Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
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著者らは、彼らの優れた技術的な助けだけでなく、彼らのサポートのためのVetcoreと動物ケアスタッフのためのUte ZeitzとニコルGinnerに感謝します。

マウスの骨組織は、動物のケアのための一般的なガイドラインに厳密に従って使用され、動物の苦しみを最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 動物と凍結埋め込み
<ol><li>一定の室温(RT;24°C)および食糧および水への自由なアクセスが付いている12時間の光/12 h暗い周期の条件の家の動物。 注:本研究における骨組織は、生後3ヶ月の雄野生?...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

RNAの質および量は両方とも、組織操作、LCMプロセス、RNA抽出などのサンプル調製のすべての段階で負の影響を受ける可能性があります。そこで、その後の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。
LCMの場合、ほとんどの実験室ではセクション7−8 μm厚さ2を使用しています。より厚いセクションは、より多くの材料を収穫する?...

組織は、異種および空間的に分散した細胞タイプで構成されています。特定の組織内の異なる細胞タイプは、同じシグナルに異なる反応を示す場合があります。したがって、生理学的および病理学的条件の両方における異なる細胞型の役割の評価のために特定の細胞集団を単離できることが不可欠である。レーザー捕捉微分解子(LCM)は、複雑な組織1から指定された細胞を分離および除去するための比較的迅速かつ正確な方法を提供する。LCMシステムは、レーザービームの力を使用して、酵素処理や培養中の増殖を必要とせずに組織組織切片から目的の細胞を分離します。これは、細胞が自然組織の生息地にあり、異なる細胞間の空間的関係を含む組織構造が保持されていることを意味します。捕捉された細胞と残留組織の両方の形態はよく保存され、複数の組織成分を同じスライドから順次サンプリングすることができます。単離された細胞は、その後、そのRNA、DNA、タンパク質または代謝産物含有量2、3のその後の分析に使用することができる。
異なる細胞集団における遺伝子発現を分析するためには、または異なる処置後に、その後の分析4、5に対して十分な品質および量のmRNAを得る必要がある。DNAとは対照的に、RNAは固定に敏感であり、目的がRNAを研究する場合は凍結組織の使用が推奨されます。mRNAはユビキタスリボヌクレアーゼ(RNase)によって急速に分解されるので、試料の取り扱いや調製時の厳格なRNaseフリー条件と室温でのサンプルの保管を回避する必要があります。さらに、長期の水相段階を伴わずに迅速な技術は、RNAの劣化を防ぐために重要である6.RNAの歩留まりと完全性は、LCMプロセスおよび使用されるLCMシステム7、8の影響を受ける可能性もある。現在、動作原理が異なる4つのLCMシステムが利用可能です2.RNA抽出の方法は、異なるRNA単離キットがRNA量および品質7、8の有意な差で試験されているので、重要である場合もある。
任意の組織調製方法は、良好な形態コントラストを得ることと、さらなる分析のためにRNAの完全性を維持することとの間のバランスを見つける必要があります。骨から凍結切片を作製するために、粘着フィルムを開発し、継続的に改善した9.骨のセクションは、粘着フィルム上で直接切断され、染色されます。この粘着フィルムは、多くのタイプの染色に適用可能であり、LCM9、10、11、12、13を使用して骨凍結切除から目的の細胞を分離するために使用することができる、 14.外科的除去、埋め込み、凍結、切断および染色を含むすべてのステップは1時間以内に完了することができる。重要なことに、破骨細胞、骨内層細胞、および破骨細胞などの細胞は、9、10、11、12、13、14を明確に同定することができる。この方法は、迅速かつ簡単であるという利点があります。骨凍結切片を生成するための別の方法は、テープ転送システム15を使用することです。しかし、後者の技術は、より時間がかかり、セクションは、紫外線(UV)架橋によって前コーティングされた膜スライドに粘着テープから転送する必要があるため、追加の器械使用を必要とします。テープ転送システムはLCM16、17、18、19と正常に結合されていますが、架橋コーティングは背景パターンを作成できることに留意すべきです。細胞型識別20を妨害する可能性があります。
典型的には、微小解剖細胞から少量のRNAのみが抽出され、RNAの質および量は、しばしばマイクロキャピラリー電気泳動21によって評価される。コンピュータプログラムは、RNA整合性番号(RIN)と呼ばれるRNA抽出物に品質のインデックスを割り当てるために使用されます。RIN 値 1.0 は完全に分解された RNA を示し、10.0 の値は RNA が完全に22であることを示します。通常、5を超えるインデックスはRNA研究に十分と考えられています。RIN値が5.0−10.0のサンプルにおける遺伝子発現パターンは、互いに23とよく相関することが報告されている。この方法の感度は高いが、総RNAの50pg/μLが検出できるため、試料中のRNA濃度が非常に低い場合に品質評価を得ることは非常に困難である。したがって、RNA品質を評価するために、LCM後に残存する組織部は、多くの場合、スライド24上にバッファをピペッティングすることによってRNAを抽出するために使用される。
LCMは異なる凍結組織に広く使用されていますが、抽出されたRNAのRIN値が報告されることはほとんどありません。さらに、マウスの骨中のRNAを研究するための最も適切な方法を明らかにする比較研究はありません。本研究では、成虫マウス大腿骨からの凍結切片を用いて、高品質のRNAを得るためにサンプル調製、LCMプロトコルおよびRNA抽出を最適化した。本プロトコルは、特にサンプル収集に重力を使用するLCMシステム用に最適化された。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNAの収率と完全性は、RNA分析の決定的な方法です。しかし、多くの場合、レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LCM)手順全体を通じてRNAの完全性を維持することは技術的に困難です。LCM研究は少量の材料で動作するため、限られたRNA収率に関する懸念も重要です。そこで、骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発しました。染色プロトコルの効果は、凍結切片の厚さ、微分解組織量、RNA抽出キット、および微小解剖骨細胞から得られるRNA収率および完全性に用いられるLCM系を評価した。8μm厚の凍結骨切片を粘着フィルムを用いて作製し、市販のLCM染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をポリエチレンテレフタレート(PET)膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。サンプル採取に重力を用いたLCMシステムとカラムベースのRNA抽出法を用いて、十分な収率の高品質RNAを得た。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、生理学的条件および疾患プロセスの両方における任意の硬質組織の細胞におけるその状態遺伝子発現における研究に用いることができる。

マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。最適化されたプロトコルでは、8 μm厚の凍結骨切片を粘着フィルム上で切断し、市販のLCM凍結部染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をPET膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。マウス骨細胞は、サンプル採取に重力を用いたLCMシステムを用いて微小分解剖した?...

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A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

自然環境内の特定の骨細胞の遺伝子発現解析にレーザー捕捉マイクロ解剖の力を利用することを考えたことがありますか?ここでは、マウスの骨のクライオセクションから十分な量の高品質RNAを得ることができるプロトコルについて説明します。この技術は、遺伝子組み換えマウスモデルや疾患モデルにおける特定の骨細胞における遺伝子発現の変化を調べる素晴らしいツールです。ここで説明するプロトコルは、マウスの骨に焦点を当てていますが、任意の種の任意の硬い組織の細胞における遺伝子発現をその際に研究するために使用することができます。この手順を実証するのに役立ちます, クリスチャンシューラー, 私の研究室からの技術者になります.全身麻酔下でマウスを排泄してマウスを安楽死させた後、大腿骨全体を迅速に除去する。周囲の軟組織の大腿骨をきれいにするためにメスとペーパータオルを使用してください。次に、最適な切断温度化合物を埋め込み型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底に入れます。液体窒素でサンプルを凍結スナップします。サンプルが完全に凍結したら、ホイルで包み、ドライアイスで冷凍庫に移します。さらに処理する準備ができるまでマイナス80°Cで保管してください。まず、クライオスタットの温度をマイナス19°C、ブロックホルダーの温度をマイナス17度に設定します。次に、70%エタノールでクライオスタットの内部を拭き取ります。硬い組織、ガラススライド、および冷却するために凍結スタットにフィッティングツールのための使い捨てブレードを置き、切断の間、クライオスタットの中に保管します。凍結した組織ブロックをドライアイス上の凍結した組織ブロックをクライオスタットに移し、少なくとも10分間平衡化させます。次に、埋め込み金型の底部を押して、OCT ブロックを金型から押し出します。ブロックホルダに十分なOCT培地を適用してブロックを固定し、OCTメディアが完全にフリーズするまで待ちます。この後、ブロックホルダーをオブジェクトホルダーに入れ、所定の位置に締めます。ブレードの位置を調整し、ブロックを15マイクロメートルの切削増分でトリミングして、サンプルを覆うOCTを取り除きます。クライオスタットを調整して8マイクロメートルのセクションを生成し、廃棄される2〜3つのクライオセクションをカットします。ブロックに粘着フィルムを置き、フィルムをブロックに付着させるためにフィッティングツールを使用します。さて、フィルムによってセクションを保持しながら、ゆっくりと一定の速度でカットを行います。サンプルの解凍を避けるために、クライオスタット内のクライオバーの上にあらかじめ冷却されたガラススライドの上にサンプルを上に向けてフィルムを置きます。テープを使用してフィルムをガラススライドに固定し、染色を容易にします。ヒュームフードで、テキストプロトコルで概説されているように、エタノール、RNaseフリー水、および氷上のキシレンの必要な溶液を準備します。95%エタノールで30秒間インキュベートする。その後、RNaseフリーの水のセクションを慎重に30秒間浸してOCTを完全に取り除きます。次に、50マイクロリットルの市販LCM凍結セクション染色をセクションに分配し、室温で10秒間インキュベートします。スライドの端を吸収性のティッシュペーパーの上に置いて、セクションを排水します。100%エタノールで30秒間リンスし、余分な汚れを取り除きます。100%エタノールを含む第2のチューブに骨切片を30秒間浸し、30秒間100%キシレンに移します。粘着フィルムを支材としてドライガラススライドに貼り付け、できるだけ平らにしてください。この後、フィルム上にPET膜フレームスライドを置き、フィルムに取り付けるために膜上に手袋をした指を短く押します。このサンプルは、膜と粘着膜の間に挟まれる。接着フィルムは折り畳んだりしわを入れたりしてはならないし、膜と膜の間に気泡があってはならない。表面デコン剤を使用してステージエンドキャップホルダーを清掃します。スライドをスライドホルダーに、キャップをキャップホルダーに取り付けます。次に、フォーカスを調整し、1.25xの目的でスライドの概要を取得します。40xの目標に変更し、フォーカスを調整します。スライドの概要を使用して、対象領域を選択します。次に、ここに示すようにレーザーパラメータを調整し、各目的に合わせてこれらのパラメータを最適化します。レーザーでサンプルのカットに失敗した場合は、レーザーパワーを上げます。形態学的基準に基づいて、遠位大腿骨の概観または皮質骨の骨芽細胞、骨形成細胞、骨内皮細胞を選択します。ターゲットセルから遠ざかるようにレーザー経路の線を引き、UVレーザーによる損傷を最小限に抑えます。レーザーがサンプルを切断できない場合は、レーザーを複数回適用するか、不完全な切り傷のスポットのターゲットを検査し、移動と切断オプションを使用してこれらのスポットの組織を切断します。各セルタイプを別々の0.5ミリリットルチューブキャップに集める。まず、βメルカプトエタノールを含む50マイクロリットルのリシスバッファーを回収管のキャップに分配する。キャップの中でサンプルを1分間上下にピペットしてライスします。次に、ライセートをスピンダウンし、β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの00マイクロリットルをチューブに加えます。各スライドに対して、βメルカプトエタノールを含む350マイクロリシスバッファーを用いた標識されたマイクロ遠心分離管を調製する。LCMの後に残っているセクションを使用してRNAを抽出します。膜から膜を慎重に分離し、数回セクションにリシスバッファーをゆっくりとピペットすることによってサンプルを分解します。その後、ライセートサンプルをドライアイスに入れ、マイナス80度で保存します。続行する準備ができたら、室温でライセートを解凍します。その後、コレクションチューブのLCM採取細胞から新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを移し、メーカーの指示に従ってRNAを抽出します。本研究では、マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、LCMプロトコルが開発された。LCMは、サンプル収集に重力を使用するLCMシステムを使用して実行されます。単離されたRNAの収率と完全性をマイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した。異なるライシスプロトコルを用いて得られるRNAの質と量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムでここで見ることができます。試料をキャップ内で上下に1分間ピペットして分解すると、1平方ミリメートルのマイクロディセプトされた骨組織から約8.5ナノグラムのRNAを単離することが可能です。RIN 値は 8.60 です。あるいは、LCMは、焦点が合っていないレーザーパルスを使用するLCMシステムを使用して実行され、材料を張り出した粘着キャップにカタパルトします。新鮮な凍結した骨の場合、マイクロディセクテッドされた骨組織の1平方ミリメートルから約1.6ナノグラムのRNAを単離することが可能です。RIN 値は 1 です。結論として、この手順で覚えておくべき最も重要なことは、正しい方法で立っているプロトコルを適用し、サンドイッチ複合体内のセクションの完全な乾燥を防ぎ、適切なLCMシステムを使用し、細胞を収穫するための時間制限を超えないことです。捕獲された細胞からRNAを単離したら、RNAシークなどによって発現プロファイリングにRNAを使用できます。最後に、キシレンとβ-メルカプトエタノールはフードの下で取り扱う必要がある有害物質であることを思い出させてください。また、液体窒素やクライオトームブレードの取り扱いには適切な注意をしてください。

Research

JoVE Journal

Biology

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