Name: a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands at JoVE.com

ونحن ممتنون لأعضاء مختبر "كارش"، وللتشكيل الأنسيولوجي iGE3، والمرفق الأساسي لـ "فلو سيتومتري" التابع لجامعة جنيف، وللدكتور جان بيير أوبري - لاشيناي الذي وضع البروتوكول الخاص بـ FACS. نشكر لوكا ستيكلي على مساعدته في تصور القراءات على IGV. نشكر أنفسنا على الإذن اللطيف لإعادة استخدام الأرقام، والمحررين لدفعتنا إلى أن نكون مبدعين مع الكتابة.
تم تمويل هذا البحث من قبل دولة جنيف (CI، RKM، FK)، والصندوق الوطني السويسري للبحوث (www.snf.ch) (FK وRKM) والتبرعات من مؤسسة كلاراز (FK).

1. خطوط دروسوفيلا المستخدمة وجمع الذكور
<ol><li>لهذا البروتوكول، استخدم الذكور التعبير GFP في SCs وليس الخلايا الرئيسية. هنا، يتم استخدام برنامج تشغيل عبد الب-GAL4 (الموضح في المرجع18)،مع UAS-GFP (على كروموسوم 2). كما يمكن استخدام برامج التشغيل المناسبة الأخرى. لعزل SCs في ظل ظ...

<ol>
	<li>Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+seminal+fluid+proteins:+identification+and+function.">Insect seminal fluid proteins: identification and function.</a> Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).</li><li>Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+induces+developmental+changes+in+the+insect+female+reproductive+tract.">Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract.</a> Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).</li><li>League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+molecules+inhibit+harmonic+convergence+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti.</a> Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).</li><li>Degner, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+Transcripts,+and+Genetic+Architecture+of+Seminal+Fluid+and+Sperm+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti.">Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).</li><li>Wedell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+receptivity+in+butterflies+and+moths.">Female receptivity in butterflies and moths.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).</li><li>Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+proteolysis+regulators+in+seminal+fluid.">Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid.</a> Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).</li><li>Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Accessory+Gland+as+a+Model+for+Prostate+Cancer+and+Other+Pathologies.">The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies.</a> Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).</li><li>Kubli, E., Bopp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+behavior:+how+Sex+Peptide+flips+the+postmating+switch+of+female+flies.">Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies.</a> Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).</li><li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptides:+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male.">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).</li><li>Liu, H., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptide+is+the+molecular+basis+of+the+sperm+effect+in+Drosophila+melanogaster.">Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+post-mating+response+in+Drosophila+melanogaster+requires+multiple+seminal+fluid+proteins.">Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins.</a> PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).</li><li>Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Female+Post-Mating+Response+Requires+Genes+Expressed+in+the+Secondary+Cells+of+the+Male+Accessory+Gland+in+Drosophila+melanogaster.">The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).</li><li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acp36DE+is+required+for+uterine+conformational+changes+in+mated+Drosophila+females.">Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).</li><li>Adams, E. M., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+proteins+but+not+sperm+induce+morphological+changes+in+the+Drosophila+melanogaster+female+reproductive+tract+during+sperm+storage.">Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage.</a> Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+interaction+between+Drosophila+sperm+and+sex+peptide+is+mediated+by+other+seminal+proteins+that+bind+only+transiently+to+sperm.">Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).</li><li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+the+Drosophila+seminal+protein+Acp36DE+in+mated+females+enhances+its+sperm+storage+activity.">Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity.</a> Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).</li><li>Chapman, T., Davies, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+analysis+of+the+seminal+fluid+proteins+of+male+Drosophila+melanogaster+fruit+flies.">Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies.</a> Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).</li><li>Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+Hox+gene+Abd-B+in+the+male+accessory+gland+regulates+the+long-term+female+post-mating+response+in+Drosophila.">A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).</li><li>Minami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+defective+proventriculus+is+essential+for+male+accessory+gland+development+to+enhance+fecundity+in+Drosophila.">The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila.</a> PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).</li><li>Maeda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+male-specific+abdominal+plays+a+critical+role+in+Drosophila+accessory+gland+development+and+male+fertility.">The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility.</a> PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).</li><li>Prince, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab-mediated+trafficking+in+the+secondary+cells+of+Drosophila+male+accessory+glands+and+its+role+in+fecundity.">Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity.</a> Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).</li><li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing.">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li><li>Corrigan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP-regulated+exosomes+from+Drosophila+male+reproductive+glands+reprogram+female+behavior.">BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).</li><li>Leiblich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-+and+mating-dependent+secretory+cell+growth+and+migration+in+the+Drosophila+accessory+gland.">Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+conditions+sensed+by+the+reproductive+organ+during+development+optimize+male+fecundity+in+Drosophila.">Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila.</a> Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).</li><li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland.">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335 (2019).</li></ol>

طرق انفصال الخلايا من أنسجة دروسوفيلا مثل الأقراص التخيلية هي بالفعل وصف23. فشلت محاولاتنا ببساطة لاستخدام هذه الإجراءات على الغدد الملحقة، وتشجيعنا على تطوير هذا البروتوكول الجديد. وكان الهضم البروتياز وtrituration الميكانيكية الخطوات الحاسمة ونحن troubleshot لنجاح الإجراء، وب?...

تتكون الأعضاء من أنواع خلايا متعددة، لكل منها وظائف منفصلة وتعبر في بعض الأحيان عن مجموعات مختلفة إلى حد كبير من الجينات. للحصول على فهم دقيق لكيفية عمل الجهاز، غالباً ما يكون من الضروري دراسة كل نوع خلية متميزة التي تشكل هذا الجهاز. واحدة من الطرق الأساسية المستخدمة لاستكشاف وظيفة ممكنة هو تحليل النسخ. توفر هذه الطريقة القوية لقطة من التعبير الجيني في الخلية، للكشف عن العمليات والمسارات النشطة. ومع ذلك، هذا النوع من التحليل غالباً ما يكون من الصعب على مجموعات الخلايا النادرة التي يجب تنقيتها من الخلايا المجاورة أكثر وفرة بكثير. على سبيل المثال، الغدة التبعية الذكور دروسوفيلا هو جهاز تتكون في المقام الأول من نوعين من الخلايا السرية. وبما أن أندر من نوعي الخلايا لا يشكل سوى 4٪ من خلايا هذه الغدة، لم يتم استخدام تحليل النسخ من نوع الخلية المحددة للمساعدة في تحديد وظيفة هذه الخلايا.
الغدد التبعي (AGs) هي أجهزة الجهاز التناسلي الذكور في الحشرات. وهي مسؤولة عن إنتاج معظم بروتينات السائل المنوي (بروتينات السوائل المنوية (SFPs) وبروتينات الغدة التبعي (ACPs)). ومن المعروف أن بعض هذه SFPs للحث على الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية في الإناث التزاوج، وتسمى عادة استجابة ما بعد التزاوج (PMR). وتشمل بعض PMRs: زيادة معدل الإباضة ووضع البيض، وتخزين والإفراج عن الحيوانات المنوية، وتغيير في النظام الغذائي للإناث، وانخفاض في تقبل الإناث إلى الذكور التودد الثانوي1،2. وبما أن الحشرات تؤثر على العديد من القضايا المجتمعية الرئيسية من الصحة البشرية (كناقلات للأمراض الفتاكة) إلى الزراعة (يمكن أن تكون الحشرات آفات، ومع ذلك فهي حاسمة بالنسبة للتلقيح ونوعية التربة)، فإن فهم تكاثر الحشرات هو مجال هام من مجالات البحث. وقد تقدمت دراسة AGs وACPs بشكل ملحوظ مع الكائن الحي النموذجي Drosophila melanogaster. وقد أبرزت هذه الدراسات دور AGs وبعض البروتينات الفردية التي تنتجها في خلق PMR، مما يؤثر على العمل في الأنواع الأخرى مثل ناقلات المرض Aedes aegypti3،4، وغيرها من الحشرات1 ،5. وعلاوة على ذلك، كما تفرز AGs مكونات السائل المنوي1،6 وغالبا ما يعتقد أنها التناظرية الوظيفية للغدة البروستاتا الثدييات والحويصلة المنوية. هذا التشابه وظيفة جنبا إلى جنب مع أوجه التشابه الجزيئي بين اثنين من أنواع الأنسجة، جعلت من AGs نموذجا للغدة البروستاتا في الذباب7.
داخل الذكور دروسوفيلا، وهناك اثنين من الفصوص من الغدد التبعي. يمكن النظر إلى كل فص على أنه هيكل يشبه الكيس يتكون من طبقة أحادية من الخلايا السرية المحيطة بالتجويف المركزي، وملفوفة بعضلات ناعمة. كما ذكر أعلاه، هناك نوعان من الخلايا السرية المورفولوجية والتنموية والمتميزة وظيفيا ً التي تشكل هذه الغدة: الخلايا الرئيسية على شكل مضلع (تشكل حوالي 96٪ من الخلايا)، والخلايا الثانوية المستديرة الأكبر (SC) (تشكل 4٪ المتبقية من الخلايا، أو حوالي 40 خلية لكل فص). وقد تبين أن كلا النوعين من الخلايا ينتجان مجموعات متميزة من الـ ACPs للحث على وجود التصوير بالرنين المغناطيسي والحفاظ عليه. معظم البيانات التي تم الحصول عليها حتى الآن تسليط الضوء على دور بروتين واحد في إثارة معظم السلوكيات المميزة للPMR. هذا البروتين، الببتيد الجنس، هو صغير، 36 الببتيد الأحماض الأمينية التي تفرزها الخلايا الرئيسية8،9،10. على الرغم من أن الببتيد الجنس يبدو أن تلعب دورا رئيسيا في PMR، ACPs الأخرى، التي تنتجها كل من الخلايا الرئيسية والثانوية، كما تبين أن تؤثر على جوانب مختلفة من PMR11،12،13،14 ،15،16،17. على سبيل المثال، استنادا إلى معرفتنا الحالية، يبدو أن SCs، عن طريق البروتينات التي تنتجها، مطلوبة لإدامة إشارة SP بعد اليوم الأول18.
وبالنظر إلى ندرة SCs (80 خلية فقط لكل ذكر)، فإن كل معرفتنا بهذه الخلايا والبروتينات التي تنتجها تأتي من علم الوراثة ونهج المرشح. وحتى الآن، لم يُثبت سوى قائمة صغيرة نسبياً من الجينات أنها خاصة بشركة SC. وتشمل هذه القائمة البروتين homeodomain المعيبة proventriculus (Dve)19, وlncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 و 1921, CG1656 و CG1757511, 15،21 وعامل النسخ homeobox البطن-B (عبد الب)18. في السابق، أظهرنا أن متحولة ناقصة لكل من التعبير عن عبد الب وMSA lncRNA في الخلايا الثانوية(iab-6cocuD1 متحولة) تقصير طول PMR من ~ 10 أيام إلى يوم واحد فقط12 , 18 سنة , 20.ويبدو أن هذا النمط الظاهري هو سبب التخزين غير السليم من SP في الجهاز التناسلي الأنثوي12,18,20. على المستوى الخلوي، تظهر الخلايا الثانوية لهذا المتحولمورولوجيا غير طبيعية، وفقدان هياكلها المميزة مثل الفراغول18،20،21. باستخدام هذا الخط متحولة، حاولنا سابقا لتحديد الجينات المشاركة في وظيفة SC عن طريق مقارنة ملامح النسخ من AGs كله من نوع البرية أو الغدد التبعي متحولة12. أيضا، وأظهرت مختبرات أخرى أن عدد SC، مورفولوجيا ومحتوى vacuolar تعتمد على النظام الغذائي الذكور، وحالة التزاوج والعمر21،25،26.
وعلى الرغم من إحراز تقدم إيجابي باستخدام هذه النهج، فإن نسخة كاملة من اللجنة لم تتحقق بعد. ندرة هذه الخلايا في هذا الجهاز جعلت من الصعب التقدم أكثر حتى من خلايا النوع البرية. لاختبار التعبير الجيني، فإن التغيرات في هذه الخلايا بعد محفزات بيئية معينة ستكون أكثر صعوبة. وهكذا، هناك حاجة إلى طريقة لعزل وتنقية الحمض النووي الريبي SC التي كانت سريعة وبسيطة بما فيه الكفاية لأداء في ظل خلفيات وراثية مختلفة والظروف البيئية.
كل من الجينات عبد-B وMSA تتطلب محسن 1.1 كيلو بايت محددة من مجمع Drosophila Bithorax (يسمى محسن D1) للتعبير عنها في SCs18,20. وقد تم استخدام هذا محسن سابقا لإنشاء برنامج تشغيل GAL4 التي، عند ربطها UAS-GFP،قادرة على دفع تعبير GFP قوية على وجه التحديد في SCs. وهكذا، استخدمنا هذا الخط كأساس لبروتوكول FACS لعزل هذه الخلايا من كل من النوع البري وiab-6cocuD1 AGs). كما iab-6cocuD1 متحولة SCuD1 عرض مورفولوجيا الخلوية المختلفة، ونحن نظهر أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل الخلايا لتحديد النسخ من هذا النوع من الخلايا النادرة في ظل ظروف مختلفة إلى حد كبير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-wells Tissue Culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular with light source for GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draq7 0.3 mM</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>heat inactivated prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dishes for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterPure RNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MCR85102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50U/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolydT primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer cDNA synthesis kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR select Master mix for CFX</td>
			<td>applied biosystems</td>
			<td>4472942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shaker</td>
			<td>Hangzhou Allsheng intruments</td>
			<td>MS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 1250 &#956;l graduated tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 200 &#956;l bevelled tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands

لفهم وظيفة الجهاز، غالباً ما يكون من المفيد فهم دور مجموعات الخلايا المكونة له. لسوء الحظ، فإن ندرة مجموعات الخلايا الفردية غالباً ما تجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من المواد للدراسات الجزيئية. على سبيل المثال، الغدة التبعية للجهاز التناسلي الذكور دروسوفيلا يحتوي على نوعين من الخلايا السرية متميزة. تشكل الخلايا الرئيسية 96% من الخلايا السرية للغدة، في حين تشكل الخلايا الثانوية (SC) 4% المتبقية من الخلايا (حوالي 80 خلية لكل ذكر). على الرغم من أن كلا النوعين من الخلايا تنتج مكونات هامة من السائل المنوي، ومن المعروف أن عدد قليل فقط من الجينات تكون محددة لSCs. وقد أعاقت ندرة الـ SCs، حتى الآن، دراسة تحليل النسخ من هذا النوع المهم من الخلايا. هنا، يتم تقديم طريقة تسمح لتنقية SCs لاستخراج الحمض النووي الريبي والتسلسل. يتكون البروتوكول في تشريح الغدد أولا من الذباب التعبير عن مراسل GFP SC محددة ومن ثم إخضاع هذه الغدد لهضم البروتياز والتفكك الميكانيكي للحصول على الخلايا الفردية. بعد هذه الخطوات، يتم فرز الخلايا الفردية والحية، التي تحمل علامة GFP باستخدام فارز الخلايا المنشطة الفلورسنت (FACS) لتنقية RNA. ينتج عن هذا الإجراء RNAs SC محددة من ~ 40 الذكور لكل شرط لRT-qPCR المصب و / أو تسلسل RNA في غضون يوم واحد. تسمح سرعة وبساطة الإجراء بتحديد نسخ العديد من الذبابات المختلفة، من الأنماط الجينية المختلفة أو الظروف البيئية، في فترة قصيرة من الزمن.

البروتوكول المعروض هنا يمكّن أحد التجارب من عزل الخلايا الثانوية عن الغدد التبعية الذكور ية دروسوفيلا واستخراج الحمض النووي الريبي في غضون يوم واحد(الشكل 1).
نحن نستخدم بناء عبد-B-GAL4 18 لتسمية الخلايا...

Watch this Scientific Journal Video about A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands at JoVE.com

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

هنا، نقدم بروتوكولا ً لانفصال وفرز خلايا محددة من الغدد التبعية الذكور دروسوفيلا (الخلايا الثانوية) لتسلسل الحمض النووي الريبي وRT-qPCR. يتم تحقيق عزل الخلايا من خلال تنقية FACS للخلايا الثانوية التي تعبر عن GFP بعد عملية فصل متعددة الخطوات التي تتطلب تشريح، والهضم البروتياز والتشتت الميكانيكي.

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

تسمح هذه الطريقة بتحليل نسخي لتجمُّع خلايا نادرة من غدة إكسسوارات ذكورية Drosophila، تسمى الخلايا الثانوية، وتكشف عن الجينات التي تجعلها حاسمة لنجاح الإنجاب. في غضون يوم واحد، وهذا الأسلوب يسمح فرز الخلايا الثانوية من نوع وراثي مختلف واستخراج الجيش الملكي النيبالي الكلي لتسلسل qPCR لاحق أو الجيش الملكي النيبالي. في بعض الأحيان تكون المشاريع محدودة بسبب ندرة المواد الأولية.يمكن أن يوفر هذا الأسلوب الأساس لمجموعات أخرى تواجه التحدي المتمثل في العمل مع مجموعة خلايا نادرة. لأن الإجراء يحتاج إلى تراكم 40 الغدد, من المهم لممارسة التشريح. إعداد نصائح الماصات محلية الصنع مهم أيضا، ولذا يجب تصور ذلك على الفيديو كيفية جعله وإعداد مقدما.قبل البدء في الإجراء، وقطع والشعلة الجولة، واسعة، نصائح 200 ميكرولتر للتعامل مع الغدد، وتمرير فتح طرف من نصائح متعددة 1، 000 microliter بالقرب من لهب لأقل من ثانية واحدة لتضييق الفتحات. ثم، فرز النصائح المعدلة من أضيق إلى أوسع استناداً إلى سرعة الطموح. لتشريح الغدة الوصول، مكان 20 إلى 25 الذكور Drosophila في طبق زجاجي على الجليد، واستخدام ملقط ومجهر تشريح لإزالة الجهاز التناسلي لذبابة ذكر واحد.مسح الزوج غدة ملحق من جميع الأنسجة الأخرى, بما في ذلك الخصيات ومصباح القذف, ونقل الغدد الملحقات إلى لوحة زجاجية تحتوي على مصل الملحقة المتوسطة في درجة حرارة الغرفة. عندما تم جمع 20 زوجا من الغدد الملحقة، وغسل الغدد في طبق من برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الغسيل، نقل الغدد إلى حل الانفصام الطازجة المعدة، واستخدام ملقط حادة تحت مجهر تشريح لقرصة بحزم منتصف الفص غدي.باستخدام زوج من ملقط الثانية، وقطع الأنسجة مع طرف حاد لفصل المنطقة القريبة من الغدة الملحقية والقناة القذفية من جزء من الغدة التي تحتوي على خلايا ثانوية. قطع الغدد بحيث يمكن أن تصل الببتيداسيس الخلايا التي هي محمية خلاف ذلك من قبل طبقة العضلات الخارجية والسائل المنوي اللزوج في تجويف الغدة. ثم، استخدم تلميح ماصة 200 ميكرولتر قبل الرطب، لهب مدورة، واسعة، لنقل الغدد إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.بالنسبة لهضم الأنسجة، ضع الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بمعدل 1000 دوران في الدقيقة. في نهاية الحضانة، ووقف الهضم مع ملليلتر واحد من مصل تكمل المتوسطة، واستخدام قبل الرطب، لهب مدورة، واسعة، 1، 000 ميكرولتر ماصة تلميح لنقل العينات إلى لوحة 24-جيدا. تحقق من الخلايا لمعرفة تعبير GFP تحت مجهر فلوري.يجب أن تبدو معظم النصائح الغدة سليمة, وينبغي أن تكون منفصلة عدد قليل من الخلايا الثانوية. استخدام مدورة، ضيقة، 1، 000 ميكرولتر ماصات تلميح لخلايا بلطف ثلاث إلى خمس مرات لتعطيل الأنسجة الغدة الملحقة. ثم، استخدام ضيقة جدا، مدورة، 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح مرة واحدة إلى مرتين لإضفاء الطابع الفردي على الخلايا.السماح للخلايا لتسوية لمدة 15 دقيقة. تأكد من أن الخلايا تبدو صحية تحت المجهر، وإزالة الوسط الزائد. ثم، نقل الخلايا إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر، وشطف الآبار مع المتوسطة الطازجة لاسترداد أي الخلايا المتبقية.يمكن استخدام بناء Abd-B-GAL4 في هذه التجارب لتسمية الخلايا الثانوية ولكن ليس الرئيسية مع GFP. في هذه الدراسة، تم فرز كلا النوعين من الخلايا من النوع البري والغدد الملحقات iab-6cocuD1 متحولة. هذا D1 متحولة تفتقر إلى التعبير عن عبد B وMSA النصوص، والتي تؤثر على تطوير الخلايا الثانوية، مورفولوجيا، والوظيفة.بعد تفكك الخلية، يتم استخدام FACS لتحديد الخلايا الحية على أساس DRAQ7، ويستخدم مستوى الفلورس GFP لعزل الخلايا الثانوية والخلايا الرئيسية. يتم استخراج RNA من كل مجموعة خلايا ويتم تعديلها إلى اثنين من نانوغرام لكل عينة لRT-qPCR اللاحقة والتسلسل. ويكشف القياس الكمي للتعبير عن جينات محددة عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي على مستخلصات الخلايا الرئيسية والثانوية من النوع البري أن جينات الخلايا الثانوية Rab19 وMSA يتم اكتشافها من مستخلصات الخلايا الثانوية فقط، في حين يتم الكشف عن ببتيد الجنس الجيني الرئيسي للخلايا فقط من عينات الخلايا الرئيسية.ويكشف التحليل الرئيسي للمكونات على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من ثلاثة أنواع برية وثلاثة نسخ متماثلة متحولة أن النوع البري يكرر كلا من الكتلة قريبة من بعضها البعض وبعيدة عن العينات المتحولة. يظهر تصور القراءات المنحازة إلى جينات معينة أن جينات التدبير المنزلي مثل actin 5C ، والجينات الثانوية الخاصة بالخلايا Rab19 وDve يتم التعبير عنها في كلا النوعين الجينيين. أما بالنسبة لـ MSA، فإن التعبير القوي عن الجين الملاحظ في الذباب من النوع البري يضيع في السلالات المتحولة.الحصول على ما يكفي من الخلايا الثانوية المنفصلة الحية مهم لإجراء ناجح. وهكذا، تحقق من تشريح وتفكك البروتوكول في تجربة صغيرة النطاق. تسمح هذه الطريقة بفرز كلا النوع الخلوي من الغدة الملحقة من عدد قليل من الذباب، مما يتيح دراسة كيفية تفاعل تلك الخلايا بشكل مستنسخ مع الظروف الوراثية أو البيئية المتعددة.ومن المعروف أن نجاح الذكور الإنجابية يتأثر بأشياء كثيرة، بما في ذلك النمط الجيني، والعمر، وحالة التزاوج. وينبغي أن سهولة هذه الطريقة تسمح لنا للتحقيق في كيفية تأثير هذه العوامل على النسخ الغدة الملحقة.

Research

JoVE Journal

Genetics

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

تريدوهيل: "بروتوكول التدريب" الفاصل الزمني "ممارسة فعل بلطف" في melanogaster المورفولوجية

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...