de inbeddingsvormen. Snap bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof.Zodra de monsters volledig zijn bevroren, wikkel ze in folie en breng ze op droogijs naar een vriezer. Bewaar ze op min 80 graden Celsius tot klaar voor verdere verwerking. Stel eerst de temperatuur in de cryostat in op min 19 graden Celsius en de temperatuur van de blokhouder op min 17 graden Celsius.Veeg vervolgens het interieur van de cryostat weg met 70% ethanol. Plaats het wegwerpblad voor harde weefsels, de glazen glijbanen en een passend gereedschap in de cryostat om af te koelen en bewaar ze in de cryostat voor de duur van de sectie. Breng het bevroren weefselblok op droogijs over naar de cryostat en laat het minstens 10 minuten equiliberen.Druk vervolgens op de onderkant van de inbeddingsvorm om het OCT-blok uit de mal te duwen. Breng voldoende OCT-medium aan op de blokhouder om het blok eraan te hechten en wacht tot het OCT-medium volledig bevriest. Plaats hierna de blokhouder in de objecthouder en draai deze op zijn plaats.Pas de bladpositie aan en snijd het blok in snijstappen van 15 micrometer om de LGO voor het monster te verwijderen. Pas de cryostat aan om secties van acht micrometer te genereren en snijd twee tot drie cryosections die worden weggegooid. Plaats lijmfolie op het blok en gebruik het montagegereedschap om de folie aan het blok te hechten.Nu, maak een snede langzaam en op constante snelheid, terwijl de sectie door de film. Plaats de film met het monster naar boven op een voorgekoelde glazen schuif op de cryobar in de cryostat om ontdooiing van het monster te voorkomen. Gebruik tape om de film vast te stellen aan de glazen glijbaan voor een gemakkelijkere kleuring.Bereid in een rookkap de nodige oplossingen voor van ethanol, RNase-vrij water en xyleen op ijs zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 30 seconden. Vervolgens, zorgvuldig dompel de secties in RNase-vrij water gedurende 30 seconden om volledig te verwijderen van de OKT.Vervolgens 50 microliters commerciële LCM bevroren sectie vlek op de sectie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 seconden. Giet het gedeelte af door de rand van de dia op absorberend tissuepapier te plaatsen. Spoel de sectie in 100% ethanol gedurende 30 seconden om overtollige vlek te verwijderen.Dompel de botsecties onder in een tweede buis met 100% ethanol gedurende 30 seconden en breng ze vervolgens gedurende 30 seconden over naar 100%xyleen. Leg lijmfolie als ondersteuning op een droge glazen glijbaan en zorg ervoor dat de folie zo plat mogelijk wordt geplaatst. Plaats hierna een PET-membraanframe op de film en druk kort een gehandschoende vinger op het membraan om het aan de film te bevestigen.Dit monster wordt ingeklemd tussen het membraan en de kleeffilm. De kleeffolie mag niet worden gevouwen of gerimpeld en er mogen geen luchtbellen tussen de film en het membraan zijn. Begin met het gebruik van oppervlaktedecontaminant om de houder van het podiumeind te reinigen.Laad de schuif in de schuifhouder en de doppen in de dophouder. Pas vervolgens de focus aan en verkrijg een diaoverzicht met de doelstelling 1.25x. Verander naar de 40x doelstelling en pas de focus aan.Kies met het diaoverzicht het interessegebied. Pas vervolgens de laserparameters aan zoals hier wordt weergegeven, zodat u deze parameters voor elke doelstelling optimaliseert. Als de laser er niet in slaagt om het monster te snijden, verhoog de laserkracht.Selecteer osteoblast, osteocites, en bot voering cellen in distale femorale cancellous of corticale bot op basis van morfologische criteria. Teken een lijn voor het laserpad verder weg van de doelcellen om de schade door de UV-laser te minimaliseren. Als de laser er niet in slaagt om het monster te snijden, breng de laser meer dan eens of inspecteer het doel voor vlekken van onvolledige bezuinigingen en gebruik de move and cut optie om het weefsel te snijden in deze plekken.Verzamel elk celtype in een aparte buisdop van 0,5 milliliter. Ten eerste, doe 50 microliter van de lysebuffer met bètamercaptoethanol in de dop van de opvangbuis. Lyse het monster door pippetting het op en neer in de dop voor een minuut.Draai vervolgens het lysaat naar beneden en voeg 00 microliters toe van de lysebuffer met bèta-mercaptoethanol aan de buis. Bereid voor elke dia een gelabelde microcentrifugebuis met 350 microliter van de lysebuffer met beta mercaptoethanol. Gebruik de secties die na de LCM overblijven om RNA te extraheren.Scheid de folie voorzichtig van het membraan en lyse het monster door de lysisbuffer langzaam meerdere keren op de sectie te spuiten. Zet vervolgens de lysate monsters op droog ijs en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Wanneer klaar om verder te gaan, ontdooien de lysates bij kamertemperatuur.Breng hierna de lysates van LCM-geoogste cellen in de opvangbuizen over naar nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en extraher RNA volgens de instructies van de fabrikant. In deze studie wordt een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende hoeveelheid RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen voor genexpressieanalyse in botcellen van muisvrouwlijken. LCM wordt uitgevoerd met behulp van een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterverzameling.De opbrengst en integriteit van geïsoleerd RNA werd gemeten met behulp van microcapillaire elektroforese. Het verschil in RNA kwaliteit en kwantiteit verkregen met behulp van verschillende lyse protocollen kan hier worden gezien in de representatieve gel en elektroferogrammen. Wanneer het monster gedurende één minuut op en neer in de dop wordt gelyseerd, is het mogelijk om ongeveer 8,5 nanogram RNA te isoleren van één vierkante millimeter microdissected botweefsel.De RIN-waarde is 8,60. Als alternatief wordt LCM uitgevoerd met behulp van een LCM-systeem dat gebruik maakt van een onscherpe laserpuls, die het materiaal katapulteert in de overhangende kleefdop. Voor verse bevroren botten is het mogelijk om ongeveer 1,6 nanogram RNA te isoleren van één vierkante millimeter microdissected botweefsel.De RIN-waarde is één. Tot slot, de belangrijkste dingen om te onthouden in deze procedure zijn het toepassen van het permanente protocol op de juiste manier, voorkomen dat volledige uitdroging van secties in het sandwichcomplex, gebruik maken van een geschikt LCM-systeem, en niet meer dan de termijnen voor het oogsten van de cellen. Zodra u RNA van de gevangen cellen hebt geïsoleerd, u het RNA gebruiken voor expressieprofilering, bijvoorbeeld door RNA zoeken.Tot slot willen we u eraan herinneren dat xyleen en bèta-mercaptoethanol gevaarlijke stoffen zijn die onder een kap moeten worden behandeld. Neem bovendien de juiste voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van vloeibare stikstof en ook de cryotoombladen.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

Een Web tool voor het genereren van hoge kwaliteit Machine-leesbaar biologische pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...