Name: a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

Yazarlar ute Zeitz ve Nikole Ginner onların mükemmel teknik yardım yanı sıra destek için Vetcore ve hayvan bakım personeli için teşekkür ederiz.

Farelerden alınan kemik dokusu, hayvan bakımı için geçerli kurallara uygun olarak sıkı bir şekilde kullanılmış ve hayvanların acı çekmesini en aza indirmek için tüm çabalar gösterülmüştür.
1. Hayvanlar ve Donma Katıştırma
<ol><li>Ev hayvanları sürekli oda sıcaklığı (RT; 24 °C) ve 12 saat açık/12 saat karanlık döngü ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar. NOT: Bu çalışmada kemik dokuları 3 aylık erkek yabani tip C57BL/6 farel...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+laser+microdissection+technology:+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research.">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR:+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression.">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples.">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li><li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq.">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).</li><li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodr&#237;guez, P., Rodr&#237;guez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain.">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li><li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells.">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).</li><li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice.">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li><li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone.">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li><li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice.">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).</li><li>Andrukhova, O., Sch&#252;ler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice.">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).</li><li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection:+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System&#174;.">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System&#174;.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).</li><li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone.">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li><li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats.">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li><li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats.">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li><li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling.">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).</li><li>Mahalingam, M., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection:+Insights+into+Methods+and+Applications.">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).</li><li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Sch&#252;tze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+(laser+microdissection+and+pressure+catapulting)+technology.">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>K&#246;lble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LEICA+microdissection+system:+design+and+applications.">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li><li>B&#246;hm, M., Wieland, I., Sch&#252;tze, K., R&#252;bben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+MOMeNT:+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue.">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li><li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting.">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li></ol>

Hem RNA kalitesi hem de miktarı doku manipülasyonu, LCM prosesi ve RNA ekstraksiyonu gibi numune hazırlamanın tüm aşamalarında olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, sonraki gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir.
LCM için çoğu laboratuvar 7−8 μm kalınlığında2. Kalın kesitler daha fazla malzemenin hasat edilmesine olanak sağlayacaktır. Ancak, çok kalın ise, bu mikroskobik çözünü...

Dokular heterojen ve uzamsal olarak dağılmış hücre tiplerinden oluşur. Belirli bir dokudaki farklı hücre tipleri aynı sinyale farklı yanıt verebilir. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullarda farklı hücre tiplerinin rolünün değerlendirilmesi için belirli hücre popülasyonlarını izole edebilmek esastır. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) karmaşık dokulardan belirtilen hücreleri izole etmek ve kaldırmak için nispeten hızlı ve hassas bir yöntem sunar1. LCM sistemleri, enzimatik işleme veya kültür de büyüme gerek kalmadan histolojik doku bölümlerinden ilgi hücreleri ayırmak için bir lazer ışını nın gücünü kullanın. Bu, hücrelerin doğal doku habitatlarında olduğu ve farklı hücreler arasındaki mekansal ilişkiyi de içeren doku mimarisinin korundiğı anlamına gelir. Hem yakalanan hücrelerin hem de artık dokunun morfolojisi iyi korunmuştur ve aynı slayttan birkaç doku bileşeni sırayla örneklenebilir. İzole hücreler daha sonra RNA, DNA, protein veya metabolit içeriği nin sonraki analizi için kullanılabilir2,3.
Farklı hücre popülasyonlarında veya farklı tedavilerden sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için, sonraki analiz için yeterli kalite ve nicelikte mRNA'lar elde etmek gerekir4,5. DNA'nın aksine, RNA'lar fiksasyona karşı daha duyarlıdır ve amaç RNA'yı incelemek olduğunda dondurulmuş doku kullanımı önerilir. MRNA'lar her yerde bulunan ribonükleazlar (RNase) tarafından hızla bozulduğu için, numune işleme ve hazırlama sırasında sıkı RNase içermeyen koşullar ve numunelerin oda sıcaklığında depolanmasından kaçınmak gereklidir. Buna ek olarak, herhangi bir uzun sulu faz adımları olmadan hızlı teknikler RNA bozulmasını önlemek için çok önemlidir6. RNA verimi ve bütünlüğü de LCM işlemi ve Kullanılan LCM sistemi etkilenebilir7,8. Şu anda, farklı çalışma prensipleri ile dört LCM sistemleri mevcuttur2. Farklı RNA izolasyon kitleri RNA miktarı ve kalite7,8önemli farklılıklar ile test edilmiştir beri RNA ekstraksiyon yöntemi de önemli olabilir.
Herhangi bir doku hazırlama yöntemi iyi morfolojik kontrast elde etmek ve daha fazla analiz için RNA bütünlüğünü korumak arasında bir denge bulma gerektirir. Kemikten dondurulmuş kesitler hazırlamak için, bir yapıştırıcı film geliştirilmiş ve sürekligeliştirilmiş 9. Kemik bölümleri kesilir ve doğrudan yapışkan film üzerine boyanmaktadır. Bu yapışkan film boyama birçok türleri için geçerlidir, ve LCMkullanarakkemik kriyokesitlerden ilgi hücreleri izole etmek için istihdam edilebilir 9,10,11,12,13, 14. Cerrahi çıkarma, gömme, dondurma, kesme ve boyama dahil tüm adımlar bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Daha da önemlisi, osteoblastlar, kemik astar hücreleri ve osteoklastlar gibi hücreler açıkça9,10,11,12,13,14olarak tanımlanabilir. Bu yöntem hızlı ve basit olma avantajına sahiptir. Kemik kriyokesitleri oluşturmak için alternatif bir yöntem bant transfer sistemi15kullanmaktır. Ancak, ikinci teknik daha zaman alıcıdır ve ek enstrümantasyon gerektirir, çünkü bölümler yapışkan banttan ultraviyole (UV) çapraz bağlama ile önceden kaplanmış membran slaytlara aktarılması gerekir. Bant aktarım sistemi başarıyla LCM16,17,18,19ile birleştiğinde olmasına rağmen, çapraz bağlı kaplama bir arka plan deseni oluşturabilirsiniz unutulmamalıdır hücre tipi tanımlama20ile müdahale edebilir.
Tipik olarak, mikrodiskoplu hücrelerden sadece küçük miktarda RNA çıkarılır ve RNA kalitesi ve miktarı genellikle mikro-kılcal elektroforez21ile değerlendirilir. Bir bilgisayar programı RNA bütünlük numarası (RIN) olarak adlandırılan RNA özleri kalite dizini atamak için kullanılır. 1.0'lık RIN değeri tamamen bozulmuş RNA'yı gösterirken, 10,0 değeri RNA'nın tamamen sağlam olduğunu gösterir22. Genellikle, 5 üzerinde indeksler RNA çalışmaları için yeterli olarak kabul edilir. RIN değeri 5.0−10.0 olan örneklerdeki gen ekspresyonu desenlerinin birbiriyle iyi ilişkili olduğubildirilmiştir 23. Bu yöntemin duyarlılığı yüksek olmasına rağmen, toplam RNA'nın 50 pg/μL'si kadar az tespit edilebildiği için, numunedeki RNA konsantrasyonu çok düşükse kalite değerlendirmesi elde etmek çok zor olabilir. Bu nedenle, RNA kalitesini değerlendirmek için, LCM'den sonra kalan doku bölümü genellikle24numaralı slayta tampon ıslatarak RNA'yı ayıklamak için kullanılır.
LCM farklı dondurulmuş dokularda yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, çıkarılan RNA'ların RIN değerleri nadiren rapor edilir. Ayrıca, fare kemiklerinde RNA'yı incelemek için en uygun yöntemi açıklığa kavuşturmak için karşılaştırmalı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, yüksek kaliteli RNA elde etmek için numune hazırlama, LCM protokolü ve RNA ekstraksiyonu optimize etmek için yetişkin fare uyluk kemiğinden dondurulmuş kesitler kullanılmıştır. Bu protokol özellikle numune toplama için yerçekimi kullanan LCM sistemi için optimize edildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol EMPLURA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8,18,76,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film (LMD film)</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FL001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus HistoGene Staining Solution</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12241-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryofilm fitting tool</td>
			<td>Section-Lab</td>
			<td>C-FT000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM 1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slides, cut colour frosted orange</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>631-1559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology tissue molds PVC</td>
			<td>MEDITE</td>
			<td>48-6302-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMD7&#160;Laser&#160;Mikrodissektion&#160;System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14035843496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E476-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET membrane slides 1.4 mircon</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries GmbH</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away surface decontaminant</td>
			<td>Molecular BioProduct</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>2,89,73,363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a laser capture microdissection protocol that yields high quality rna from fresh-frozen mouse bones

RNA verimi ve bütünlüğü RNA analizi için belirleyicidir. Ancak, tüm lazer yakalama mikrodisesi (LCM) prosedürü boyunca RNA bütünlüğünü korumak genellikle teknik olarak zordur. LCM çalışmaları düşük miktarda malzeme ile çalıştığı için, sınırlı RNA verimleri ile ilgili endişeler de önemlidir. Bu nedenle kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. Boyama protokolünün etkisi, kriyokesit kalınlığı, mikrodiskoplu doku miktarı, RNA ekstraksiyon kiti ve Mikrodissected kemik hücrelerinden elde edilen RNA verimi ve bütünlüğü üzerine kullanılan LCM sistemi değerlendirildi. Sekiz μm kalınlığında dondurulmuş kemik bölümleri yapışkan film kullanılarak yapılmış ve ticari bir LCM lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyanmış. Örnek polietilen tereftalat (PET) membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Yeterli verimde yüksek kaliteli RNA'lar elde etmek için numune toplama için yerçekimi ni kullanan bir LCM sistemi ve kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılmıştır. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü hem fizyolojik koşullarda hem de hastalık süreçlerinde herhangi bir sert doku hücrelerinde yerinde gen ekspresyonunda çalışmak için kullanılabilir.

Fare uyluk kemiğinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için LCM protokolü geliştirilmiştir. Optimize edilmiş protokolde, 8 μm kalınlığında dondurulmuş kemik kesitleri bir yapışkan film üzerinde kesildi ve ticari bir LCM dondurulmuş kesit lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyandı. Örnek PET membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Fare kemik hücreleri örnek toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak mikrodis...

Watch this Scientific Journal Video about A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones at JoVE.com

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Lazer yakalama mikrodisyonunun gücünü kullanarak doğal ortamlarındaki belirli kemik hücrelerindeki gen ekspresyonunun analizini kullanmayı hiç düşündünmü? Burada, fare kemiklerinin kriyokesitlerinden yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmenizi sağlayacak bir protokol açıklıyoruz. Bu teknoloji, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde veya hastalık modellerinde belirli kemik hücrelerindeki gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için harika bir araçtır.Burada açıklanan protokol fare kemikleri üzerinde odaklanmıştır, ancak herhangi bir türdeki herhangi bir sert doku hücrelerinde bir gen ekspresyonunu yerinde incelemek için kullanılabilir. Bu prosedürü göstermek için yardımcı, Christiane Schueler, benim laboratuvar bir teknisyen olacak. Genel anestezi altında eksanguination tarafından fareler ötenazi sonra, hızla tüm femurlar kaldırın.Çevredeki yumuşak dokuların uyluk temizlemek için bir neşter ve kağıt havlu kullanın. Daha sonra, katıştırma kalıbına optimum kesme sıcaklığı bileşiği dökün ve uyluk kemiğini gömme kalıplarının dibine yerleştirin. Snap sıvı nitrojen örnekleri dondurmak.Örnekler tamamen dondurulduktan sonra folyoya sarın ve kuru buzda dondurucuya aktarın. Daha fazla işleme hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, kriyostattaki sıcaklığı eksi 19 dereceye, blok tutucunun sıcaklığını eksi 17 dereceye ayarlayın.Sonra, kriyostat iç aşağı silin 70% etanol ile. Sert dokular, cam slaytlar ve dondurucu içine uygun bir alet için tek kullanımlık bıçağı yerleştirin ve kesit süresince kriyostat içinde tutun. Kuru buzdaki donmuş doku bloğunu kriyostat'a aktarın ve en az 10 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.Daha sonra, OK Kdoğru bloğunu kalıbın dışına itmek için katıştırma kalıbının altına basın. Bloğu ona yapıştıracak kadar OCT ortamı uygulayın ve OCT ortamı tamamen donana kadar bekleyin. Bundan sonra, blok tutucuyu nesne tutucuya yerleştirin ve yerinde sıkın.Bıçağın konumunu ayarlayın ve numuneyi kaplayan OCT'yi kaldırmak için bloğu 15 mikrometrelik kesme artışlarında kırpın. Sekiz mikrometrelik kesitler oluşturacak şekilde kriyostat'ı ayarlayın ve atılacak olan 2-3 kriyokesiti kesin. Blok üzerine yapışkan film yerleştirin ve filmi bloğa uydurma aracını kullandı.Şimdi, film tarafından bölüm tutarken, yavaş yavaş ve sabit hızda bir kesim yapmak. Örneğin erimesini önlemek için filmi kriyostat içinde kriyobar üzerinde önceden soğutulmuş cam bir kaydıraktan yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Daha kolay boyama için filmi cam slayta sabitlemek için bant kullanın.Bir duman başlık olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi etanol, RNase-free su ve buz üzerinde ksilen gerekli çözümleri hazırlamak. Bölümleri 30 saniye boyunca %95 etanol le inkübün. Daha sonra, dikkatle tamamen OCT kaldırmak için 30 saniye boyunca RNase içermeyen su bölümleri daldırma.Daha sonra, 50 mikrolitre ticari LCM dondurulmuş kesit lekesi bölümüne dağıtın ve oda sıcaklığında 10 saniye kuluçkaya yatırın. Emici mendil kağıt üzerine slayt kenarını yerleştirerek bölümü drenaj. Herhangi bir fazla leke kaldırmak için 30 saniye boyunca% 100 etanol bölümü durulayın.Kemik bölümlerini %100 etanol içeren ikinci bir tüpe 30 saniye batırın ve ardından 30 saniye boyunca %100 ksilene aktarın. Bir destek olarak kuru bir cam slayt üzerine yapıştırıcı film koyun, mümkün olduğunca düz film yerleştirmek için özen. Bundan sonra, filmin üzerine bir PET membran çerçeve slayt yerleştirin ve kısa bir süre filme takmak için membran üzerinde eldivenli bir parmak basın.Bu örnek membran ve yapışkan film arasında sıkışmış olacaktır. Yapışkan film katlanmış veya kırışık olmamalı ve film ve membran arasında hiçbir hava kabarcıkları olmalıdır. Sahne sonu kapağı tutucuyu temizlemek için yüzey dekontaminantını kullanarak başlayın.Slaytı slayt tutucuya, kapakları da kapak tutucuya yükleyin. Ardından, odağı ayarlayın ve 1.25x hedefiyle slayta genel bakış elde edin. 40x hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın.Slayta genel bakışı kullanarak, ilgi alanını seçin. Daha sonra, her amaç için bu parametreleri optimize emin olmak, burada gösterildiği gibi lazer parametreleri ayarlayın. Lazer örneği kesmezse, lazer gücünü artırın.Distal femoral veya kortikal kemikte morfolojik kriterlere göre osteoblast, osteoit ve kemik astar hücrelerini seçin. UV lazer tarafından hasarı en aza indirmek için hedef hücrelerden daha uzak lazer yolu için bir çizgi çizin. Lazer örneği kesmek için başarısız olursa, lazer birden fazla kez uygulayın veya eksik kesik noktalar için hedef incelemek ve bu noktalar doku kesmek için hareket ve kesme seçeneği kullanın.Ayrı bir 0.5 mililitrelik tüp kapağı her hücre tipi toplayın. İlk olarak, toplama tüpünün kapağına beta merkaptoetanol içeren 50 mikrolitre likit tampon dağıtın. Bir dakika boyunca kapağın içinde yukarı ve aşağı borulama tarafından örnek lyse.Daha sonra, lysate aşağı spin ve tüp beta-mercaptoetanol içeren lysis tampon 00 mikrolitre ekleyin. Her slayt için, 350 mikrolitre likit tampon içeren beta merkaptoetanol içeren etiketli bir mikrosantrifüj tüp hazırlayın. RNA ayıklamak için LCM'den sonra kalan bölümleri kullanın.Filmi membrandan dikkatlice ayırın ve lysis tamponunu birkaç kez yavaşça keserek numuneyi lyse layın. Daha sonra, kuru buz üzerine lysate örnekleri koyun ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, oda sıcaklığında lysates eritin.Bundan sonra, toplama tüpleri lcm hasat hücrelerinden yeni 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler imal ve üreticinin talimatlarına göre RNA ayıklayın lysates aktarın. Bu çalışmada fare uyluk kemiğinin kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. LCM, numune toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirilir.İzole RNA'nın verimi ve bütünlüğü mikrokapiller elektroforez kullanılarak ölçüldü. Farklı lizis protokolleri kullanılarak elde edilen RNA kalitesi ve miktarı arasındaki fark burada temsili jel ve elektroferogramlarda görülebilir. Örnek bir dakika boyunca kapakta yukarı ve aşağı borular halinde incelendiğinde, bir milimetre kare mikrodisected kemik dokusundan yaklaşık 8,5 nanogram RNA izole etmek mümkündür.RIN değeri 8.60'tır. Alternatif olarak, LCM, malzemeyi sarkan yapışkan kapağın içine mancınık yapan, odaklanmış lazer darbesi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Taze donmuş kemikler için, mikrodissected kemik dokusunun bir milimetre kare yaklaşık 1.6 nanogram RNA izole etmek mümkündür.RIN değeri birdir. Sonuç olarak, bu prosedürde hatırlanması gereken en önemli şey, ayakta protokolünü doğru şekilde uygulamak, sandviç kompleksindeki bölümlerin tamamen kurumasını önlemek, uygun bir LCM sistemi kullanmak ve hücrelerin hasat için zaman sınırlarını aşmamaktır. Yakalanan hücrelerden RNA'yı yalıtın, ifade profilleme için RNA'yı kullanabilirsiniz, örneğin, RNA araması ile.Son olarak, ksilen ve beta-merkaptoetanol bir başlık altında ele alınması gereken tehlikeli maddeler olduğunu hatırlatmak istiyorum. Buna ek olarak, sıvı nitrojen ve ayrıca kriyotom bıçakları kullanırken uygun önlemleri alın.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

Yaratma Yüksek Kalite Makine okunabilir Biyolojik Pathways için Web Aracı

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...