Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
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Die Autoren danken Ute Zeitz und Nikole Ginner für ihre hervorragende technische Hilfe sowie dem Vetcore- und Tierpfleger für die Unterstützung.

Knochengewebe von Mäusen wurde in strikter Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien für die Tierpflege verwendet und alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Tiere und Gefrierbett
<ol><li>Haustiere unter Bedingungen mit konstanter Raumtemperatur (RT; 24 °C) und einem 12 h hellen/12 h dunklen Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. ANMERKUNG: Knochengewebe wurden in dieser Studie von 3 Monate alten männlichen Wild-M...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

Sowohl die RNA-Qualität als auch die RNA-Menge können in allen Stadien der Probenvorbereitung negativ beeinflusst werden, wie z. B. Gewebemanipulation, LCM-Prozess und RNA-Extraktion. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die nachfolgende Genexpressionsanalyse zu erhalten.
Für LCM verwenden die meisten Laboratorien Abschnitte mit einer Dickevon 7bis 8 m 2 . Dickere Abschnitte würden es ermöglichen, mehr Material zu ernten....

Gewebe bestehen aus heterogenen und räumlich verteilten Zelltypen. Verschiedene Zelltypen in einem bestimmten Gewebe können unterschiedlich auf dasselbe Signal reagieren. Daher ist es wichtig, spezifische Zellpopulationen für die Beurteilung der Rolle verschiedener Zelltypen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Bedingungen zu isolieren. Lasercapture Microdissection (LCM) bietet eine relativ schnelle und präzise Methode zum Isolieren und Entfernen bestimmter Zellen aus komplexen Geweben1. LCM-Systeme nutzen die Kraft eines Laserstrahls, um die von Interesse interessierten Zellen von histologischen Gewebeabschnitten zu trennen, ohne dass eine enzymatische Verarbeitung oder kulturförderndes Wachstum erforderlich ist. Dies bedeutet, dass sich die Zellen in ihrem natürlichen Gewebelebensraum befinden und dass die Gewebearchitektur einschließlich der räumlichen Beziehung zwischen verschiedenen Zellen erhalten bleibt. Die Morphologie sowohl der eingefangenen Zellen als auch des Restgewebes ist gut erhalten, und mehrere Gewebekomponenten können sequenziell aus demselben Dia abgetastet werden. Isolierte Zellen können dann für die nachfolgende Analyse ihres RNA-, DNA-, Protein- oder Metabolitengehalts2,3verwendet werden.
Um die Genexpression in verschiedenen Zellpopulationen oder nach verschiedenen Behandlungen zu analysieren, ist es notwendig, mRNAs von ausreichender Qualität und Quantität für die nachfolgende Analyse zu erhalten4,5. Im Gegensatz zur DNA sind RNAs empfindlicher auf Fixierung und die Verwendung von gefrorenem Gewebe wird empfohlen, wenn das Ziel darin besteht, RNA zu untersuchen. Da mRNAs durch allgegenwärtige Ribonukleasen (RNase) schnell abgebaut werden, sind strenge RNase-freie Bedingungen bei der Probenhandhabung und -aufbereitung erforderlich und die Vermeidung der Lagerung von Proben bei Raumtemperatur. Darüber hinaus sind schnelle Techniken ohne verlängerte wässrige Phasenschritte entscheidend, um den RNA-Abbau zu verhindern6. Die RNA-Ausbeute und -Integrität kann auch durch den LCM-Prozess und das verwendete LCM-System7,8beeinflusst werden. Derzeit stehen vier LCM-Systeme mit unterschiedlichen Betriebsprinzipien zur Verfügung2. Die Methode der RNA-Extraktion kann ebenfalls wichtig sein, da verschiedene RNA-Isolationskits mit signifikanten Unterschieden in RNA-Menge und-Qualität7,8getestet wurden.
Jede Gewebevorbereitungsmethode erfordert, ein Gleichgewicht zwischen dem Erhalt eines guten morphologischen Kontrasts und der Aufrechterhaltung der RNA-Integrität für weitere Analysen zu finden. Zur Herstellung gefrorener Abschnitte aus Knochen wurde ein Klebefilm entwickelt und kontinuierlich verbessert9. Die Knochenabschnitte werden direkt auf der Klebefolie geschnitten und gebeizt. Dieser Klebefilm ist auf viele Arten von Färbung anwendbar und kann verwendet werden, um die Zellen von Interesse von Knochenkryosektionen mit LCM9,10,11,12,13, zu isolieren 14. Alle Schritte einschließlich der chirurgischen Entfernung, Einbettung, Gefrieren, Schneiden und Färben können innerhalb von weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Wichtig ist, dass Zellen wie Osteoblasten, Knochenfutterzellen und Osteoklasten eindeutig identifiziert werden können9,10,11,12,13,14. Diese Methode hat den Vorteil, schnell und einfach zu sein. Eine alternative Methode zur Erzeugung von Knochenkryosektionen ist die Verwendung des Bandübertragungssystems15. Letztere Technik ist jedoch zeitaufwändiger und erfordert zusätzliche Instrumentierung, da die Abschnitte durch ultraviolette (UV) Vernetzung vom Klebeband auf vorbeschichtete Membranschlitten übertragen werden müssen. Obwohl das Bandübertragungssystem erfolgreich mit LCM16,17,18,19gekoppelt wurde, ist zu beachten, dass die vernetzte Beschichtung ein Hintergrundmuster erzeugen kann, das kann die Zelltyp-Identifikation20stören.
Typischerweise werden nur geringe Mengen rna aus mikrosesektierten Zellen extrahiert, und RNA-Qualität und -Menge werden oft durch mikrokapillare Elektrophorese21bewertet. Ein Computerprogramm wird verwendet, um RNA-Extrakten, die als RNA-Integritätsnummer (RIN) bezeichnet werden, einen Qualitätsindex zuzuweisen. Ein RIN-Wert von 1,0 gibt vollständig abgebaute RNA an, während ein Wert von 10,0 darauf hindeutet, dass die RNA vollständig intakt ist22. In der Regel werden Indizes über 5 als ausreichend für RNA-Studien betrachtet. Genexpressionsmuster in Proben mit einem RIN-Wert von 5,0 bis 10,0 korrelieren den Angaben zufolge gut miteinander23. Obwohl die Sensitivität dieser Methode hoch ist, da nur 50 pg/l der gesamten RNA nachgewiesen werden können, kann es sehr schwierig sein, eine Qualitätsbewertung zu erhalten, wenn die RNA-Konzentration in der Probe sehr gering ist. Um die RNA-Qualität zu beurteilen, wird daher der nach dem LCM verbleibende Gewebeabschnitt häufig zur Extraktion von RNA verwendet, indem der Puffer auf denDia24pipetiert wird.
Obwohl LCM ausgiebig auf verschiedenen gefrorenen Geweben verwendet wurde, werden RIN-Werte von extrahierten RNAs selten berichtet. Darüber hinaus gibt es keine vergleichenden Studien, um die am besten geeignete Methode zur Untersuchung von RNA in Mausknochen zu klären. In der vorliegenden Studie wurden gefrorene Abschnitte von erwachsenen Mausfemuren verwendet, um die Probenvorbereitung, das LCM-Protokoll und die RNA-Extraktion zu optimieren, um qualitativ hochwertige RNAs zu erhalten. Das vorliegende Protokoll wurde speziell für das LCM-System optimiert, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA-Ausbeute und -Integrität sind entscheidend für die RNA-Analyse. Es ist jedoch oft technisch schwierig, die RNA-Integrität während des gesamten Lasercapture Microdissection (LCM)-Verfahrens aufrechtzuerhalten. Da LCM-Studien mit geringen Materialmengen arbeiten, sind auch Bedenken hinsichtlich begrenzter RNA-Ausbeute nera wichtig. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die Wirkung von Färbeprotokoll, Dicke von Kryosektionen, mikrosezierte Gewebemenge, RNA-Extraktionskit und LCM-System, das auf die RNA-Ausbeute und Integrität von mikrosezierten Knochenzellen verwendet wird, wurde bewertet. Acht Meter dicke gefrorene Knochenabschnitte wurden mit einem Klebefilm hergestellt und mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Fleck gebeizt. Die Probe wurde zwischen einer Polyethylenterephthalatmembran (PET) und der Klebefolie eingeklemmt. Ein LCM-System, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet, und eine säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode wurden verwendet, um qualitativ hochwertige RNAs mit ausreichender Ausbeute zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die In-situ-Genexpression in Zellen von hartgeweben sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Krankheitsprozessen zu untersuchen.

Ein LCM-Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen von Mausfemuren zu erhalten. Im optimierten Protokoll wurden 8 m dicke gefrorene Knochenabschnitte auf einer Klebefolie geschnitten und mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Tiefschnittfleck gebeizt. Die Probe wurde zwischen der PET-Membran und der Klebefolie eingeklemmt. Mausknochenzellen wurden mit einem LCM-System mikroseziert, das die Schwerkraft für die Probenentnah...

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A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Ein Lasercapture Microdissection (LCM) Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die Genexpression in Zellen von hartgeweben zu untersuchen.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Haben Sie schon einmal darüber nachgedacht, die Kraft der Laser-Capture-Mikrodissektion für die Analyse der Genexpression in bestimmten Knochenzellen in ihrer natürlichen Umgebung zu nutzen? Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Sie ausreichende Mengen an hochwertiger RNA aus Kryosektionen von Mausknochen erhalten können. Diese Technologie ist ein großartiges Werkzeug, um Veränderungen in der Genexpression in bestimmten Knochenzellen in gentechnisch veränderten Mausmodellen oder in Krankheitsmodellen zu untersuchen.Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf Mausknochen, kann aber verwendet werden, um in situ eine Genexpression in Zellen von jedem Hartgewebe jeder Spezies zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hilft Christiane Schueler, eine Technikerin aus meinem Labor. Nach der Einschläferne Mäuse durch Exsanguination unter Vollnarkose, entfernen Sie ganze Oberschenkelknochen schnell.Verwenden Sie ein Skalpell und Papiertücher, um die Oberschenkelknochen der umgebenden Weichgewebe zu reinigen. Als nächstes gießen Sie die optimale Schnitttemperaturverbindung in die Einbettform und legen Sie die Oberschenkelknochen in den Boden der Einbettformen. Fangen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.Sobald die Proben vollständig eingefroren sind, wickeln Sie sie in Folie und übertragen Sie sie auf Trockeneis in einen Gefrierschrank. Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit sind. Stellen Sie zunächst die Temperatur im Kryostat auf minus 19 Grad Celsius und die Temperatur des Blockhalters auf minus 17 Grad Celsius ein.Als nächstes wischen Sie das Innere des Kryostats mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Einwegklinge für hartes Gewebe, die Glasgletten und ein passendes Werkzeug in den Kryostat, um sie abzukühlen, und halten Sie sie für die Dauer des Schnitts im Kryostat. Den gefrorenen Gewebeblock auf Trockeneis in den Kryostat geben und mindestens 10 Minuten ausgrenzen lassen.Drücken Sie dann den Boden der Einbettform, um den OCT-Block aus der Form zu schieben. Tragen Sie genügend OCT-Medium auf den Blockhalter auf, um den Block daran zu kleben und zu warten, bis das OCT-Medium vollständig einfriert. Danach den Blockhalter in den Objekthalter legen und festanlegen.Passen Sie die Klingenposition an und trimmen Sie den Block in 15-Mikrometer-Schnittschritten, um das OCT zu entfernen, das die Probe bedeckt. Stellen Sie den Kryostat so ein, dass acht Mikrometerabschnitte erzeugt werden, und schneiden Sie zwei bis drei Kryosektionen, die verworfen werden. Legen Sie Klebefolie auf den Block und verwenden Sie das Montagewerkzeug, um die Folie am Block zu befestigung.Machen Sie nun einen Schnitt langsam und mit konstanter Geschwindigkeit, während Sie den Abschnitt durch den Film halten. Platzieren Sie den Film mit der Probe nach oben auf einer vorgekühlten Glasrutsche auf der Kryobar innerhalb des Kryostats, um ein Auftauen der Probe zu vermeiden. Verwenden Sie Klebeband, um den Film an der Glasfolie zu befestigen, um die Färbung zu erleichtern.In einer Dunstabzugshaube können Sie die notwendigen Lösungen für Ethanol, RNase-freies Wasser und Xylol auf Eis vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Abschnitte in 95% Ethanol für 30 Sekunden. Dann tauchen Sie die Abschnitte vorsichtig in RNase-freies Wasser für 30 Sekunden, um das OCT vollständig zu entfernen.Als nächstes geben Sie 50 Mikroliter kommerziellen LCM gefrorenen Abschnitt Fleck auf den Abschnitt und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Sekunden. Entleeren Sie den Abschnitt, indem Sie den Rand des Schlittens auf saugfähiges Gewebepapier legen. Spülen Sie den Abschnitt in 100%Ethanol für 30 Sekunden, um überschüssige Flecken zu entfernen.Tauchen Sie die Knochenabschnitte 30 Sekunden lang in ein zweites Rohr ein, das 100% Ethanol enthält, und übertragen Sie sie dann 30 Sekunden lang auf 100%Xylol. Als Stütze Klebefolie auf eine trockene Glasrutsche legen und darauf achten, die Folie so flach wie möglich zu platzieren. Legen Sie anschließend eine PET-Membranrahmenfolie auf die Folie und drücken Sie kurz einen Handfinger auf die Membran, um sie an der Folie zu befestigen.Diese Probe wird zwischen der Membran und der Klebefolie eingeklemmt. Die Klebefolie sollte nicht gefaltet oder faltig sein und es sollte keine Luftblasen zwischen der Folie und der Membran geben. Beginnen Sie mit Oberflächendekontamination, um den Bühnenendkappenhalter zu reinigen.Legen Sie den Schlitten in den Schiebehalter und die Kappen in den Kappenhalter. Passen Sie als Nächstes den Fokus an und erhalten Sie eine Folienübersicht mit dem 1,25-fachen Ziel. Wechseln Sie zum 40x-Objektiv und passen Sie den Fokus an.Wählen Sie in der Folienübersicht den Interessenbereich aus. Passen Sie dann die Laserparameter wie hier gezeigt an, um sicherzustellen, dass diese Parameter für jedes Objektiv optimiert werden. Wenn der Laser die Probe nicht schneidet, erhöhen Sie die Laserleistung.Wählen Sie Osteoblasten, Osteoziten und Knochenfutterzellen in distalen femoralen Cancellous oder kortikalen Knochen auf der Grundlage morphologischer Kriterien. Zeichnen Sie eine Linie für den Laserpfad weiter weg von den Zielzellen, um die Schäden durch den UV-Laser zu minimieren. Wenn der Laser die Probe nicht schneidet, wenden Sie den Laser mehr als einmal an oder überprüfen Sie das Ziel auf Flecken unvollständiger Schnitte und verwenden Sie die Option "Bewegen und Schneiden", um das Gewebe an diesen Stellen zu schneiden.Sammeln Sie jeden Zelltyp in einer separaten 0,5-Milliliter-Rohrkappe. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter des Lysepuffers, der Beta-Mercaptoethanol enthält, in die Kappe des Sammelrohrs. Lyse die Probe, indem Sie es nach oben und unten in der Kappe für eine Minute.Als nächstes drehen Sie das Lysat herunter und fügen 00 Mikroliter des Lysepuffers, der Beta-Mercaptoethanol enthält, in die Röhre ein. Für jeden Schlitten ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr mit 350 Mikrolitern des Lysepuffers mit Beta-Mercaptoethanol vorbereiten. Verwenden Sie die nach dem LCM verbleibenden Abschnitte, um RNA zu extrahieren.Trennen Sie den Film vorsichtig von der Membran und lysieren Sie die Probe, indem Sie den Lysepuffer mehrmals langsam auf den Abschnitt pfeifen. Dann die Lysatproben auf Trockeneis legen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Lysate bei Raumtemperatur auf.Danach übertragen Sie die Lysate aus LCM-geernteten Zellen in den Sammelröhrchen auf neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren und extrahieren RNA nach herstellerspezifischen Anweisungen. In dieser Studie wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen von Mausfemuren zu erhalten. LCM wird mit einem LCM-System durchgeführt, das die Schwerkraft für die Probensammlung verwendet.Die Ausbeute und Integrität isolierter RNA wurde mit mikrokapillarer Elektrophorese gemessen. Der Unterschied in der RNA-Qualität und -Menge, der mit verschiedenen Lyseprotokollen gewonnen wird, ist hier in den repräsentativen Gel- und Elektropherogrammen zu sehen. Wenn die Probe durch Pippetting in der Kappe für eine Minute nach oben und unten lysiert wird, ist es möglich, etwa 8,5 Nanogramm RNA von einem Quadratmillimeter mikroseziertem Knochengewebe zu isolieren.Der RIN-Wert ist 8,60. Alternativ wird LCM mit einem LCM-System durchgeführt, das einen defokussierten Laserpuls verwendet, der das Material in die überhängende Klebekappe katapultiert. Bei frischen gefrorenen Knochen ist es möglich, etwa 1,6 Nanogramm RNA aus einem Quadratmillimeter mikroseziertem Knochengewebe zu isolieren.Der RIN-Wert ist eins. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wichtigsten Dinge, die in diesem Verfahren zu beachten sind, das standende Protokoll in der richtigen Weise anwenden, das vollständige Austrocknen von Abschnitten im Sandwichkomplex verhindern, ein geeignetes LCM-System verwenden und die Fristen für die Ernte der Zellen nicht überschreiten. Sobald Sie RNA aus den erfassten Zellen isoliert haben, können Sie die RNA zum Expressionsprofiling verwenden, z. B. durch RNA seek.Abschließend möchten wir Sie daran erinnern, dass Xylol und Beta-Mercaptoethanol gefährliche Stoffe sind, die unter einer Haube behandelt werden müssen. Darüber hinaus treffen Sie bitte geeignete Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und auch den Kryotomklingen.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

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Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Forschung

Biologie

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Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

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Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

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