Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
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저자는 우테 자이츠와 니콜 지너가 뛰어난 기술적 도움과 수의사 코어 및 동물 관리 직원에게 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.

마우스의 뼈 조직은 동물 관리에 대한 일반적인 지침에 따라 엄격하게 사용되었으며 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 동물 및 동결 포함
<ol><li>일정한 실내 온도 (RT; 24 °C)와 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 12 시간 암흑 주기의 조건에서 동물을 집. 참고: 본 연구에서 뼈 조직은 3 개월 된 남성 야생 형 C57BL / 6 마?...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

RNA 질 및 양은 조직 조작, LCM 프로세스 및 RNA 추출과 같은 견본 준비의 모든 단계에서 부정적으로 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 후속 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양의 고품질 RNA를 얻기 위해 LCM 프로토콜이 개발되었다.
LCM의 경우 대부분의 실험실에서는 7−8 μm두께의 2섹션을 사용합니다. 두꺼운 섹션은 더 많은 재료를 수확 할 수 있습니다. 그러나, 그들은 ?...

조직은 이기종적이고 공간적으로 분포된 세포 유형으로 구성됩니다. 주어진 조직에 있는 다른 세포 모형은 동일 신호에 다르게 반응할 수 있습니다. 따라서, 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 상이한 세포 유형의 역할을 평가하기 위해 특정 세포 집단을 분리할 수 있는 것이 필수적이다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 복잡한 조직1에서지정된 세포를 분리하고 제거하는 비교적 빠르고 정확한 방법을 제공합니다. LCM 시스템은 레이저 빔의 힘을 사용하여 세포가 조직학적 조직 섹션에서 관심 있는 세포를 분비처리하거나 배양성장을 할 필요 없이 분리합니다. 이것은 세포가 그들의 자연적인 조직 서식지에 있고, 다른 세포 사이 공간 관계를 포함하는 조직 건축이 유지된다는 것을 의미합니다. 포획된 세포와 잔류 조직의 형태는 잘 보존되고, 여러 조직 성분은 동일한 슬라이드로부터 순차적으로 샘플링될 수 있다. 단리된 세포는 그들의 RNA, DNA, 단백질 또는 대사산물함량2,3의후속 분석을 위해 사용될 수 있다.
상이한 세포 집단에서 유전자 발현을 분석하기 위해, 또는 상이한 치료 후, 후속 분석4,5에대한 충분한 품질 및 수량의 mRNAs를 얻을 필요가 있다. DNA와 는 대조적으로, RNA는 고정에 더 민감하고 목적이 RNA를 공부하는 때 동결 조직의 사용은 추천됩니다. mRNA는 유비쿼터스 리보누클러(RNase)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 시편 처리 및 준비 중 엄격한 RNase 프리 조건이 필요하며 실온에서 시료를 보관하지 않는 것이 필요합니다. 또한, 어떤 장기간 수성 위상 단계없이 빠른 기술은 RNA 저하를 방지하기 위해 중요하다6. RNA 수율 및 무결성은 또한 LCM 공정 및 LCM 시스템 사용7,8에의해 영향을 받을 수 있다. 현재, 다른 작동 원리를 가진 4개의 LCM 시스템을 사용할 수 있습니다2. RNA 추출 방법은 다른 RNA 격리 키트가 RNA 수량 및 품질7,8에서유의한 차이로 테스트되었기 때문에 중요 할 수 있습니다.
모든 조직 준비 방법은 좋은 형태학적 대비를 얻고 추가 분석을 위한 RNA 무결성을 유지하는 것 사이에서 균형을 찾아야 합니다. 뼈에서 냉동 섹션을 준비하기 위해 접착제 필름이 개발되어지속적으로 개선 9. 뼈 부분은 접착제 필름에 직접 절단되고 염색됩니다. 이 접착제 필름은 많은 유형의 염색에 적용 가능하며 LCM9,10,11,12,13을사용하여 뼈 저온절로부터 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용될 수 있습니다. 14. 외과 제거, 포함, 동결, 절단 및 염색을 포함한 모든 단계는 1 시간 이내에 완료 할 수 있습니다. 중요한 것은, 골아세포, 골라선 세포 및 파골세포와 같은 세포는9,10,11, 12,13,14를명확하게 식별할 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하다는 장점이 있습니다. 뼈 저온 절을 생성하는 다른 방법은 테이프 전달시스템(15)을사용하는 것이다. 그러나 후자의 기술은 시간이 더 많이 걸리고 추가계측이 필요하며, 접착 테이프에서 자외선(UV) 가교에 의한 사전 코팅된 멤브레인 슬라이드로 섹션을 옮겨야 하기 때문에 추가적인 계측이 필요합니다. 테이프 전달 시스템은 LCM16, 17,18,19와성공적으로 결합되었지만, 가교 코팅이 배경 패턴을 만들 수 있다는 점에 유의해야 한다. 세포형식별(20)을방해할 수 있다.
전형적으로, 소량의 RNA만이 미세 해부세포로부터 추출되고, RNA의 질 및 양은 종종 마이크로 모세관전기영동21에의해 평가된다. 컴퓨터 프로그램은 RNA 무결성 번호(RIN)라고 하는 RNA 추출물에 품질 지수를 할당하는 데 사용됩니다. RIN 값이 1.0이면 완전히 분해된 RNA를 나타내지만 10.0의 값은 RNA가 완전히 손상되지않은 22임을나타냅니다. 일반적으로 5 이상의 인덱스는 RNA 연구에 충분하다고 간주됩니다. RIN 값이 5.0-10.0인 샘플에서 유전자 발현 패턴은 서로 잘 상관관계가 있는 것으로 보고되었다23. 이 방법의 민감도는 높지만 총 RNA의 50 pg/μL이 검출될 수 있기 때문에 시료의 RNA 농도가 매우 낮으면 품질 평가를 얻기가 매우 어려울 수 있습니다. 따라서, RNA 품질을 평가하기 위해, LCM 후 잔류하는 조직 섹션은 종종 RNA를 추출하는 데 사용되며,슬라이드(24)에버퍼를 피펫팅하여 사용된다.
LCM은 다른 냉동 조직에 광범위하게 사용되었지만 추출 된 RNA의 RIN 값은 거의보고되지 않습니다. 게다가, 마우스 뼈에 있는 RNA를 공부하는 가장 적당한 방법을 명확히 하기 위하여 비교 연구 결과가 없습니다. 본 연구에서, 성인 마우스 대퇴골로부터의 냉동 단면은 고품질 RNA를 얻기 위하여 샘플 준비, LCM 프로토콜 및 RNA 추출을 최적화하기 위하여 이용되었다. 본 프로토콜은 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템에 특히 최적화되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA 수율 및 무결성은 RNA 분석에 결정적입니다. 그러나, 전체 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 절차를 통해 RNA 무결성을 유지하는 것은 종종 기술적으로 도전적이다. LCM 연구는 낮은 양의 물질로 작동하기 때문에 제한된 RNA 수율에 대한 우려도 중요합니다. 따라서, LCM 프로토콜은 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위하여 개발되었다. 염색 프로토콜, 저온절의 두께, 미세 해부된 조직 수량, RNA 추출 키트 및 미세 해부된 골세포로부터 얻어진 RNA 수율 및 무결성에 사용되는 LCM 시스템의 효과를 평가하였다. 8 μm 두께의 냉동 뼈 섹션은 점착필름을 사용하여 만들어졌고 상업적인 LCM 얼룩에 대한 신속한 프로토콜을 사용하여 염색되었다. 샘플을 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인과 접착제 막 사이에 끼워 넣은 것이다. 샘플 수집및 컬럼 기반 RNA 추출 방법에 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 충분한 수율의 고품질 RNA를 획득했습니다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 생리적 조건 및 질병 과정 모두에서 임의의 경조직의 세포에서 의학적 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.

마우스 대퇴골의 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 LCM 프로토콜이 개발되었다. 최적화된 프로토콜에서, 8 μm 두께의 냉동 골 절편을 점착필름상에 절단하고 상업적인 LCM 냉동 단면 얼룩에 대한 신속한 프로토콜을 사용하여 염색시켰다. 샘플을 PET 멤브레인과 접착제 필름 사이에 끼웠습니다. 마우스 뼈 세포는 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템을...

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A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

레이저 포획 미세해부(LCM) 프로토콜은 골세포의 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 개발되었다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 임의의 경조직의 세포에서 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.

신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

자연 환경 내의 특정 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위해 레이저 포획 마이크로 절제의 힘을 활용하는 것에 대해 생각해 본 적이 있습니까? 여기에서는 마우스 뼈의 극저온 섹션에서 충분한 양의 고품질 RNA를 얻을 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 유전자 조작 된 마우스 모델 이나 질병 모델에서 특정 뼈 세포에서 유전자 발현의 변화를 검사하기위한 훌륭한 도구입니다.여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 뼈에 초점을 맞추고 있습니다, 그러나 어떤 종에 있는 어떤 단단한 조직의 세포에 있는 유전자 발현을 그자리에서 공부하는 것을 이용될 수 있습니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이, 크리스티안 Schueler 될 것입니다, 내 실험실에서 기술자. 전신 마취하에 생동화에 의해 마우스를 안락사한 후 전체 대퇴골을 빠르게 제거하십시오.메스와 종이 타월을 사용하여 주변 연조직의 대퇴골을 청소하십시오. 다음으로 최적의 절단 온도 화합물을 포함 금형에 붓고 대퇴골을 포함 금형의 바닥에 놓습니다. 액체 질소로 샘플을 고정스냅합니다.샘플이 완전히 얼어 붙으면 호일로 싸서 드라이 아이스에 냉동고로 옮춥시다. 추가 처리를 위해 준비될 때까지 영하 80도에서 보관하십시오. 먼저, 저온의 온도를 영하 19도로 설정하고 블록 홀더의 온도를 섭씨 영하 17도로 설정합니다.다음으로, 70 %에탄올로 극저온의 내부를 닦아. 일회용 블레이드를 단단한 조직, 유리 슬라이드 및 피팅 도구를 냉동저온에 넣고 식히고 단면 동안 극저온 내부에 보관하십시오. 냉동 된 조직 블록을 마른 얼음에 냉동 된 얼음에 냉동 된 얼음으로 옮기고 적어도 10 분 동안 평형할 수 있습니다.그런 다음 포함 금형의 바닥을 눌러 10월 블록을 금형에서 밀어낸다. 블록 홀더에 충분한 OCT 매체를 적용하여 블록을 부착하고 OCT 매체가 완전히 정지될 때까지 기다립니다. 그런 다음 블록 홀더를 오브젝트 홀더에 놓고 제자리에 조입니다.블레이드 위치를 조정하고 샘플을 덮는 OCT를 제거하기 위해 15 마이크로미터 절단 증분으로 블록을 다듬습니다. 저온측정기를 조정하여 8마이크로미터 섹션을 생성하고 폐기될 2~3개의 극저온 섹션을 잘라냅니다. 블록에 접착제 필름을 놓고 피팅 도구를 사용하여 필름을 블록에 부착합니다.이제 필름의 섹션을 유지하면서 천천히 일정한 속도로 절단하십시오. 샘플의 해동을 피하기 위해 극저온바 의 냉동 유리 슬라이드에 미리 냉각 된 유리 슬라이드에 시료를 올려 놓습니다. 테이프를 사용하여 필름을 유리 슬라이드에 고정하여 쉽게 염색할 수 있습니다.연기 후드에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올, RNase 가 없는 물 및 자일렌의 필요한 솔루션을 얼음 위에 준비합니다. 95%에탄올로 30초 동안 섹션을 배양합니다. 그런 다음 10월을 완전히 제거하기 위해 30초 동안 RNase가 없는 물에 있는 섹션을 조심스럽게 담급니다.다음으로, 상업용 LCM 냉동 섹션 얼룩 50마이크로리터를 섹션에 디스펜싱하고 실온에서 10초 동안 배양합니다. 슬라이드 가장자리를 흡수성 티슈 페이퍼에 배치하여 단면을 배출합니다. 여분의 얼룩을 제거하기 위해 30 초 동안 100 % 에탄올로 섹션을 헹구는 다.뼈 부분을 100% 에탄올이 들어 있는 두 번째 튜브에 30초 간 담근 다음 30초 동안 100% 자일렌으로 옮김합니다. 드라이 글래스 슬라이드에 접착제 필름을 지원하여 필름을 가능한 한 평평하게 배치합니다. 그런 다음 필름에 PET 멤브레인 프레임 슬라이드를 놓고 필름에 부착하기 위해 멤브레인에 장갑을 낀 손가락을 짧게 누릅니다.이 샘플은 멤브레인과 접착제 필름 사이에 끼입니다. 접착 필름은 접히거나 구겨서는 안되며 필름과 멤브레인 사이에 기포가 없어야합니다. 먼저 표면 데폰타미넌트를 사용하여 스테이지 엔드 캡 홀더를 청소합니다.슬라이드를 슬라이드 홀더에 로드하고 캡을 캡 홀더에 넣습니다. 다음으로 초점을 조정하고 1.25x 목표와 함께 슬라이드 개요를 획득합니다. 40x 목표로 변경하고 포커스를 조정합니다.슬라이드 개요를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 여기에 표시된 대로 레이저 매개 변수를 조정하여 각 목표에 대해 이러한 매개 변수를 최적화합니다. 레이저가 시료를 자르지 못하면 레이저 전력을 늘립니다.형태학적 기준에 따라 태아 의 결선 제거제 또는 피질 뼈에서 골세포, 골성 및 뼈 안감 세포를 선택합니다. UV 레이저에 의한 손상을 최소화하기 위해 대상 세포로부터 멀리 떨어진 레이저 경로에 대한 선을 그립니다. 레이저가 시료를 자르지 못하면 레이저를 두 번 이상 적용하거나 불완전한 상처의 반점에 대한 표적을 검사하고 이동 및 절단 옵션을 사용하여 이러한 반점에 있는 조직을 절단하십시오.별도의 0.5 밀리리터 튜브 캡으로 각 세포 유형을 수집합니다. 먼저 베타 메르카토에탄올을 함유한 리시스 버퍼 50마이크로리터를 수집 튜브의 캡에 분배한다. 1 분 동안 캡에서 위아래로 피펫하여 샘플을 lyse합니다.다음으로, 용액을 스핀다운하고 베타-메르카토에탄올을 포함하는 용해 버퍼의 00 마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 각 슬라이드에 대해 베타 메르카토에탄올을 함유한 리시스 버퍼350 마이크로리터가 부착된 마이크로센심심분리기 튜브를 준비합니다. LCM 이후에 남은 섹션을 사용하여 RNA를 추출합니다.필름을 멤브레인에서 조심스럽게 분리하고 리시스 버퍼를 여러 번 섹션으로 천천히 피펫하여 샘플을 lyse합니다. 그런 다음, 드라이 아이스에 lysate 샘플을 넣고 영하 80도에서 저장합니다. 계속 할 준비가되면 실온에서 용재를 해동하십시오.그 후, 수집 관에서 LCM 수확 된 세포에서 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 리스를 옮기고 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출합니다. 이 연구에서는, LCM 프로토콜은 마우스 대퇴골의 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양의 고품질 RNA를 얻기 위해 개발된다. LCM은 샘플 수집에 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행됩니다.격리된 RNA의 수율 및 무결성은 마이크로모세피 전기포진을 사용하여 측정되었다. 상이한 용해 프로토콜을 사용하여 얻어진 RNA 품질 및 수량의 차이는 대표적인 겔 및 일렉트로페로그램에서 여기에서 볼 수 있다. 샘플이 1분 동안 캡에서 위아래로 피펫팅하여 분해되면, 미세분분뼈 조직의 1제곱밀리미터에서 약 8.5나노그램의 RNA를 분리할 수 있다.RIN 값은 8.60입니다. 또는 LCM은 분산형 레이저 펄스를 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행되며, 이는 재료를 돌출된 접착제 캡에 투석합니다. 신선한 냉동 뼈의 경우 미세 한 분부 된 뼈 조직의 1 평방 밀리미터에서 약 1.6 나노 그램의 RNA를 분리 할 수 있습니다.RIN 값은 하나입니다. 결론적으로, 이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 정확한 방식으로 스탠딩 프로토콜을 적용하고, 샌드위치 복합체의 섹션의 완전한 건조를 방지하고, 적절한 LCM 시스템을 사용하고, 세포를 수확하는 데 시간 제한을 초과하지 않는다는 것입니다. 일단 포획된 세포로부터 RNA를 분리하면, RNA 를 추구하여 발현 프로파일링을 위해 RNA를 사용할 수 있다.마지막으로, 자일렌과 베타-메르카토에탄올은 후드 아래에서 처리해야 하는 유해 물질임을 상기시키고 싶습니다. 또한 액체 질소와 극저온 블레이드를 취급할 때 적절한 예방 조치를 취하십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

연구

생물학

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

인간의 사후 뇌 조직에서 단세포 집단의 고품질 RNA 구하기

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

생성 고품질 기계 판독 가능한 생물 진학을위한 웹 도구

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...