Name: a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands at JoVE.com

Vi er taknemmelige over for medlemmerne af Karch Lab, til iGE3 genomforskning plateform, til flow cytometry kerne faciliteten ved universitetet i Genève, og til Dr. Jean-Pierre Aubry-lachainaye, der satte protokollen for FACS. Vi takker Luca Stickley for hans hjælp med at visualisere læsninger på IGV. Vi takker os selv for blid tilladelse til at genbruge tal, og redaktører for at tilskynde os til at være kreativ med at skrive.
Denne forskning blev finansieret af staten Genève (CI, RKM, FK), den schweiziske nationale fond for forskning (www.snf.ch) (FK og RKM) og donationer fra Claraz Foundation (FK).

1. Drosophila linjer anvendes og indsamling af mænd
<ol><li>For denne protokol, bruge mænd udtrykker GFP i SCs og ikke de vigtigste celler. Her anvendes en Abdb-GAL4 -driver (beskrevet i reference18), rekombineret med UAS-gfp (på kromosom 2). Andre passende drivere kan også anvendes. For isolering af SCs under forskellige mutante forhold, krydser mutationen til linjer, der indeholder den SC-specifikke GFP-linje.</li>
	<li>Saml to partier på omkring 25 raske, jomfr...

<ol>
	<li>Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+seminal+fluid+proteins:+identification+and+function.">Insect seminal fluid proteins: identification and function.</a> Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).</li><li>Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+induces+developmental+changes+in+the+insect+female+reproductive+tract.">Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract.</a> Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).</li><li>League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+molecules+inhibit+harmonic+convergence+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti.</a> Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).</li><li>Degner, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+Transcripts,+and+Genetic+Architecture+of+Seminal+Fluid+and+Sperm+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti.">Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).</li><li>Wedell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+receptivity+in+butterflies+and+moths.">Female receptivity in butterflies and moths.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).</li><li>Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+proteolysis+regulators+in+seminal+fluid.">Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid.</a> Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).</li><li>Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Accessory+Gland+as+a+Model+for+Prostate+Cancer+and+Other+Pathologies.">The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies.</a> Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).</li><li>Kubli, E., Bopp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+behavior:+how+Sex+Peptide+flips+the+postmating+switch+of+female+flies.">Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies.</a> Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).</li><li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptides:+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male.">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).</li><li>Liu, H., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptide+is+the+molecular+basis+of+the+sperm+effect+in+Drosophila+melanogaster.">Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+post-mating+response+in+Drosophila+melanogaster+requires+multiple+seminal+fluid+proteins.">Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins.</a> PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).</li><li>Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Female+Post-Mating+Response+Requires+Genes+Expressed+in+the+Secondary+Cells+of+the+Male+Accessory+Gland+in+Drosophila+melanogaster.">The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).</li><li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acp36DE+is+required+for+uterine+conformational+changes+in+mated+Drosophila+females.">Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).</li><li>Adams, E. M., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+proteins+but+not+sperm+induce+morphological+changes+in+the+Drosophila+melanogaster+female+reproductive+tract+during+sperm+storage.">Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage.</a> Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+interaction+between+Drosophila+sperm+and+sex+peptide+is+mediated+by+other+seminal+proteins+that+bind+only+transiently+to+sperm.">Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).</li><li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+the+Drosophila+seminal+protein+Acp36DE+in+mated+females+enhances+its+sperm+storage+activity.">Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity.</a> Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).</li><li>Chapman, T., Davies, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+analysis+of+the+seminal+fluid+proteins+of+male+Drosophila+melanogaster+fruit+flies.">Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies.</a> Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).</li><li>Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+Hox+gene+Abd-B+in+the+male+accessory+gland+regulates+the+long-term+female+post-mating+response+in+Drosophila.">A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).</li><li>Minami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+defective+proventriculus+is+essential+for+male+accessory+gland+development+to+enhance+fecundity+in+Drosophila.">The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila.</a> PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).</li><li>Maeda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+male-specific+abdominal+plays+a+critical+role+in+Drosophila+accessory+gland+development+and+male+fertility.">The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility.</a> PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).</li><li>Prince, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab-mediated+trafficking+in+the+secondary+cells+of+Drosophila+male+accessory+glands+and+its+role+in+fecundity.">Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity.</a> Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).</li><li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing.">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li><li>Corrigan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP-regulated+exosomes+from+Drosophila+male+reproductive+glands+reprogram+female+behavior.">BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).</li><li>Leiblich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-+and+mating-dependent+secretory+cell+growth+and+migration+in+the+Drosophila+accessory+gland.">Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+conditions+sensed+by+the+reproductive+organ+during+development+optimize+male+fecundity+in+Drosophila.">Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila.</a> Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).</li><li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland.">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335 (2019).</li></ol>

Metoder til celle dissociation fra Drosophila væv som imaginal discs er allerede beskrevet23. Vores forsøg på at blot bruge disse procedurer på tilbehørs kirtler mislykkedes, tilskynde os til at udvikle denne nye protokol. Proteasefordøjelse og mekanisk formalings var kritiske skridt, som vi gjorde for at gøre proceduren vellykket, og vi placerede således mange noter i afsnit 2-5 for at hjælpe eksperimenterne med at opnå tilfredsstillende resultater. For at dissociation skal lyk...

Organer består af flere celletyper, hver med diskrete funktioner og undertiden udtrykker meget forskellige sæt af gener. For at få en præcis forståelse af, hvordan et organ fungerer, er det ofte vigtigt at studere hver enkelt celletype, der udgør dette organ. En af de primære metoder, der anvendes til at udforske mulige funktion er transkriptomanalyse. Denne kraftfulde metode giver et øjebliksbillede af genekspression i en celle, for at afsløre aktive processer og veje. Men, denne type analyse er ofte vanskeligt for sjældne cellepopulationer, der skal renses fra langt mere-rigelige tilstødende celler. For eksempel er Drosophila mandlig tilbehørs kirtel et organ, der primært består af to sekretoriske celletyper. Da sjældnere af de to celletyper kun består af 4% af cellerne i denne kirtel, var brugen af en celletype specifik transkriptomanalyse ikke blevet brugt til at bestemme funktionen af disse celler.
Tilbehørs kirtler (AGs) er organer i den mandlige reproduktive tarmkanal i insekter. De er ansvarlige for produktionen af de fleste af proteinerne i sædvæsken (sædvæske proteiner (Sfp'er) og tilbehørs kirtel proteiner (Acp'er)). Nogle af disse sfp'er er kendt for at inducere den fysiologiske og adfærdsmæssige respons hos parret hunner, almindeligvis kaldet post-parring respons (PMR). Nogle af PMRs omfatter: en øget ægløsning og æglægnings hastighed, opbevaring og frigivelse af sperm, en ændring i kvindelig kost, og et fald i kvindelig modtagelighed til sekundære kurere mænd1,2. Som insekter påvirker mange store samfundsmæssige spørgsmål fra menneskers sundhed (som vektorer for dødelige sygdomme) til landbruget (insekter kan være skadedyr, men er afgørende for bestøvning og jordkvalitet), forståelse insekt reproduktion er et vigtigt forskningsområde. Undersøgelsen af AGs og ACPs er blevet fremskreden betydeligt med den model organisme Drosophila melanogaster. Disse undersøgelser har fremhævet den rolle, som AGS og nogle af de individuelle proteiner, de producerer i skabelsen af PMR, påvirker arbejdet i andre arter som sygdommen vektor Aedes aegypti3,4og andre insekter1 ,5. Endvidere, som AGS udskiller bestanddele af sædvæsken1,6de er ofte tænkt som den funktionelle analog af pattedyrs prostata og Sædblærer. Denne funktion lighed kombineret med molekylære ligheder mellem de to væv-typer, har gjort den AGs en model for prostata kirtel i fluer7.
Inden for Drosophila mandlige, der er to lapper af tilbehørs kirtler. Hver lap kan ses som en SAC-lignende struktur, der består af en enkeltlags af sekretoriske celler omkring et centralt lumen, og indpakket af glatte muskler. Som nævnt ovenfor, der er to morfologisk, udviklingsmæssigt og funktionelt adskilte sekretoriske celletyper udgør denne kirtel: de polygonal-formede hoved celler (udgør ~ 96% af cellerne), og de større, runde sekundære celler (SC) (udgør den resterende 4% af cellerne eller ca. 40 celler pr. lap). Det har vist sig, at begge celletyper producerer særskilte sæt af Acp'er for at fremkalde og vedligeholde PMR. De fleste af de data, der er opnået til dato fremhæver rollen som et enkelt protein i at udløse de fleste af de karakteristiske adfærd af PMR. Dette protein, sex peptid, er en lille, 36 aminosyre peptid, der er udskillet af de vigtigste celler8,9,10. Selv om sex peptid synes at spille en stor rolle i PMR, andre acp'er, der produceres af både de vigtigste og sekundære celler, har også vist sig at påvirke forskellige aspekter af PMR11,12,13,14 ,15,16,17. For eksempel, baseret på vores nuværende viden, SCs, via de proteiner, de producerer, synes at være påkrævet for fastholdelse af SP signalering efter den første dag18.
I betragtning af den sjældenhed af SCs (kun 80 celler pr. mand), al vores viden om disse celler og de proteiner, de producerer kommer fra genetik og kandidat tilgange. Hidtil har kun en relativt lille liste over gener vist sig at være SC-specifik. Denne liste omfatter homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)19, lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 og 1921, CG1656 og CG1757511, 15,21 og homeoboxtranskriptionsfaktoren abdominal-b (Abd-b)18. Tidligere har vi vist, at en mutant mangelfuld for både udtrykket Abd-B og lncRNA MSA i sekundære celler (IAB-6cocuD1 mutant) forkorter længden af PMR fra ~ 10 dage til kun en dag12 , 18 , 20. denne fænotype synes at være forårsaget af forkert opbevaring af SP i den kvindelige reproduktive kanal12,18,20. På cellulær niveau, de sekundære celler i denne mutant viser unormal morfologi, mister deres karakteristiske vakuole-lignende strukturer18,20,21. Ved hjælp af denne mutant linje har vi tidligere forsøgt at identificere gener, der er involveret i SC-funktionen, ved at sammenligne transkriptionelle profiler af hele AGs fra enten vildtype eller mutant tilbehørs kirtler12. Også, andre laboratorier viste, at SC-nummer, morfologi og vakuolær indhold afhænger af mandlig kost, parring status og alder21,25,26.
Selv om der blev gjort positive fremskridt ved hjælp af disse tilgange, var der langt fra opnået en fuld SC transkriptom. RARENESS af disse celler i dette organ gjorde det vanskeligt at fremskridt yderligere selv fra vilde type celler. For at teste Gen ekspression, ændringer i disse celler efter særlige miljømæssige stimuli ville være endnu sværere. Der var således behov for en metode til isolering og rensning af SC RNA, som var hurtig og enkel at udføre under forskellige genetiske baggrunde og miljøforhold.
Både Abd-B og MSA gener kræver en specifik 1,1 kb forstærker fra Drosophila bithorax kompleks (kaldet D1 forstærker) for deres udtryk i SCS18,20. Denne forstærker har tidligere været brugt til at oprette en GAL4 -driver, der, når den er forbundet med en UAS-gfp, er i stand til at drive et stærkt gfp-udtryk specifikt i SCS. Således brugte vi denne linje som grundlag for en FACS protokol til at isolere disse celler fra både vildtype og IAB-6cocuD1 AGS). Da IAB-6CocuD1 mutant SCS viser en anden cellulær morfologi, viser vi, at denne protokol kan bruges til at isolere celler til bestemmelse af deres transkriptomer fra denne sjældne celletype under meget forskellige forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-wells Tissue Culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular with light source for GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draq7 0.3 mM</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>heat inactivated prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dishes for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterPure RNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MCR85102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50U/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolydT primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer cDNA synthesis kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR select Master mix for CFX</td>
			<td>applied biosystems</td>
			<td>4472942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shaker</td>
			<td>Hangzhou Allsheng intruments</td>
			<td>MS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 1250 &#956;l graduated tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 200 &#956;l bevelled tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands

For at forstå funktionen af et organ, er det ofte nyttigt at forstå rollen af dets konstituerende cellepopulationer. Desværre, sjældenhed af individuelle cellepopulationer ofte gør det vanskeligt at opnå nok materiale til molekylære undersøgelser. For eksempel, tilbehørs kirtel af Drosophila mandlige reproduktive system indeholder to særskilte sekretoriske celletyper. De vigtigste celler udgør 96% af de sekretoriske celler i kirtel, mens de sekundære celler (SC) udgør de resterende 4% af cellerne (ca. 80 celler pr. mand). Selv om begge celletyper producerer vigtige komponenter i sædvæsken, er det kun nogle få gener, der vides at være specifikke for SCs. Raritet af SCs har hidtil hindret transkriptomic analyse undersøgelse af denne vigtige celletype. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for rensning af SCs til RNA-ekstraktion og sekvensering. Protokollen består i første dissekere kirtler fra fluer udtrykker en SC-specifik gfp reporter og derefter udsætte disse kirtler til proteasefordøjelse og mekanisk dissociation for at opnå individuelle celler. Efter disse trin sorteres individuelle, levende, GFP-mærkede celler ved hjælp af en fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) til RNA-rensning. Denne procedure giver SC-specifikke RNAs fra ~ 40 hanner pr. betingelse for downstream RT-qPCR og/eller RNA-sekvensering i løbet af en dag. Procedurens hurtighed og enkelhed gør det muligt at bestemme transkriptomerne for mange forskellige fluer, fra forskellige genotyper eller miljøforhold, inden for en kort tidsperiode.

Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt for en eksperimententer at isolere sekundære celler fra Drosophila mandlige tilbehørs kirtler og at UDTRÆKKE deres RNA i løbet af en enkelt dag (figur 1).
Vi bruger Abd-B-GAL4 konstruere18 til at mærke sekundære celler (SC), men ikke hoved celler (MC) med gfp (figur 2<str...

Watch this Scientific Journal Video about A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands at JoVE.com

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Her præsenterer vi en protokol for at adskille og sortere en bestemt cellepopulation fra Drosophila mandlige tilbehørs kirtler (sekundære celler) til RNA-SEKVENSERING og RT-qPCR. Celle isolation opnås gennem FACS rensning af GFP-udtrykker sekundære celler efter en flertrinsdissociation proces, der kræver dissektion, proteaser fordøjelse og mekanisk dispersion.

En FACS-baseret protokol til at isolere RNA fra de sekundære celler af Drosophila mandlige tilbehørs kirtler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Denne metode tillader en transskriptionomic analyse af en sjælden cellepopulation fra Drosophila mandlige tilbehør kirtel, kaldet de sekundære celler, og det afdækker gener, der gør dem kritiske for reproduktiv succes. I løbet af en dag tillader denne teknik sortering af sekundære celler fra forskellige genotype og udvinding af det samlede RNA til efterfølgende qPCR- eller RNA-sekvensering. Nogle gange er projekterne begrænset af sjældenheden af udgangsmateriale.Denne metode kan danne grundlag for andre grupper, der står over for udfordringen med at arbejde med en sjælden cellepopulation. Fordi proceduren skal akkumulere 40 kirtler, Er det vigtigt at praktisere dissektioner. Forberedelse af hjemmelavede pipette tips er også vigtigt, og så du bør visualisere det på videoen, hvordan man gør det og forberede sig på forhånd.Før du begynder proceduren, skæres og flamme runde, bred, 200-microliter tips til håndtering af kirtler, og videregive spidsen åbning af flere 1, 000-microliter tips i nærheden af en flamme i mindre end et sekund til at indsnævre åbningerne. Derefter sortere de modificerede tips fra smallere til bredere baseret på deres hastighed af aspiration. For accessary kirtel dissektion, sted 20 til 25 mandlige Drosophila i et glas fad på is, og bruge forrektriver og en dissektion mikroskop til at fjerne den reproduktive tarmkanalen af en mandlig flue.Ryd tilbehøret kirtel par fra alle de andre væv, herunder testiklerne og ejakulatoriske pære, og overføre tilbehør kirtler til en glasplade, der indeholder serum-suppleret medium ved stuetemperatur. Når 20 par tilbehør kirtler er blevet indsamlet, vaske kirtler i en skål af PBS i et til to minutter ved stuetemperatur. I slutningen af vasken, overføre kirtler til frisklavet dissociation løsning, og bruge skarpe kraftbefængte under en dissekere mikroskop til fast klemme midten af en kirtellap.Ved hjælp af et andet par saftæt, skæres vævet med den skarpe spids til at adskille den proksimale region af tilbehøret kirtel og den ejakulerende kanal fra den del af kirtlen, der indeholder sekundære celler. Skær kirtler, så peptidaser kan nå de celler, der ellers er beskyttet af den ydre muskel lag og af tyktflydende sædvæske i lumen af kirtlen. Brug derefter en for våd, flamme-afrundet, bred, 200-mikroliter pipette spids til at overføre kirtler til en 1,5-milliliter rør.For vævsfordøjelse anbringes røret i en 37-graders Celsius-shaker i 60 minutter ved 1.000 rotationer i minuttet. Ved slutningen af inkubationen stoppes fordøjelsen med en milliliter serumtillægt, og der anvendes en fortæt, flammeafrundet, bred, 1, 000 mikroliterpipettespids til at overføre prøverne til en 24-brøndplade. Kontroller cellerne for deres GFP udtryk under et fluorescerende mikroskop.De fleste af kirtel tips bør se intakt, og et par sekundære celler bør løsrevne. Brug en afrundet, smal, 1, 000-mikroliter pipette spids til forsigtigt triturere cellerne tre til fem gange for at forstyrre tilbehøret kirtel væv. Brug derefter en meget smal, afrundet, 1, 000-mikroliter pipette spids en til to gange for at individualisere cellerne.Lad cellerne nøjes i 15 minutter. Bekræft, at cellerne ser raske ud under mikroskopet, og fjern det overskydende medium. Derefter overføres cellerne til et nyt 1,5 milliliterrør, og skyl brøndene med frisk medium for at gendanne eventuelle resterende celler.Abd-B-GAL4-konstruktionen kan bruges i disse eksperimenter til at mærke sekundære, men ikke hovedceller med GFP. I denne undersøgelse blev begge celletyper sorteret fra vildtype og iab-6cocuD1 mutant tilbehør kirtler. Denne D1 mutant mangler udtryk for Abd-B og MSA udskrifter, som påvirker sekundære celler udvikling, morfologi, og funktion.Efter celle dissociation bruges FACS til at vælge levende celler baseret på DRAQ7, og GFP fluorescensniveau bruges til at isolere sekundære celler og hovedceller. RNA udvindes fra hver cellepopulation og justeres til to nanogram pr. prøve til efterfølgende RT-qPCR og sekventering. Kvantificering af ekspressionen af specifikke gener ved real-time kvantitative PCR på vilde type vigtigste og sekundære celle ekstrakter afslører, at de sekundære cellegener Rab19 og MSA påvises fra kun sekundære celleekstrakter, mens de vigtigste cellesex peptid påvises kun fra de vigtigste celleprøver.Hovedkomponentanalyse af RNA-sekventeringsdata af tre vilde typer og tre mutantreliktser viser, at den vilde type replikerer både klynge tæt på hinanden og langt fra de mutante prøver. Visualisering af læser på linje med bestemte gener viser, at husholdning gener såsom actin 5C, og de sekundære celle-specifikke gener Rab19 og Dve er udtrykt i begge genotyper. For MSA går det stærke udtryk for det gen, der observeres i vilde fluer, dog tabt i de mutante stammer.Opnåelse nok levende dissocierede sekundære celler er vigtigt for en vellykket procedure. Kontroller således dissektions- og dissociationsprotokollen i små eksperimenter. Denne metode gør det muligt at sortere begge celletype tilbehør kirtel fra et lille antal fluer, gør det muligt at undersøge, hvordan disse celle reagerer transskriptionelt på flere genetiske eller miljømæssige forhold.Mandlige reproduktive succes er kendt for at være påvirket af mange ting, herunder genotype, alder, og parring status. Den lethed af denne metode bør give os mulighed for at undersøge, hvordan disse faktorer påvirker tilbehør kirtel transskription.

Research

JoVE Journal

Genetics

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure til identifikation af en længe ikke-kodende RNA RNA mål

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Trædemølle: Interval Træning protokol for forsigtigt induceret øvelse i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...