Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

המחברים מודים ליוץ ' ולניקוללה גיסנר על העזרה הטכנית המצוינת שלהם, כמו גם על הצוות האחראי על הטיפול בבעלי חיים.

רקמת העצם מעכברים שימש בהתאמה קפדנית עם הנחיות השוררים לטיפול בעלי חיים וכל המאמצים נעשו כדי למזער סבל בעלי חיים.
1. בעלי חיים והקפאת הטבעה
<ol><li>חיות הבית בתנאים של טמפרטורת החדר קבוע (RT; 24 ° c) ו 12 h אור/12 h מחזור כהה עם גישה חופשית למזון ולמים. הערה: רקמות העצם במחקר ז...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

הן איכות וכמות RNA יכול להיות מושפע באופן שלילי בכל שלבי ההכנה לדוגמה כגון מניפולציה רקמות, תהליך LCM, ו-RNA חילוץ. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנטי הבאים.
עבור lcm, רוב המעבדות משתמשות בסעיפים 7 עד 8 יקרומטר עבה2. חלקים עבים יות...

הרקמות מורכבת מסוגי תאים הטרוגנית ומבוזרים. סוגי תאים שונים ברקמה נתונה עלולים להגיב בצורה שונה לאותו אות. לכן, חיוני להיות מסוגל לבודד אוכלוסיות תאים מסוימות להערכת התפקיד של סוגי תאים שונים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. לכידת הלייזר (LCM) מציעה שיטה מהירה ומדויקת יחסית לבידוד והסרה של תאים שצוינו מרקמות מורכבות1. מערכות LCM להשתמש בכוחה של קרן לייזר כדי להפריד את התאים המעניינים סעיפים רקמות היסטולוגית ללא צורך בעיבוד אנזימטי או צמיחה בתרבות. משמעות הדבר היא כי התאים נמצאים בבית הגידול הטבעי שלהם רקמות, וכי ארכיטקטורת רקמות כולל הקשר המרחבי בין תאים שונים נשמרת. מורפולוגיה של שני התאים השבויים והרקמה השיורית נשמרת היטב, וניתן לדגום מספר רכיבי רקמה ברצף מאותה שקופית. תאים מבודדים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח עוקבות של RNA שלהם, DNA, חלבון או תוכן מטבוליט2,3.
כדי לנתח את הביטוי הגנטי באוכלוסיות תאים שונות, או לאחר טיפולים שונים, יש צורך להשיג mrnas של איכות וכמות מספקת עבור ניתוח הבא4,5. בניגוד ל-DNA, RNAs רגישים יותר קיבעון ואת השימוש ברקמה קפואה מומלץ כאשר המטרה היא ללמוד RNA. מאז mRNAs מושפל במהירות על ידי ribonucleases בכל מקום (RNase), מחמירים RNase-חינם תנאים במהלך טיפול הדגימה הכנה והימנעות אחסון של דגימות בטמפרטורת החדר נדרשים. בנוסף, טכניקות מהירות ללא כל שלבי מימית שלב ממושך הם חיוניים כדי למנוע השפלה RNA6. תשואה RNA ויושרה יכול להיות גם מושפע התהליך lcm ומערכת lcm בשימוש7,8. כיום, ארבעה מערכות LCM עם עקרונות הפעלה שונים זמינים2. השיטה של שאיבת rna יכול להיות גם חשוב, מאז ערכות בידוד rna שונים נבדקו עם הבדלים משמעותיים כמות rna ואיכות7,8.
כל שיטת הכנת רקמות דורש מציאת איזון בין קבלת ניגודיות מורפולוגית טובה ושמירה על שלמות RNA עבור ניתוחים נוספים. עבור הכנת חלקים קפואים מעצם, סרט דביק פותחה והשתפר ברציפות9. חתכי העצם חתוכים ומוכתמים ישירות על גבי הסרט הדביק. סרט דביק זה חל על סוגים רבים של כתמים, והוא יכול להיות מועסק כדי לבודד את התאים של העניין מ העצם קריודורים באמצעות lcm9,10,11,12,13, . ארבע עשרה כל השלבים כולל הסרת כירורגי, הטבעה, הקפאה, גזירה וכתמים ניתן להשלים תוך פחות משעה. חשוב מכך, תאים כגון אוסטאופתיים, תאים בטנה עצם, ו osteoclasts ניתן לזהות בבירור9,10,11,12,13,14. לשיטה זו יש את היתרון של היותו מהיר ופשוט. שיטה חלופית ליצירת מקטעי קריובון היא להשתמש במערכת העברת הקלטות15. עם זאת, הטכניקה האחרונה היא גוזלת זמן רב יותר ודורש מכשור נוסף, שכן הסעיפים צריכים להיות מועברים מסרט דביק על שקופיות קרום מצופה מראש על ידי אולטרה סגול (UV) הקישור החוצה. למרות שמערכת העברת הקלטות בוצעה בהצלחה בשילוב עם lcm16,17,18,19, יש לציין שציפוי המקושרות מקושרת יכול ליצור תבנית רקע ש יכול להתערב בזיהוי סוג תא20.
בדרך כלל, רק כמויות קטנות של RNA מופקים מתאי מיקרו, ו-RNA איכות וכמות מוערך לעתים קרובות על ידי אלקטרופורזה מיקרו-נימי21. תוכנית מחשב משמשת להקצאת אינדקס איכות לתמציות RNA שנקרא מספר שלמות RNA (RIN). ערך RIN של 1.0 מציין RNA מושפל לחלוטין, ואילו ערך של 10.0 עולה כי ה-RNA הוא שלם במלואו22. בדרך כלל, אינדקסים מעל 5 נחשבים מספיקים ללימודי RNA. ביטוי גנטי דפוסי בדגימות עם ערך RIN של 5.0-10.0 דווחו לתאם היטב אחד את השני23. למרות הרגישות של שיטה זו היא גבוהה, מאז מעט כמו 50 pg/μL של RNA סה כ ניתן לזהות, זה יכול להיות קשה מאוד להשיג הערכה איכות אם ריכוז RNA במדגם הוא נמוך מאוד. לכן, כדי להעריך את איכות ה-RNA, סעיף הרקמה שנותר לאחר LCM משמש לעתים קרובות כדי לחלץ RNA, על ידי מאגר מלטף על השקופית24.
למרות LCM נעשה שימוש נרחב על רקמות קפואות שונות, ערכי רין של RNAs מחולץ מדווחים לעתים נדירות. יתר על כן, אין מחקרים השוואתיים כדי להבהיר את השיטה המתאימה ביותר כדי ללמוד RNA בעצמות העכבר. במחקר הנוכחי, קטעים קפואים מתוך העכבר למבוגרים הורים שימשו כדי לייעל את ההכנה לדוגמה, פרוטוקול LCM ו-RNA חילוץ על מנת להשיג RNAs באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי היה אופטימיזציה במיוחד עבור מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף המדגם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

התשואה והיושרה של RNA הם המכריע עבור ניתוח RNA. עם זאת, היא לעתים קרובות מאתגרת לשמור על שלמות RNA לאורך כל לכידת הלייזר (LCM) ההליך. מאז מחקרים LCM עבודה עם כמויות נמוכות של חומר, חששות בנוגע לתשואות RNA מוגבל הם גם חשובים. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. ההשפעה של הפרוטוקול כתמים, עובי של קריודורים, כמות רקמת מיקרו, הוצאת RNA ערכת, ו LCM מערכת בשימוש על התשואה RNA ויושרה המתקבל מתאי עצם מיקרוגזור הוערך. שמונה-μm-עבה מפרקי עצם קפואים נעשו באמצעות סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי. המדגם היה דחוקה בין קרום פוליאתילן terאפרון (PET) ממברנה הסרט דבק. מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף דגימות ושיטת החילוץ של RNA המבוסס על עמודה שימשו כדי להשיג RNAs באיכות גבוהה של תשואה מספקת. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים באתרו בתאים של כל רקמה קשה הן בתנאים פיסיולוגיים ותהליכי המחלה.

פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם של העכבר femurs. בפרוטוקול אופטימיזציה, 8 μm-עבה מקטעים עצם קפואים נחתכו על סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי קפוא המקטע. הדגימה הייתה דחוקה בין קרום חיית המחמד לבין הסרט הדביק. תאי עצם ה?...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

האם אי פעם חשבת על רתימת הכוח של מיקרודיסקציה לכידת לייזר לניתוח של ביטוי גנים בתאי עצם ספציפיים בתוך הסביבה הטבעית שלהם? כאן, אנו מתארים פרוטוקול שיאפשר לך להשיג כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה מ cryosections של עצמות העכבר. טכנולוגיה זו היא כלי נהדר לבחינת שינויים בביטוי גנים בתאי עצם ספציפיים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית או במודלים של מחלות.הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בעצמות עכבר, אך ניתן להשתמש בו כדי לחקור באתרו ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה בכל מין. אם נעזור להדגים את ההליך הזה, תהיה כריסטיאן שולר, טכנאית מהמעבדה שלי. לאחר המתת חום עכברים על ידי exsanguination תחת הרדמה כללית, להסיר עצם הירך שלם במהירות.השתמש אזמל ומגבות נייר כדי לנקות את עצם הירך של הרקמות הרכות שמסביב. לאחר מכן, יוצקים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לתוך התבנית המטביעה וממקמים את עצם הירך בתחתית תבניות ההטבעה. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי.לאחר הדגימות קפואות לחלוטין, לעטוף אותם בנייר כסף ולהעביר אותם על קרח יבש למקפיא. לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לעיבוד נוסף. ראשית, הגדר את הטמפרטורה בהקפאט למינוס 19 מעלות צלזיוס ואת הטמפרטורה של מחזיק הבלוק למינוס 17 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לנגב את הפנים של קריוסטט עם 70% אתנול. מניחים את הלהב החד פעמי עבור רקמות קשות, שקופיות זכוכית, כלי הולם לתוך cryostat להתקרר, ולשמור אותם בתוך cryostat למשך החיתוך. מעבירים את בלוק הרקמה הקפואה על קרח יבש להקפאה ומאפשרים לו לצייד לפחות 10 דקות.לאחר מכן, לחץ על החלק התחתון של התבנית הטבעה לדחוף את בלוק OCT מתוך התבנית. החל מספיק מדיום OCT על מחזיק הבלוק כדי לדבוק בלוק אליו ולחכות עד המדיום OCT קופא לחלוטין. לאחר מכן, מקם את מחזיק הבלוק במחזיק האובייקט והדק אותו במקומו.כוונן את מיקום הלהב וחתוך את הבלוק במרווחי חיתוך של 15 מיקרומטר כדי להסיר את ה- OCT המכסה את הדגימה. התאימו את ההקפאה כדי ליצור מקטעים של שמונה מיקרומטר וחותכים שניים עד שלושה קריוסטאטים שיזרקו. מניחים סרט דבק על הבלוק ולהשתמש בכלי ההתאמה כדי לדבוק בסרט לבלוק.עכשיו, לעשות חתך לאט ובהירות מתמדת, תוך החזקת הקטע על ידי הסרט. מניחים את הסרט עם המדגם פונה כלפי מעלה על מגלשת זכוכית מקוררת מראש על ההקפאה בתוך cryostat, כדי למנוע הפשרה של המדגם. השתמש בקלטת כדי לתקן את הסרט לשקופית הזכוכית עבור ויטראז'ים קלים יותר.במכסה המנוע של האדים, הכינו את הפתרונות הדרושים לאתנול, מים נטולי RNase וקצילן על קרח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה את החלקים ב95% אתנול במשך 30 שניות. לאחר מכן, בזהירות לטבול את החלקים במים ללא RNase במשך 30 שניות כדי להסיר לחלוטין את OCT.לאחר מכן, מחלקים 50 מיקרוליטרים של כתם קטע קפוא LCM מסחרי על החלק ודורגים בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות. רוקן את המקטע על-ידי הנחת קצה השקופית על נייר טישו סופג. לשטוף את החלק ב 100%אתנול במשך 30 שניות כדי להסיר כל כתם עודף.לטבול את חלקי העצם בצינור השני המכיל 100% אתנול במשך 30 שניות ולאחר מכן, להעביר אותם 100% קסילן במשך 30 שניות. שים סרט דבק על מגלשת זכוכית יבשה כתמיכה, דואג למקם את הסרט שטוח ככל האפשר. לאחר מכן, מקם שקופית מסגרת קרום PET על הסרט ולחץ בקצרה על אצבע כפפה על הממברנה כדי לחבר אותו לסרט.מדגם זה יהיה דחוק בין הממברנה לסרט דבק. הסרט דבק לא צריך להיות מקופל או מקומט ולא צריך להיות בועות אוויר בין הסרט לבין הממברנה. התחל באמצעות מזהה משטח כדי לנקות את מחזיק מכסה קצה הבמה.טען את השקופית למחזיק השקופית ואת הכובעים למחזיק הכובע. לאחר מכן, התאם את המוקד ורכוש סקירת שקופית עם המטרה 1.25x. שנה למטרה 40x והתאם את המוקד.באמצעות סקירת השקופית, בחר את אזור העניין. לאחר מכן, להתאים את הפרמטרים לייזר כפי שמוצג כאן, הקפד לייעל פרמטרים אלה עבור כל מטרה. אם הלייזר לא מצליח לחתוך את הדגימה, להגדיל את כוח הלייזר.בחר אוסטאובלסט, אוסטאוסיטים ותאי בטנת עצם בעצם הירך הדיסטלית או בקליפת המוח בהתבסס על קריטריונים מורפולוגיים. צייר קו לנתיב הלייזר רחוק יותר מתאים היעד כדי למזער את הנזק על ידי לייזר UV. אם הלייזר אינו מצליח לחתוך את המדגם, להחיל את הלייזר יותר מפעם אחת או לבדוק את היעד עבור כתמים של חתכים שלמים ולהשתמש בתנועה לחתוך אפשרות לחתוך את הרקמה כתמים אלה.לאסוף כל סוג תא בכובע צינור נפרד 0.5 מיליליטר. ראשית, מחלקים 50 מיקרוליטרים של מאגר התיזה המכיל בטא mercaptoethanol לתוך הכובע של צינור האיסוף. Lyse המדגם על ידי pippetting אותו למעלה ולמטה בכובע במשך דקה אחת.לאחר מכן, לסובב את lysate ולהוסיף 00 microliters של מאגר תיזה המכיל בטא-mercaptoethanol לצינור. עבור כל שקופית, להכין צינור microcentrifuge שכותרתו עם 350 microliters של מאגר תמוגה המכילה-בטא mercaptoethanol. השתמש במקטעים שנותרו לאחר LCM כדי לחלץ RNA.בזהירות להפריד את הסרט מן הממברנה lyse המדגם על ידי לאט pippetting מאגר תיזה על החלק מספר פעמים. לאחר מכן, לשים את דגימות ליזית על קרח יבש ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את lysates בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להעביר את lysates מתאים שנקטפו LCM בצינורות האוסף חדש 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולחלץ RNA על פי הוראות היצרן. במחקר זה, פרוטוקול LCM מפותח כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה לניתוח ביטוי גנים בתאי העצם של עצם הירך. LCM מבוצעת באמצעות מערכת LCM המשתמשת בכבידה לאיסוף מדגם.התשואה והשלימות של רנ"א מבודד נמדדו באמצעות אלקטרופורזה מיקרו-קפילרית. ההבדל באיכות RNA ובכמות שהושגו באמצעות פרוטוקולי תזה שונים ניתן לראות כאן בג'ל מייצג אלקטרופרוגרמות. כאשר המדגם הוא lysed על ידי pippetting למעלה ולמטה בכובע במשך דקה אחת, ניתן לבודד כ 8.5 ננוגרם של RNA ממילימטר מרובע אחד של רקמת עצם microdissected.ערך RIN הוא 8.60. לחלופין, LCM מבוצעת באמצעות מערכת LCM המשתמשת בדופק לייזר מנומר, אשר מקפיץ את החומר לתוך מכסה דבק overhanging. עבור עצמות קפואות טריות, ניתן לבודד כ 1.6 ננוגרם של RNA ממילימטר מרובע אחד של רקמת עצם microdissected.הערך RIN הוא אחד. לסיכום, הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בהליך זה הם ליישם את פרוטוקול העמידה בצורה הנכונה, למנוע ייבוש מלא של חלקים במתחם הכריך, להשתמש במערכת LCM מתאימה, ולא לחרוג ממגבלות הזמן לקצירת התאים. לאחר שבודדת את ה- RNA מהתאים שנלכדו, באפשרותך להשתמש ב- RNA עבור יצירת פרופילי ביטויים, לדוגמה, על-ידי RNA seek.לבסוף, ברצוננו להזכיר לך כי קסילן ובטא-mercaptoethanol הם חומרים מסוכנים כי צריך להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע. בנוסף, יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים בעת טיפול בחנקן נוזלי וגם בלהבי הקריוטום.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

כלי אינטרנט לאיכות יצירה גבוהה מסלולים ביולוגיים מכונית קריאות

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...