Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
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Les auteurs remercient Ute Zeitz et Nikole Ginner pour leur excellente aide technique ainsi que le Vetcore et le personnel de soins aux animaux pour leur soutien.

Le tissu osseux des souris a été employé dans le strict respect des directives en vigueur pour des soins d'animal et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance animale.
1. Animaux et Congeler l'intégration
<ol><li>Maison des animaux dans des conditions de température ambiante constante (RT; 24 oC) et d'un cycle sombre de 12 h/12 h avec accès gratuit à la nourriture et à l'eau. REMARQUE: Des tissus osseux dans cette étude ont été obt...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

La qualité et la quantité d'ARN peuvent être affectées négativement à toutes les étapes de la préparation d'échantillon telle que la manipulation de tissu, le processus de LCM, et l'extraction d'ARN. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse suivante d'expression de gène.
Pour l'AmC, la plupart des laboratoires utilisent des sections de 7 à 8 m d'épaisseur2. Des sections plus épai...

Les tissus sont constitués de types de cellules hétérogènes et distribuées spatialement. Différents types de cellules dans un tissu donné peuvent réagir différemment au même signal. Par conséquent, il est essentiel d'être en mesure d'isoler des populations cellulaires spécifiques pour l'évaluation du rôle des différents types de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. La microdissection de capture au laser (LCM) offre une méthode relativement rapide et précise pour isoler et enlever les cellules spécifiées des tissus complexes1. Les systèmes LCM utilisent la puissance d'un faisceau laser pour séparer les cellules d'intérêt des sections de tissus histologiques sans avoir besoin de traitement enzymatique ou de croissance de la culture. Cela signifie que les cellules sont dans leur habitat tissulaire naturel, et que l'architecture tissulaire, y compris la relation spatiale entre les différentes cellules est conservée. La morphologie des cellules capturées et du tissu résiduel est bien préservée, et plusieurs composants tissulaires peuvent être échantillonnés séquentiellement à partir de la même diapositive. Les cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour l'analyse ultérieure de leur ARN, ADN, protéines ou métabolites2,3.
Afin d'analyser l'expression des gènes dans différentes populations cellulaires, ou après différents traitements, il est nécessaire d'obtenir des ARNm de qualité et de quantité suffisantes pour l'analyse ultérieure4,5. Contrairement à l'ADN, les ARN sont plus sensibles à la fixation et l'utilisation de tissus congelés est recommandée lorsque l'objectif est d'étudier l'ARN. Étant donné que les ARNm sont rapidement dégradées par des ribonucalis omniprésents (RNase), des conditions strictes sans RNase pendant la manipulation et la préparation des échantillons et d'éviter le stockage des échantillons à température ambiante sont nécessaires. En outre, les techniques rapides sans aucune étape aqueuse prolongée de phase sont cruciales pour empêcher la dégradation d'ARN6. Le rendement et l'intégrité de l'ARN peuvent également être affectés par le processus LCM et le système LCM utilisé7,8. Actuellement, quatre systèmes LCM avec des principes d'exploitation différents sont disponibles2. La méthode d'extraction de l'ARN peut également être importante, puisque différents kits d'isolement d'ARN ont été testés avec des différences significatives dans la quantité et la qualité d'ARN7,8.
Toute méthode de préparation des tissus nécessite de trouver un équilibre entre l'obtention d'un bon contraste morphologique et le maintien de l'intégrité de l'ARN pour d'autres analyses. Pour la préparation des sections congelées de l'os, un film adhésif a été développé et continuellement amélioré9. Les sections osseuses sont coupées et tachées directement sur le film adhésif. Ce film adhésif est applicable à de nombreux types de coloration, et peut être utilisé pour isoler les cellules d'intérêt de cryosections osseuses en utilisant LCM9,10,11,12,13, 14. Toutes les étapes, y compris l'ablation chirurgicale, l'intégration, la congélation, la coupe et la coloration peuvent être complétées en moins d'une heure. Fait important, les cellules telles que les ostéoblastes, les cellules de doublure osseuse, et les ostéoclastes peuvent être clairement identifiés9,10,11,12,13,14. Cette méthode a l'avantage d'être rapide et simple. Une autre méthode pour générer des cryosections osseuses est d'utiliser le système de transfert de bande15. Cependant, cette dernière technique prend plus de temps et nécessite une instrumentation supplémentaire, puisque les sections doivent être transférées du ruban adhésif sur des glissières de membrane précouchées par liaison croisée ultraviolette (UV). Bien que le système de transfert de bande a été couplé avec succès avec LCM16,17,18,19, il convient de noter que le revêtement relié transversal peut créer un modèle de fond qui peut interférer avec l'identification de type cellulaire20.
Typiquement, seulement de petites quantités d'ARN sont extraites des cellules microdissés, et la qualité et la quantité d'ARN sont souvent évaluées par électrophorèse micro-capillaire21. Un programme informatique est utilisé pour attribuer un indice de qualité aux extraits d'ARN appelés numéro d'intégrité de l'ARN (RIN). Une valeur RIN de 1,0 indique l'ARN complètement dégradé, tandis qu'une valeur de 10,0 suggère que l'ARN est entièrement intact22. Habituellement, les indices de plus de 5 sont considérés comme suffisants pour les études d'ARN. Des modèles d'expression génique dans des échantillons d'une valeur RIN de 5,0 à 10,0 ont été rapportés en corrélation entreeux 23. Bien que la sensibilité de cette méthode soit élevée, puisque l'on peut détecter à moins de 50 pg/L d'ARN total, il peut être très difficile d'obtenir une évaluation de la qualité si la concentration d'ARN dans l'échantillon est très faible. Par conséquent, afin d'évaluer la qualité de l'ARN, la section tissulaire restante après le LCM est souvent utilisée pour extraire l'ARN, en tampon pipetting sur la diapositive24.
Bien que le LCM ait été largement utilisé sur différents tissus congelés, les valeurs RIN des ARN extraites sont rarement rapportées. En outre, il n'existe pas d'études comparatives pour clarifier la méthode la plus appropriée pour étudier l'ARN dans les os de souris. Dans la présente étude, des sections congelées de fémurs de souris adultes ont été utilisées pour optimiser la préparation de l'échantillon, le protocole LCM et l'extraction de l'ARN afin d'obtenir des ARN de haute qualité. Le protocole actuel a été optimisé en particulier pour le système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

Le rendement et l'intégrité de l'ARN sont décisifs pour l'analyse de l'ARN. Cependant, il est souvent techniquement difficile de maintenir l'intégrité de l'ARN tout au long de la procédure de microdissection de capture laser (LCM) entière. Étant donné que les études lCM fonctionnent avec de faibles quantités de matériel, les préoccupations au sujet des rendements limités de l'ARN sont également importantes. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os. L'effet du protocole de coloration, de l'épaisseur des cryosections, de la quantité microdissé de tissu, du kit d'extraction d'ARN, et du système de LCM employé sur le rendement et l'intégrité d'ARN obtenus des cellules d'os microdissés a été évalué. Des sections d'os congelées de huit m d'épaisseur ont été fabriquées à l'aide d'un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache lCL commerciale. L'échantillon a été pris en sandwich entre une membrane de polyéthylène téphtalate (PET) et le film adhésif. Un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons et une méthode d'extraction de l'ARN à base de colonnes ont été utilisés pour obtenir des ARN de haute qualité de rendement suffisant. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole lCM rapporté ici peut être employé pour étudier l'expression in situ de gène dans les cellules de n'importe quel tissu dur dans les conditions physiologiques et les processus de la maladie.

Un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os des fémurs de souris. Dans le protocole optimisé, des sections d'os congelées de 8 m d'épaisseur ont été coupées sur un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache commerciale de section gelée lUM. L'échantillon a été pris en sandwich entre la membrane PET et le film adhésif. Les cellules osseuses de souris ont été micro...

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A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Un protocole de microdissection de capture laser (LCM) a été développé pour obtenir une quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique dans les cellules osseuses. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole LCM rapporté ici peut être utilisé pour étudier l'expression des gènes dans les cellules de tout tissu dur.

Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Avez-vous déjà pensé à exploiter la puissance de la microdissection de capture laser pour l’analyse de l’expression des gènes dans des cellules osseuses spécifiques dans leur environnement naturel? Ici, nous décrivons un protocole qui vous permettra d’obtenir des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité à partir de cryosections d’os de souris. Cette technologie est un excellent outil pour examiner les changements dans l’expression des gènes dans des cellules osseuses spécifiques dans des modèles de souris génétiquement modifiés ou dans des modèles de maladies.Le protocole décrit ici est axé sur les os de souris, mais peut être utilisé pour étudier in situ une expression génétique dans les cellules de n’importe quel tissu dur chez n’importe quelle espèce. Christiane Schueler, technicienne de mon laboratoire, aidera à démontrer cette procédure. Après avoir euthanasié des souris par exsanguination sous anesthésie générale, enlevez rapidement les fémurs entiers.Utilisez un scalpel et des serviettes en papier pour nettoyer les fémurs des tissus mous environnants. Ensuite, versez le composé optimal de température de coupe dans le moule d’intégration et placez les fémurs dans le fond des moules d’intégration. Casser congeler les échantillons dans de l’azote liquide.Une fois que les échantillons sont entièrement congelés, enveloppez-les dans du papier d’aluminium et transférez-les sur de la glace sèche au congélateur. Conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur. Tout d’abord, réglez la température dans le cryostat à moins 19 degrés Celsius et la température du support du bloc à moins 17 degrés Celsius.Ensuite, essuyez l’intérieur du cryostat avec 70% d’éthanol. Placez la lame jetable pour les tissus durs, les glissières en verre, et un outil d’ajustement dans le cryostat pour refroidir, et gardez-les à l’intérieur du cryostat pour la durée de la section. Transférer le bloc de tissu congelé sur la glace sèche au cryostat et lui permettre d’équilibrer pendant au moins 10 minutes.Ensuite, appuyez sur le fond du moule d’intégration pour pousser le bloc OCT hors du moule. Appliquez suffisamment d’OCT moyen sur le support du bloc pour y adhérer et attendre que le milieu oct gèle complètement. Après cela, placez le support de bloc dans le support de l’objet et serrez-le en place.Ajustez la position de la lame et coupez le bloc en incréments de coupe de 15 micromètres pour enlever l’OCT couvrant l’échantillon. Ajustez le cryostat pour générer des sections de huit micromètres et coupez deux à trois cryosections qui seront jetées. Placez le film adhésif sur le bloc et utilisez l’outil de montage pour adhérer au film au bloc.Maintenant, faire une coupe lentement et à vitesse constante, tout en tenant la section par le film. Placez le film avec l’échantillon face vers le haut sur une lame de verre pré-refroidie sur le cryobar dans le cryostat pour éviter le dégel de l’échantillon. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le film à la glissière en verre pour faciliter la coloration.Dans une hotte de fumée, préparez les solutions nécessaires de l’éthanol, de l’eau sans RNase et du xylène sur glace, comme le décrit le protocole textuel. Incuber les sections à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes. Ensuite, trempez soigneusement les sections dans de l’eau sans RNase pendant 30 secondes pour enlever complètement l’OCT.Ensuite, distribuez 50 microlitres de tache commerciale de section congelée LCM sur la section et incubez à température ambiante pendant 10 secondes. Égoutter la section en plaçant le bord de la lame sur du papier de soie absorbant. Rincer la section à 100 % d’éthanol pendant 30 secondes pour éliminer tout excès de tache.Plonger les sections osseuses dans un deuxième tube contenant 100% d’éthanol pendant 30 secondes, puis les transférer à 100% xylène pendant 30 secondes. Mettez le film adhésif sur une glissière en verre sec comme support, en prenant soin de placer le film aussi plat que possible. Après cela, placez une glissière de trame de membrane de PET sur le film et appuyez brièvement un doigt ganté sur la membrane pour l’attacher au film.Cet échantillon sera pris en sandwich entre la membrane et le film adhésif. Le film adhésif ne doit pas être plié ou froissé et il ne doit pas y avoir de bulles d’air entre le film et la membrane. Commencez par utiliser le décontamination de surface pour nettoyer le support du bouchon d’extrémité de scène.Chargez la glissière dans le porte-glissière et les bouchons dans le support du bouchon. Ensuite, ajustez la mise au point et obtenez une vue d’ensemble de diapositives avec l’objectif 1.25x. Passer à l’objectif 40x et ajuster la mise au point.À l’aide de la vue d’ensemble de la diapositive, choisissez le domaine d’intérêt. Ensuite, ajustez les paramètres laser comme indiqué ici, en vous assurant d’optimiser ces paramètres pour chaque objectif. Si le laser ne coupe pas l’échantillon, augmenter la puissance laser.Choisissez des cellules ostéoblastes, ostéocites et os dans l’os fœmoral distal cancellous ou cortical basé sur des critères morphologiques. Tracez une ligne pour la trajectoire laser plus loin des cellules cibles afin de minimiser les dommages causés par le laser UV. Si le laser ne coupe pas l’échantillon, appliquez le laser plus d’une fois ou inspectez la cible pour décelé les taches de coupures incomplètes et utilisez l’option déplacer et couper pour couper le tissu à ces endroits.Recueillir chaque type de cellule dans un bouchon de tube séparé de 0,5 millilitre. Tout d’abord, distribuez 50 microlitres du tampon de lyse contenant du bêta mercaptoéthanol dans le bouchon du tube de collecte. Lyse l’échantillon en le pippetting de haut en bas dans le bouchon pendant une minute.Ensuite, faites tourner le lysate et ajoutez 00 microlitres du tampon de lyse contenant du bêta-mercaptoéthanol au tube. Pour chaque diapositive, préparez un tube de microcentrifugeuse étiqueté avec 350 microlitres du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol bêta. Utilisez les sections restantes après le LCM pour extraire l’ARN.Séparez soigneusement le film de la membrane et lysez l’échantillon en pippetting lentement le tampon de lyse sur la section plusieurs fois. Ensuite, placez les échantillons de lysate sur la glace sèche et rangez-les à moins 80 degrés Celsius. Lorsqu’ils sont prêts à continuer, décongeler les lysates à température ambiante.Après cela, transférez les lysates des cellules récoltées par LCM dans les tubes de collecte vers de nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et extrayez l’ARN selon les instructions du fabricant. Dans cette étude, un protocole LCM est développé pour obtenir une quantité suffisante d’ARN de haute qualité pour l’analyse de l’expression des gènes dans les cellules osseuses des fémurs de souris. LCM est effectué à l’aide d’un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d’échantillons.Le rendement et l’intégrité de l’ARN isolé ont été mesurés à l’aide de l’électrophoresis microcapllaire. La différence de qualité et de quantité d’ARN obtenue à l’aide de différents protocoles de lyse peut être vue ici dans le gel représentatif et les électrophéogrammes. Lorsque l’échantillon est lysé en pippetting de haut en bas dans le bouchon pendant une minute, il est possible d’isoler environ 8,5 nanogrammes d’ARN à partir d’un millimètre carré de tissu osseux microdissected.La valeur RIN est de 8,60. Alternativement, LCM est effectué à l’aide d’un système LCM qui utilise une impulsion laser déconcentré, qui catapulte le matériau dans le bouchon adhésif en surplomb. Pour les os congelés frais, il est possible d’isoler environ 1,6 nanogramme d’ARN d’un millimètre carré de tissu osseux microdissé.La valeur RIN en est une. En conclusion, les choses les plus importantes à retenir dans cette procédure sont d’appliquer le protocole permanent de la bonne manière, d’empêcher le séchage complet des sections dans le complexe sandwich, d’utiliser un système de MCL approprié et de ne pas dépasser les délais de récolte des cellules. Une fois que vous avez isolé l’ARN des cellules capturées, vous pouvez utiliser l’ARN pour le profilage d’expression, par exemple, par recherche d’ARN.Enfin, nous tenons à vous rappeler que le xylène et le bêta-mercaptoéthanol sont des substances dangereuses qui doivent être manipulées sous une hotte. En outre, s’il vous plaît prendre les précautions appropriées lors de la manipulation de l’azote liquide et aussi les lames cryotome.

Research

JoVE Journal

Biology

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