Name: a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00
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私たちは、カルチ研究室のメンバー、iGE3ゲノミクスプレートフォーム、ジュネーブ大学のフローサイトメトリーコア施設、およびFACSのプロトコルを設定したジャン=ピエール・オーブリー・ラチャナエ博士に感謝しています。私たちは、IGV上の読み取りを視覚化する彼の助けのためにルカスティックリーに感謝します。フィギュアを再利用する優しい許可を与えてくださったことに感謝し、編集者の皆さんから、書き込みをクリエイティブにするよう促してくれました。
この研究は、ジュネーブ州(CI、RKM、FK)、スイス国立研究基金(www.snf.ch)(FKとRKM)、クララズ財団(FK)からの寄付によって資金提供されました。

1.ショウジョウバエライン使用と男性のコレクション
<ol><li>このプロトコルでは、メインセルではなく、SC で GFP を発現するオスを使用します。ここで、AbdB-GAL4ドライバ(参照18に記載)を、UAS-GFP(染色体2上)と組み合わせて使用する。その他の適切なドライバも使用できます。異なる変異条件下でのSCの単離については、変異をSC特異的GFPラインを含むライ?...

<ol>
	<li>Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+seminal+fluid+proteins:+identification+and+function.">Insect seminal fluid proteins: identification and function.</a> Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).</li><li>Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+induces+developmental+changes+in+the+insect+female+reproductive+tract.">Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract.</a> Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).</li><li>League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+molecules+inhibit+harmonic+convergence+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti.</a> Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).</li><li>Degner, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+Transcripts,+and+Genetic+Architecture+of+Seminal+Fluid+and+Sperm+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti.">Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).</li><li>Wedell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+receptivity+in+butterflies+and+moths.">Female receptivity in butterflies and moths.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).</li><li>Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+proteolysis+regulators+in+seminal+fluid.">Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid.</a> Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).</li><li>Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Accessory+Gland+as+a+Model+for+Prostate+Cancer+and+Other+Pathologies.">The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies.</a> Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).</li><li>Kubli, E., Bopp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+behavior:+how+Sex+Peptide+flips+the+postmating+switch+of+female+flies.">Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies.</a> Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).</li><li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptides:+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male.">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).</li><li>Liu, H., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptide+is+the+molecular+basis+of+the+sperm+effect+in+Drosophila+melanogaster.">Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+post-mating+response+in+Drosophila+melanogaster+requires+multiple+seminal+fluid+proteins.">Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins.</a> PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).</li><li>Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Female+Post-Mating+Response+Requires+Genes+Expressed+in+the+Secondary+Cells+of+the+Male+Accessory+Gland+in+Drosophila+melanogaster.">The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).</li><li>Avila, F. W., Wolfner, M. 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F., Karch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+Hox+gene+Abd-B+in+the+male+accessory+gland+regulates+the+long-term+female+post-mating+response+in+Drosophila.">A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).</li><li>Minami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+defective+proventriculus+is+essential+for+male+accessory+gland+development+to+enhance+fecundity+in+Drosophila.">The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila.</a> PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).</li><li>Maeda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+male-specific+abdominal+plays+a+critical+role+in+Drosophila+accessory+gland+development+and+male+fertility.">The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility.</a> PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).</li><li>Prince, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab-mediated+trafficking+in+the+secondary+cells+of+Drosophila+male+accessory+glands+and+its+role+in+fecundity.">Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity.</a> Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).</li><li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland.">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335 (2019).</li></ol>

虚円盤のようなショウジョウバエ組織からの細胞解離の方法については、既に23について説明されている。単にアクセサリー腺でこれらの手順を使用する試みは失敗し、この新しいプロトコルを開発することを奨励しました。プロテアーゼ消化と機械的トリチュアーションは、手順の成功に向けてトラブルショットを打つ重要なステップであり、実験者が満足のいく?...

臓器は複数の細胞型で構成され、それぞれが個別の機能を持ち、時には非常に異なる遺伝子のセットを発現します。臓器がどのように機能するかを正確に理解するためには、この臓器を構成するそれぞれの異なる細胞型を研究することがしばしば重要です。可能な機能を探索するために使用される主な方法の 1 つは、トランスクリプトーム分析です。この強力な方法は、細胞内の遺伝子発現のスナップショットを提供し、活性プロセスおよび経路を明らかにする。しかし、この種の分析は、はるかに豊富な隣接細胞から精製しなければならない希少な細胞集団では、しばしば困難である。例えば、ショウジョウバエ男性アクセサリー腺は、主に2つの分泌細胞型からなる器官である。2つの細胞タイプの稀な部分は、この腺の細胞のわずか4%を含むので、細胞型特異的トランスクリプトーム分析の使用は、これらの細胞の機能を決定するのに役立たなかった。
アクセサリー腺(AG)は、昆虫の男性の生殖管の器官です。彼らは精液(精液タンパク質(SGP)および付属腺タンパク質(AAP)のほとんどのタンパク質の生産を担当しています。これらのSAFPのいくつかは、交尾雌における生理的および行動的応答を誘発することが知られており、一般に交尾後応答(PMR)と呼ばれる。一部のPMRには、排卵および卵子産卵率の増加、精子の貯蔵および放出、女性の食事療法の変化、および二次求動男性1、2に対する女性受容性の低下が含まれる。昆虫は人間の健康(致命的な病気のベクターとして)から農業(昆虫は害虫でありながら、受粉や土壌の質にとって重要である)に至る多くの主要な社会的問題に影響を与えるので、昆虫の繁殖を理解することは研究の重要な領域です。AGとAGPの研究は、モデル生物のショウジョウバエメラノガスターで大幅に進められている。これらの研究は、AGと彼らがPMRを作成する際に生成する個々のタンパク質の一部の役割を強調し、疾患ベクターAedes aegypti3、4、および他の昆虫1のような他の種の研究に影響を与えました1 、5.さらに、AGが精液1、6の成分を分泌するように、それらはしばしば哺乳動物前立腺および精液胞の機能的類似体と考えられている。この機能の類似性は、2つの組織型間の分子類似性と組み合わされ、AGをハエ7における前立腺のモデルにした。
ショウジョウバエの男性の中には、アクセサリー腺の2つの葉があります。各葉は、中央のルーメンを取り囲む分泌細胞の単層で構成され、平滑筋で包まれた嚢状の構造として見ることができます。前述のように、この腺を構成する形態学的、発達的および機能的に明確な分泌細胞タイプの2つがあります:多角形形の主細胞(細胞の約96%を構成する)と、より大きな円形の二次細胞(SC)(残りの4%の細胞、またはローブあたり約40細胞)。両方の細胞型がPMRを誘導および維持するためにAAPの異なるセットを作り出すことが示されている。現在までに得られたデータのほとんどは、PMRの特徴的な挙動のほとんどを引き起こす単一のタンパク質の役割を強調しています。このタンパク質は、性ペプチド、主細胞8、9、10によって分泌される小さい、36アミノ酸ペプチドである。性ペプチドはPMRに大きな役割を果たしているように見えるが、主細胞と二次細胞の両方によって産生される他のAPCは、PMR11、12、13、14の様々な側面に影響を与えることも示されている。 ,15,16,17.例えば、我々の現在の知識に基づいて、SCは、それらが産生するタンパク質を介して、最初の18日後のSPシグナル伝達の永続化のために必要とされる。
SCの希少性(男性1人につきわずか80細胞)を考えると、これらの細胞とそれらが産生するタンパク質に関するすべての知識は、遺伝学と候補アプローチから来ています。これまでのところ、比較的小さな遺伝子のリストのみがSC特異的であることが示されている。このリストには、ホメオドメインタンパク質欠陥証明(Dve)19、lncRNA MSA20、Rab6、7、11および1921、CG1656およびCG17575 11、および含まれる。 15,21およびホキオーボックス転写因子腹部 B (Abd-B)18.以前に、二次細胞におけるAbd-BおよびlncRNA MSAの発現に対する変異欠損(iab-6cocuD1変異体)は、PMRの長さを〜10日から1日12日に短縮することを示した。,18歳,20.この表現型は、女性の生殖管12、18、20におけるSPの不適切な貯蔵によって引き起こされるようです。細胞レベルでは、この変異体の二次細胞は異常な形態を示し、その特徴的な真空様構造18、20、21を失う。この変異線を用いて、以前に野生型または変異型アクセサリー腺12から全AGの転写プロファイルを比較することにより、SC機能に関与する遺伝子を同定しようと試みた。また、他の研究室は、SC番号、形態および真空含有量が男性の食事、交配状態および年齢21、25、26に依存することを示した。
これらのアプローチを用いて肯定的な進歩がなされたが、完全なSCトランスクリプトームは達成にはほど遠かった。この器官のこれらの細胞の希少性は、野生型細胞からさらに進歩することを困難にしました。遺伝子発現をテストするために、特定の環境刺激後のこれらの細胞の変化はさらに困難であろう。したがって、異なる遺伝的背景や環境条件下で実行するのに十分な速く、簡単なSC RNAを分離および精製する方法が必要でした。
Abd-BおよびMSA遺伝子の両方は、SC18、20における発現のために、ショウジョウバエビオラビホラックスコンプレックス(D1エンハンサーと呼ばれる)からの特定の1.1 kbエンハンサーを必要とする。このエンハンサーは、以前にUAS-GFPに関連付けられている場合、特にSCで強力なGFP式を駆動することができるGAL4ドライバを作成するために使用されてきました。したがって、この行を FACS プロトコルの基礎として使用して、これらの細胞を野生型とiab-6cocuD1 AG の両方から分離します。iab-6cocuD1変異型SCは異なる細胞形態を示すので、このプロトコルは、非常に異なる条件下でこの希少細胞型から転写物の決定のために細胞を単離するために使用できることを示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-wells Tissue Culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular with light source for GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draq7 0.3 mM</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>heat inactivated prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dishes for dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterPure RNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MCR85102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50U/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolydT primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer cDNA synthesis kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR select Master mix for CFX</td>
			<td>applied biosystems</td>
			<td>4472942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shaker</td>
			<td>Hangzhou Allsheng intruments</td>
			<td>MS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 1250 &#956;l graduated tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipone 200 &#956;l bevelled tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1161-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facs-based protocol to isolate rna from the secondary cells of drosophila male accessory glands

臓器の機能を理解するために、多くの場合、その構成細胞集団の役割を理解することが有用である。残念ながら、個々の細胞集団の希少性は、多くの場合、分子研究のための十分な材料を得ることを困難にします。例えば、ショウジョウバエ男性生殖系の付属腺には、2つの異なる分泌細胞タイプが含まれています。主細胞は腺の分泌細胞の96%を占め、二次細胞(SC)は残りの4%の細胞(雄あたり約80細胞)を構成する。両方の細胞型は精液の重要な成分を産生するが、SCに特異的であることが知られている遺伝子はごくわずかである。SCの希少性は、これまでのところ、この重要な細胞型のトランスクリプトーミクス解析研究を妨げている。ここでは、RNA抽出及びシーケンシングのためのSCの精製を可能にする方法を提示する。プロトコルは、最初にSC特異的GFPレポーターを発現するハエから腺を解剖し、次にこれらの腺をプロテアーゼ消化と機械的解離にさらして個々の細胞を得ることで構成される。これらのステップに続いて、個体、生きている、GFPマーク付き細胞は、RNA精製のための蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてソートされる。この手順では、1日の間に下流RT-qPCRおよび/またはRNAシーケンシングの条件ごとに約40人の男性からSC特異的RNAが得られます。手順の迅速性と簡易性は、異なる種型または環境条件から、多くの異なるハエのトランスクリプトームを短期間で決定することを可能にします。

ここで提示されるプロトコルは、1人の実験者がショウジョウバエの男性アクセサリー腺から二次細胞を分離し、1日の間にRNAを抽出することを可能にする(図1)。
Abd-B-GAL4コンストラクト18を使用して二次細胞 (SC) に標識を付けますが、主細胞 (MC) は GFP (図...

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A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

ここでは、RNAシーケンシングおよびRT-qPCRに対するショウジョウバエ男性アクセサリー腺(二次細胞)から特定の細胞集団を解離し、ソートするプロトコルを提示する。細胞分離は、解剖、プロテアーゼ消化および機械的分散を必要とする多段階解離プロセス後のGFP発現二次細胞のFACS精製によって達成される。

ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

この方法は、二次細胞と呼ばれるショウジョウバエの男性補助腺からの稀な細胞集団のトランスクリプトミック分析を可能にし、生殖の成功に不可欠な遺伝子を発見する。1日の間に、この技術は、異なる遺伝子型からの二次細胞の選別と、その後のqPCRまたはRNAシーケンシングのための全RNAの抽出を可能にする。時にはプロジェクトは、出発材料の希少性によって制限されます。この方法は、希少細胞集団を扱うという課題に直面している他のグループの基礎を提供することができます。手順は40腺を蓄積する必要があるため、分節を練習することが重要です。自家製のピペットのヒントを準備することも重要ですので、あなたはそれを作り、事前に準備する方法をビデオで視覚化する必要があります。手順を開始する前に、切り取り、炎のラウンド、広い、腺を処理するための200マイクロリットルの先端を通過し、開口部を狭めるために1秒未満の炎の近くに複数の1,000マイクロリットルの先端の先端を渡します。次に、吸引の速度に基づいて、変更されたヒントを狭い範囲から幅に並べ替えます。下腺解剖の場合は、氷の上のガラス皿に20〜25人の男性ショウジョウバエを置き、鉗子と解剖顕微鏡を使用して1つの雄のハエの生殖管を取り除きます。睾場や射精球を含む他のすべての組織からアクセサリー腺のペアをクリアし、室温で血清補充培地を含むガラス板にアクセサリー腺を移します。20組の付属腺が採取されたら、PBSの皿の中で、室温で1~2分間、その腺を洗います。洗浄の最後に、腺を新しく調製した解離液に移し、解剖顕微鏡の下で鋭い鉗子を使用して腺状の葉の真ん中をしっかりとつまみます。鉗子の第2のペアを使用して、2次細胞を含む腺の部分から補助腺と射精管の近位領域を分離するために鋭い先端で組織を切断する。ペプチダーゼが外側の筋肉層によって保護されている細胞に到達できるように腺を切断し、腺の内腔内の粘性精液によって保護されます。次に、プレウェット、火の丸められた、広い200マイクロリットルピペットチップを使用して、腺を1.5ミリリットルチューブに移します。組織消化の場合は、1分あたり1,000回転で60分間、37°Cシェーカーにチューブを置きます。インキュベーションの終わりに、血清補充培地の1ミリリットルで消化を停止し、24ウェルプレートにサンプルを転送するために、プレウェット、火の丸めた、広い、1,000マイクロリットルのピペットチップを使用します。蛍光顕微鏡で細胞のGFP発現を確認します。腺の先端のほとんどは、そのまま見るべきであり、いくつかの二次的な細胞を分離する必要があります。丸みを帯びた、狭い、1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞を3〜5回穏やかにトリチュレートしてアクセサリー腺組織を破壊します。次いで、細胞を個体化するために、非常に狭く、丸みを帯びた1,000マイクロリットルピペットチップを1〜2回使用する。セルのセルの決済を 15 分間許可します。細胞が顕微鏡下で健康に見えるのを確認し、余分な培地を取り除きます。次に、新しい1.5ミリリットルのチューブに細胞を移し、残りの細胞を回収するために新鮮な培地でウェルをすすいます。Abd-B-GAL4コンストラクトは、これらの実験で、GFPを有する二次細胞ではなく、主要な細胞にラベルを付けるために使用することができる。本研究では、両方の細胞タイプを野生型およびiab-6cocuD1変異体付帯腺から選別した。このD1変異体は、Abd-BおよびMSA転写産物の発現を欠いているため、二次細胞の発達、形態、および機能に影響を及ぼす。細胞解離後、FACSを使用してDRAQ7に基づいて生きている細胞を選択し、GFP蛍光レベルを使用して二次細胞および主細胞を単離する。RNAは各細胞集団から抽出され、その後のRT-qPCRおよびシーケンシングのためにサンプル当たり2ナノグラムに調整される。野生型の主細胞および二次細胞抽出物に対するリアルタイム定量PCRによる特異的遺伝子の発現の定量化により、二次細胞遺伝子であるRab19およびMSAは二次細胞抽出物のみから検出され、メイン細胞遺伝子性ペプチドは主細胞サンプルからのみ検出されることを明らかにしている。3つの野生型および3つの変異体反復のRNAシーケンシングデータに関する主成分分析は、野生型が両方のクラスターを互いに近接させ、突然変異体サンプルから遠く離れたところに複製することを明らかにする。特定の遺伝子に整列した読み取りを可視化すると、アクチン5Cなどのハウスキーピング遺伝子と、Rab19およびDveの二次細胞特異的遺伝子が両方の遺伝子型で発現することが示されている。しかし、MSAの場合、野生型ハエで観察される遺伝子の強い発現は突然変異株で失われる。十分な生きた二次細胞の解化を得ることは、正常な処置のために重要である。したがって、小規模実験で解剖および解離プロトコルを検証する。この方法は、少数のハエから両方の細胞タイプの補助腺を選別することを可能にし、それらの細胞が複数の遺伝的または環境条件に転写反応する方法の研究を可能にする。男性の生殖の成功は、遺伝子型、年齢、交配状態を含む多くの事柄の影響を受けることが知られています。この方法の容易さは、これらの要因がアクセサリー腺転写にどのような影響を与えるかを調査することを可能にする必要があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバル トレーニングのプロトコル

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...