Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

Forfatterne takker ute Zeitz og Nikole Ginner for deres utmerkede teknisk hjelp samt Vetcore og dyr omsorg ansatte for deres støtte.

Benvev fra mus ble brukt i nøye samsvar med rådende retningslinjer for dyr omsorg og alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyr lidelse.
1. dyr og Frys embedding
<ol><li>Husdyr i forhold med konstant romtemperatur (RT; 24 ° c) og en 12 h lys/12 h mørk syklus med fri tilgang til mat og vann. Merk: bein vev i denne studien ble innhentet fra 3-måneders gammel mannlig vill type C57BL/6 mus.</li>
	<li>På obduksjon, exsanguinate mus fra abdominal vena cava under nar...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

Både RNA-kvalitet og-mengde kan påvirkes negativt på alle stadier i prøve forberedelsen, for eksempel vevs manipulasjon, LCM-prosessen og RNA-ekstraksjon. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for påfølgende analyse av genuttrykk.
For LCM bruker de fleste laboratorier seksjoner 7 − 8 μm tykke2. Tykkere seksjoner ville tillate mer materiale som skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette redusere mikroskopisk oppl?...

Vev består av heterogene og romlig distribuerte celletyper. Forskjellige celletyper i et gitt vev kan reagere forskjellig på det samme signalet. Derfor er det viktig å kunne isolere bestemte celle populasjoner for vurdering av rollen til ulike celletyper i både fysiologiske og patologiske tilstander. Laser fangst microdissection (LCM) tilbyr en relativt rask og presis metode for å isolere og fjerne spesifiserte celler fra komplekse vev1. LCM systemer bruke kraften i en laserstråle for å skille celler av interesse fra histologiske vev seksjoner uten behov for enzymatisk behandling eller vekst i kultur. Dette betyr at cellene er i deres naturlige vev habitat, og at vev arkitektur inkludert romlige forholdet mellom ulike celler beholdes. Morfologi av både fanget celler og det resterende vevet er godt bevart, og flere vevs komponenter kan samples sekvensielt fra samme lysbilde. Isolerte celler kan deretter brukes til senere analyse av RNA, DNA, protein eller metabolitten innhold2,3.
For å analysere genuttrykk i forskjellige celle populasjoner, eller etter ulike behandlinger, er det nødvendig å oppnå mRNAs av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for den påfølgende analysen4,5. I motsetning til DNA, RNAs er mer følsomme for fiksering og bruk av frossen vev anbefales når målet er å studere RNA. Siden mRNAs raskt forringes av allestedsnærværende ribonucleases (RNase), er strenge RNase-frie forhold under prøvehåndtering og-tilberedning og å unngå lagring av prøver ved romtemperatur nødvendig. I tillegg er raske teknikker uten langvarige vandige fase trinn avgjørende for å hindre RNA-forringelse6. Den RNA yield og integritet kan også påvirkes av LCM prosessen og LCM systemet brukes7,8. Foreløpig er fire LCM systemer med ulike driftsprinsipper tilgjengelig2. Metoden for RNA-ekstraksjon kan også være viktig, siden ulike RNA isolasjons sett har blitt testet med betydelige forskjeller i RNA-kvantitet og kvalitet på7,8.
Enhver vevs Forberedelses metode krever å finne en balanse mellom å oppnå god morfologiske kontrast og opprettholde RNA integritet for videre analyser. For å forberede frosne seksjoner fra bein, ble en selvklebende film utviklet og kontinuerlig forbedret9. Benet seksjoner er kuttet og beiset direkte på limet filmen. Denne selvklebende filmen gjelder for mange typer farging, og kan brukes til å isolere cellene av interesse fra bein cryosections bruker LCM9,10,11,12,13, 14i det. Alle trinnene inkludert kirurgisk fjerning, innebygging, frysing, skjæring og farging kan gjennomføres innen mindre enn en time. Viktigere, celler som osteoblaster, bein fôr celler, og osteoklaster kan tydelig identifiseres9,10,11,12,13,14. Denne metoden har fordelen av å være rask og enkel. En alternativ metode for generering av bein cryosections er å bruke bånd overføringssystemet15. Men den sistnevnte teknikken er mer tidkrevende og krever ekstra instrumentering, siden seksjonene må overføres fra selvklebende tape på precoated membran lysbilder av ultrafiolett (UV) kryss-linking. Selv om tape Transfer systemet har blitt koblet sammen med LCM16,17,18,19, bør det bemerkes at tverrbundet belegg kan skape et bakgrunnsmønster som kan forstyrre celle type identifikasjon20.
Vanligvis trekkes bare små mengder RNA ut fra microdissected celler, og RNA-kvalitet og kvantitet vurderes ofte av mikro-kapillær elektroforese21. Et dataprogram brukes til å tilordne en indeks av kvalitet til RNA-ekstrakter som kalles RNA-nummer ((RIN)). En RIN-verdi på 1,0 indikerer fullstendig degradert RNA, mens en verdi på 10,0 antyder at RNA-en er helt intakt22. Vanligvis anses indekser over 5 som tilstrekkelige for RNA-studier. Gen uttrykks mønstre i prøver med en RIN-verdi på 5,0 − 10.0 har blitt rapportert å koordinere godt med hverandre23. Selv om følsomheten til denne metoden er høy, siden så lite som 50 PG/μL av total RNA kan oppdages, kan det være svært vanskelig å få en kvalitetsvurdering hvis RNA-konsentrasjonen i prøven er svært lav. Derfor, for å vurdere RNA kvalitet, er vevs delen som gjenstår etter LCM ofte brukt til å trekke ut RNA, ved pipettering buffer på Slide24.
Selv om LCM har blitt brukt mye på forskjellige frosne vev, RIN verdier av utpakkede RNAs er sjelden rapportert. Videre er det ingen sammenlignende studier for å avklare den mest hensiktsmessige metoden for å studere RNA i mus bein. I denne studien, frosne seksjoner fra voksen mus femurs ble brukt til å optimalisere prøve forberedelser, LCM protokoll og RNA utvinning for å oppnå høy kvalitet RNAs. Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for LCM-systemet som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA-utbytte og-integritet er avgjørende for RNA-analyse. Det er imidlertid ofte teknisk utfordrende å opprettholde RNA-integritet gjennom hele laser opptaks microdissection (LCM). Siden LCM-studier arbeider med lave mengder materiale, er det også viktig å ta hensyn til begrensede RNA-avlinger. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Effekten av fargeprotokoll, tykkelse av cryosections, microdissected vevs mengde, RNA utvinnings sett og LCM-system som ble brukt på RNA-utbytte og integritet innhentet fra microdissected bein celler ble evaluert. Åtte μm-tykke frosne bein seksjoner ble gjort ved hjelp av en selvklebende film og beiset bruke en rask protokoll for en kommersiell LCM beis. Prøven var klemt mellom en polyetylen polyetylentereftalat (PET) membran og limet film. Et LCM-system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling og en kolonne-basert RNA utvinning metoden ble brukt for å oppnå høy kvalitet RNAs av tilstrekkelig yield. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere in situ genuttrykk i celler av noe hardt vev i både fysiologiske forhold og sykdoms prosesser.

En LCM-protokoll ble utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler med muse femurs. I optimalisert protokollen, 8 μm-tykke frosne bein seksjoner ble kuttet på en selvklebende film og beiset ved hjelp av en rask protokoll for en kommersiell LCM frosne delen flekken. Prøven var klemt mellom PET membranen og limet film. Mouse bein celler ble microdissected ved hjelp av et LCM system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling. En Kol onne BAS ert RNA utvinn...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En LCM-protokoll (laser Capture microdissection) ble utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere genuttrykk i celler av noe hardt vev.

En laser Capture Microdissection protokoll som gir høy kvalitet RNA fra fersk-frosne Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Har du noen gang tenkt på å utnytte kraften i laserfangst mikrodisseksjon for analyse av genuttrykk i bestemte beinceller i deres naturlige miljø? Her beskriver vi en protokoll som gjør det mulig for deg å få tilstrekkelige mengder høy kvalitet RNA fra kryoseksjoner av musebein. Denne teknologien er et flott verktøy for å undersøke endringer i genuttrykk i spesifikke beinceller i genmodifiserte musemodeller eller i sykdomsmodeller.Protokollen som er beskrevet her er fokusert på musebein, men kan brukes til å studere in situ et genuttrykk i celler av noe hardt vev i noen art. Å bidra til å demonstrere denne prosedyren, vil være Christiane Schueler, en tekniker fra laboratoriet mitt. Etter eutanisering av mus ved ekssanguinasjon under generell anestesi, fjern hele lårben raskt.Bruk en skalpell og papirhåndklær for å rengjøre lårbenet i det omkringliggende myke vevet. Hell deretter optimal skjæretemperaturforbindelse i innebyggingsformen og legg lårbenet i bunnen av de innebyggingsformene. Klikk fryse prøvene i flytende nitrogen.Når prøvene er helt frosset, pakk dem i folie og overfør dem på tørris til en fryser. Oppbevar dem på minus 80 grader Celsius til de er klare for videre behandling. Først setter du temperaturen i kryostaten til minus 19 grader Celsius og temperaturen på blokkholderen til minus 17 grader Celsius.Tørk deretter ned det indre av kryostaten med 70% etanol. Plasser engangsbladet for hardt vev, glasset glir og et tilpasningsverktøy inn i kryostaten for å avkjøles, og hold dem inne i kryostaten så lenge snittingen er. Overfør den frosne vevsblokken på tørris til kryostaten og la den likevekte i minst 10 minutter.Trykk deretter på bunnen av innebyggingsformen for å skyve OCT-blokken ut av formen. Påfør nok OCT medium til blokkholderen til å feste blokken til den og vente til OCT-mediet fryser helt. Etter dette plasserer du blokkholderen i objektholderen og strammer den på plass.Juster bladposisjonen og trim blokken i 15-mikrometerskjæringstrinn for å fjerne OCT som dekker prøven. Juster kryostaten for å generere åtte mikrometerseksjoner og kutt to til tre kryoseksjoner som vil bli kassert. Plasser klebebåndsfilmen på blokken og bruk tilpasningsverktøyet til å feste filmen til blokken.Nå, gjør et kutt sakte og i konstant hastighet, mens du holder delen av filmen. Plasser filmen med prøven vendt opp på et forhåndskjølt glasssklie på kryobaren i kryostaten for å unngå tining av prøven. Bruk tape for å fikse filmen til glasssklie for enklere farging.I en røykhette kan du forberede de nødvendige løsningene av etanol, RNase-fritt vann og xylen på is som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber seksjonene i 95% etanol i 30 sekunder. Deretter dypper du forsiktig seksjonene i RNase-fritt vann i 30 sekunder for å fjerne OKT-en helt.Deretter dispenserer du 50 mikroliter av kommersielle LCM frosne seksjonsflekker på seksjonen og inkuberer ved romtemperatur i 10 sekunder. Tøm snittet ved å plassere kanten av lysbildet på absorberende vevpapir. Skyll avsnittet i 100 % etanol i 30 sekunder for å fjerne overflødig flekk.Senk beinseksjonene i et annet rør som inneholder 100% etanol i 30 sekunder, og overfør dem deretter til 100% xylen i 30 sekunder. Sett limfilm på en tørr glasssklie som en støtte, og vær forsiktig med å plassere filmen så flat som mulig. Etter dette plasserer du en PET membranrammelyse på filmen og trykker kort en hanskefinger på membranen for å feste den til filmen.Denne prøven vil bli klemt mellom membranen og den selvklebende filmen. Den selvklebende filmen skal ikke brettes eller rynkes, og det skal ikke være luftbobler mellom filmen og membranen. Start med å bruke overflatedekontaminering til å rengjøre trinnets endehetteholder.Legg skyven inn i glideholderen og hettene i hetten. Deretter justerer du fokuset og får en lysbildeoversikt med 1,25x-målet. Bytt til 40x-målet og juster fokuset.Velg interesseområdet ved hjelp av lysbildeoversikten. Deretter justerer du laserparametrene som vist her, og pass på å optimalisere disse parametrene for hvert mål. Hvis laseren ikke kutter prøven, øker du laserkraften.Velg osteoblast, osteocites, og bein fôr celler i distal femoral cancellous eller kortikale bein basert på morfologiske kriterier. Tegn en linje for laserbanen lenger unna målcellene for å minimere skaden av UV-laseren. Hvis laseren ikke kutter prøven, påfør laseren mer enn én gang eller inspiser målet for flekker av ufullstendige kutt og bruk flytte og kutte alternativet for å kutte vevet på disse stedene.Samle hver celletype i en egen 0,5-milliliter rørhette. Først dispensere 50 mikroliter av lysis bufferen som inneholder beta mercaptoetanol i hetten på oppsamlingsrøret. Lyse prøven ved pippetting det opp og ned i hetten i ett minutt.Deretter spinner du ned lysatet og legger til 00 mikroliter av lysisbufferen som inneholder beta-mercaptoetanol til røret. For hvert lysbilde, forberede en merket mikrocentrifuge rør med 350 mikroliter av lysis buffer som inneholder-beta mercaptoetanol. Bruk de resterende delene etter LCM til å trekke ut RNA.Separer filmen forsiktig fra membranen og lyse prøven ved sakte pippetting lysisbufferen på seksjonen flere ganger. Deretter legger du lysateprøvene på tørris og lagrer dem på minus 80 grader Celsius. Når du er klar til å fortsette, tine lysates ved romtemperatur.Etter dette overfører du lysates fra LCM-høstede celler i oppsamlingsrørene til nye 1,5-milliliter mikrocentrifugerør og trekker ut RNA i henhold til produsentens instruksjoner. I denne studien er en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde RNA av høy kvalitet for genuttrykksanalyse i beinceller av musefeurer. LCM utføres ved hjelp av et LCM-system som bruker tyngdekraften for prøveinnsamling.Utbyttet og integriteten til isolert RNA ble målt ved hjelp av mikrokapillær elektroforese. Forskjellen i RNA-kvalitet og kvantitet oppnådd ved hjelp av forskjellige lysisprotokoller kan ses her i de representative gel- og elektrofrogrammene. Når prøven lyses av pippetting opp og ned i hetten i ett minutt, er det mulig å isolere ca 8,5 nanogram RNA fra en firkantet millimeter mikrodissected beinvev.RIN-verdien er 8,60. Alternativt utføres LCM ved hjelp av et LCM-system som bruker en defokusert laserpuls, som katapulterer materialet inn i den overhengende klebehetten. For ferske frosne bein er det mulig å isolere ca. 1,6 nanogram RNA fra en firkantet millimeter mikrodissected beinvev.RIN-verdien er én. Til slutt er de viktigste tingene å huske i denne prosedyren, å bruke den stående protokollen på riktig måte, forhindre fullstendig uttørking av seksjoner i sandwichkomplekset, bruk et passende LCM-system, og ikke overskrider tidsbegrensningene for høsting av cellene. Når du har isolert RNA fra de fangede cellene, kan du bruke RNA til uttrykksprofilering, for eksempel ved RNA-søk.Til slutt vil vi minne deg på at xylen og beta-mercaptoetanol er farlige stoffer som må håndteres under en hette. I tillegg må du ta nødvendige forholdsregler ved håndtering av flytende nitrogen og også kryotomibladene.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolasjon fra Mouse Pancreas: En Ribonuclease rike Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

En Web verktøy for å generere høy kvalitet maskinlesbare Biologiske Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

En enkel High Efficiency Protocol for bukspyttkjertelen Islet Isolation fra mus

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser fange Microdissection av svært ren trabekulært Meshwork fra musen øyne for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...