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November 22nd, 2019
DOI :
November 22nd, 2019
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Title
0:52
Plating Sorted Prostate Epithelial Cells into Primary Mouse Organoid Culture
3:29
Extracting Protein Lysate from Prostate Organoids for Western Blot Analysis
4:50
Fixing and Staining Prostate Organoids for Immunohistochemical Analysis by Whole-Mount Confocal Microscopy
6:44
Tissue Clearing and Mounting of the Stained Prostate Organoids for Whole-mount Confocal Microscopy
7:57
Results: Analysis of Lineage Marker Expression in Prostate Organoids by Western Blot and Whole-Mount Confocal Microscopy
9:44
Conclusion
Transcript
3 डी ऑर्गेनॉइड सिस्टम को 2D परखों की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माना जाता है, और यह जीव विज्ञान के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है जो अन्यथा प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण होगा। यह एक अनुकूलनीय प्रणाली है जहां हम कम समय के साथ औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ का परीक्षण कर सकते हैं और वीवो दृष्टिकोण में उपयोग करने की तुलना में काफी कम लागत कर सकते हैं। मैट्रिक्स परीक्षण को संभालना बहुत मुश्किल है, क्योंकि यह कमरे के तापमान तक पहुंचने पर जम जाता है।
यह केवल एक पिपेट के माध्यम से खींचा जा सकता है जब यह तरल होता है और बर्फ पर बनाए रखा जाना चाहिए। अंगूठी की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि संरचना बाधित होती है, तो यह ऑर्गेनॉइड विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, और मीडिया बदलते समय आप आसानी से सामग्री खो सकते हैं।
पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित माउस बेसल और ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं की तैयारी के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया के 500 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को धोएं, फिर प्रति माइक्रोलीटर 1, 000 कोशिकाओं के सेल घनत्व पर गोली को फिर से निलंबित करें। मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए, एक अंतिम मिश्रण उत्पन्न करने के लिए मैट्रिक्स जेल के साथ माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया में निलंबित एपिथेलियल कोशिकाओं को मिलाएं जिसमें मीडिया में 25% कोशिकाएं और 75% मैट्रिक्स जेल शामिल हैं।
डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर, बेसल कोशिकाओं को आमतौर पर प्रति 80 माइक्रोलीटर 100 से 2, 000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर चढ़ाया जाता है, जबकि ल्यूमिनल कोशिकाओं को प्रति 80 माइक्रोलीटर 2, 000 से 10, 000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर चढ़ाया जाता है। प्रत्येक सेल मिश्रण के लिए, 24-अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह मैट्रिक्स जेल के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें। पॉली-हेमा कोटिंग के साथ सीधे संपर्क से बचने के दौरान कुएं की दीवार के निचले आधे हिस्से पर एक बूंद पिपेट करें।
मैट्रिक्स जेल जोड़ने के बाद, प्लेट को घुमाएं ताकि मैट्रिक्स जेल सेल मिश्रण को कुएं के रिम के चारों ओर एक अंगूठी बनाने की अनुमति दी जा सके। मैट्रिक्स जेल को आंशिक रूप से कठोर करने की अनुमति देने के लिए 24-अच्छी प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% C02 इनक्यूबेटर राइट साइड को 10 मिनट तक रखें। 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, 24-अच्छी प्लेट को उल्टा करें और मैट्रिक्स जेल को पूरी तरह से कठोर करने की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त 50 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
फिर, प्रत्येक कुएं के केंद्र में पूर्व-गर्म माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया ड्रॉप-वार के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। मीडिया को जोड़ने के बाद 24 कुआं की थाली को इनक्यूबेटर में लौटाएं। माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया को भरने के लिए, 45-डिग्री कोण पर 24-अच्छी प्लेट को झुकाएं, और मैट्रिक्स जेल रिंग से बचते हुए पी1000 पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक के केंद्र से मौजूदा मीडिया को धीरे से हटा दें।
पहले की तरह प्री-गर्म माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रमुख पोषक तत्वों और विकास कारकों की तेजी से कमी को रोकने के लिए पांच दिनों से अधिक समय तक सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड में मीडिया की एक बड़ी मात्रा जोड़ने की सिफारिश की जाती है। पहले की तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया को हटा दें।
ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करने के लिए, मैट्रिक्स जेल को बार-बार मैट्रिक्स जेल की अंगूठी पर सीधे मैट्रिक्स जेल की अंगूठी पर सीधे गर्म डिस्पैस युक्त मीडिया के एक मिलीलीटर को पाइप करके ब्लास्ट करें। उखाड़ दिया मैट्रिक्स जेल ऑर्गेनॉइड मिश्रण को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित पूर्ण पाचन के बाद, ऑर्गेनॉइड पेलेट में फॉस्फेट-बफर नमकीन जोड़ें, और धीरे-धीरे फ्लिकिंग करके फिर से निलंबित करें।
कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 800 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा ऑर्गेनॉइड को गोली दें, और माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके सुपरनैट को हटा दें। पैक्ड सेल वॉल्यूम के 10 माइक्रोलीटर प्रोटीन लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर में ऑर्गेनॉइड छर्रों को फिर से निलंबित करें। झटका फिर से निलंबित करने के लिए।
अब, गीली बर्फ में ट्यूबों को जलमग्न करके ऑर्गेनॉइड को सोनिकेट करें और धीरे-धीरे माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब के बाहर सोनिक डिस्मेब्रेटर की नोक को लागू करें। स्थापित प्रोटोकॉल के साथ पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले 20 किलोहर्ट्ज में ४० सेकंड के लिए Sonicate । 24-अच्छी प्लेटों से प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड एकत्र करने के लिए, मीडिया को पहले की तरह से हटा दें।
मैट्रिक्स जेल को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए डिस्पास युक्त मीडिया के 500 माइक्रोलीटर के साथ इनक्यूबेटिंग करके पचाएं। माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में डाइजेस्ट ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन ले लीजिए। फिर, कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 800 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा ऑर्गेनॉइड को गोली दें, और सुपरनैंट को हटा दें।
प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग करने के लिए, पहले पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेट करें। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित गोली धोने के बाद, समाधान को अवरुद्ध करने में दापी दाग के प्रति मिलीलीटर एक माइक्रोग्राम जोड़ें, और कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
इस कदम से आगे इनक्यूबेशन के दौरान प्रकाश से नमूना की रक्षा करें। पहले की तरह ऑर्गेनॉइड के अपकेंद्रित्र के बाद, समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और कोमल झटकों के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। ऑर्गेनॉइड को फिर से गोली मारें, और कोमल मिलाते हुए 15 मिनट के लिए पीबीएस के एक मिलीटर के साथ गोली धोएं।
इस वॉशिंग प्रोसीजर को दो बार दोहराएं। फिर समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें, और कोमल मिलाते हुए चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ऑर्गेनॉइड को गोली दें, और गोली को दो बार अतिरिक्त धोएं।
पीबीएस में 30% सुक्रोज का एक मिलीलीटर 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पेलेड ऑर्गेनॉइड में जोड़ें। फिर कोमल मिलाते हुए कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट। ऑर्गेनॉइड को फिर से गोली चलाने के बाद, 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 45% सुक्रोज का एक मिलीमीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर दो घंटे तक हिलाएं।
फिर, प्रक्रिया दोहराएं, सिवाय 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 60% सुक्रोज का एक मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 800 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा ऑर्गेनॉइड को गोली दें, और 95% सुपरनैंट को हटा दें। यूवी प्रकाश के नीचे गोली का निरीक्षण करने की पुष्टि करने के लिए कि यह सुपरनैंट को हटाने के दौरान खो नहीं गया था।
सुक्रोज की एकाग्रता अधिक हो जाने के साथ ही गोली लूजर हो जाती है। शेष निलंबन के 10 से 20 माइक्रोलीटर को एक कक्ष कवर्लिप में स्थानांतरित करें, और माइक्रोस्कोपी को कॉन्फोकल करने के लिए आगे बढ़ें। बेसल और ल्यूमिनल कोशिकाएं अलग-अलग मॉर्फोलोजी के साथ ऑर्गेनॉइड बनाती हैं।
जबकि अधिकांश बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृति में सात दिनों के बाद आकार में समान होते हैं, चमकदार-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड महत्वपूर्ण विषमता प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, अधिकांश बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में बहुस्तरीय एपिथेलियम से घिरे ल्यूमेंस होते हैं, जबकि ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान में एक-स्तरित एपिथेलियम के साथ खोखले से लेकर कोशिकाओं के बहुस्तरीय तारों के साथ ठोस होते हैं जो कैनालाइज नहीं करते हैं। पश्चिमी दाग विश्लेषण से पता चला है कि बेसल और ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड बेसल और ल्यूमिनल प्राथमिक कोशिकाओं से जुड़ी विशेषताओं को बनाए रखते हैं ।
बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड बेसल मार्कर साइटोकेराटिन 5 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, जबकि ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड ल्यूमिनल मार्कर साइटोकेराटिन 8 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। बेसल और ल्यूमिनल मार्कर दोनों थोक आबादी में बेसल और ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में पाए गए थे, शायद भेदभाव के विचारोत्तेजक थे। बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में बहुस्तरीय एपिथेलियम होता है, जिसमें बाहरी परतें बेसल मार्कर पी 63 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, और आंतरिक परतों में गैर-पता लगाने योग्य स्तर होते हैं।
बाहरी परतें ल्यूमिनल मार्कर साइटोकेराटिन 8 के मध्यम स्तर को भी व्यक्त करती हैं, और आंतरिक परतों में उच्च स्तर होते हैं। जबकि एकल परत ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में सभी कोशिकाओं साइटोकेराटिन 8 के लिए सकारात्मक दाग, केवल चुनिंदा कोशिकाओं में परमाणु p63 निहित था । मैट्रिक्स जेल को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह ऑर्गेनॉइड संस्कृति में कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले कठोर न हो।
माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया DAPI त्वचा जलन पैदा कर सकता है। यूवी लाइट भी नुकसानदायक हो सकती है। पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण आवश्यक है।
हम ऑर्गेनॉइड से आरएनए को आरएनए अनुक्रमण करने के लिए एकत्र कर सकते हैं, जो हमें बताएंगे कि ऑर्गेनॉइड गठन के दौरान या हेरफेर के जवाब में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल कैसे बदलते हैं। इस मॉडल ने प्रोस्टेट क्षेत्र को एपिथेलियल जीवविज्ञान के मौलिक पहलुओं का अध्ययन करने और विकास और भेदभाव में नियामकों की पहचान करने के लिए एक प्रजनन योग्य पूर्व वीवो परख करने में सक्षम बनाया है।
माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड विभेदन को विनियमित करने वाले तंत्रों का मूल्यांकन करने के लिए एक आशाजनक संदर्भ का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह पेपर प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण का वर्णन करता है, और (1) ऑर्गेनोइड से प्रोटीन लाइसेट एकत्र करने के तरीकों का परिचय देता है, और (2) पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फिक्स और दाग ऑर्गेनॉइड।
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