3D organoidsystemet anses som mer fysiologisk relevant enn 2D-analyser, og det kan gi verdifull informasjon om biologien som ellers ville være utfordrende å tilegne seg. Dette er et tilpasningsdyktig system hvor vi kan teste farmakologiske og genetiske manipulasjoner med mindre tid og en betydelig lavere kostnad enn å bruke en in vivo tilnærming. Matrix-studien er veldig vanskelig å håndtere, da den stivner når den når romtemperatur.
Den kan bare trekkes gjennom en pipette når den er flytende og må opprettholdes på is. Ringens integritet er viktig å opprettholde. Hvis strukturen er forstyrret, som kan negativt påvirke organoid vekst, og du kan lett miste materiale når du bytter media.
Begynn denne prosedyren med fremstilling av mus basal og luminal prostata epitelceller som beskrevet i tekstprotokollen. Vask cellepelleten i 500 mikroliter mus organoid media, og deretter re-suspendere pellet på en celle tetthet på 1000 celler per mikroliter. For å forberede masterblandinger, bland epitelceller suspendert i museorganoide medier med matrisegel for å generere en endelig blanding som inneholder 25% celler i media og 75% matrisegel.
Avhengig av nedstrøms bruk, er basalceller vanligvis belagt med en konsentrasjon på 100 til 2 000 celler per 80 mikroliter, mens luminalceller er belagt med en konsentrasjon på 2000 til 10 000 celler per 80 mikroliter. For hver celleblanding, tilsett 80 mikroliter av matrisegelen per brønn av en 24-brønns plate. Pipette en dråpe på den nedre halvdelen av veggen av brønnen samtidig unngå direkte kontakt med poly-hema belegg.
Etter å ha lagt til matrisegelen, virvle platen for å la matrisegelcelleblandingen danne en ring rundt kanten av brønnen. Plasser 24-brønnsplaten i en 37-graders Celsius, 5% C02 inkubator høyre side opp i 10 minutter for å la matrisegelen delvis herdes. Etter inkubering i 10 minutter, snu 24-brønnsplaten opp ned og inkubere i ytterligere 50 minutter for å la matrisegelen helt herdes.
Deretter legger du til 350 mikroliter med forvarmede mus organoide medier drop-wise til midten av hver brønn. Når du har lagt til mediet, returnerer du 24-brønnsplaten til inkubatoren. For å fylle opp museorganoide medier, vipp 24-brønnsplaten i en 45-graders vinkel, og fjern forsiktig eksisterende medier fra midten av hver brønn ved hjelp av en P1000-pipette samtidig som matrisegelringen unngås.
Tilsett 350 mikroliter med forhåndsvarmede museorganoide medier som før. Det anbefales å legge til et større volum av media til organoider dyrket i mer enn fem dager for å forhindre rask uttømming av viktige næringsstoffer og vekstfaktorer. Fjern mediet fra hver så vel som før.
For å samle organoider, trykk gjentatte ganger matrisegelen ved å pipettere en milliliter forhåndsoppvarmet dispaseholdige medier direkte på matrisegelringen til hele ringen løsnes. Overfør den løsnede matrix gel organoid blandingen til en 1,5-milliliter mikro-sentrifuge rør. Etter fullstendig fordøyelse som beskrevet i tekstprotokollen, legg fosfatbufret saltvann til organoid pellet, og re-suspendere ved å sveipe forsiktig.
Pellet organoidene ved sentrifugering ved 800 ganger G i fem minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipette. Re-suspender organoid pellets i 100 mikroliter protein lysis buffer per 10 mikroliter pakket cellevolum. Sveip for å suspendere på igjen.
Nå sonikere organoidene ved å senke rørene i våt is og forsiktig bruke spissen av den soniske dismembratoren på utsiden av mikrosentrifugerrøret. Sonicate i 40 sekunder på 20 kilohertz før du går videre til vestlig blotting med etablerte protokoller. For å samle prostata organoider fra 24-brønnplatene, fjern mediet fra hver så vel som før.
Fordøy matrisegelen ved å inkubere med 500 mikroliter dispaseholdige medier i 30 minutter i en 37-graders Celsius, 5% CO2 inkubator. Samle fordøyd organoid suspensjon i en mikro-sentrifuge rør. Deretter pellet organoidene ved sentrifugering ved 800 ganger G i tre minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten.
For å utføre helmontert immunofluorescerende farging av prostata organoider, legg først til 500 mikroliter med 4% paraformaldehyd i PBS. Inkuber organoidene i to timer ved romtemperatur med mild risting. Etter å ha vasket pelleten som beskrevet i tekstprotokollen, legg til ett mikrogram per milliliter DAPI-flekk i blokkeringsløsning, og inkuber i to timer ved romtemperatur.
Beskytt prøven mot lys under inkubasjon fra dette trinnet fremover. Etter sentrifugering av organoidene som før, legg til primært antistoff i blokkeringsløsning og inkuber over natten ved fire grader Celsius med mild risting. Pellet organoidene igjen, og vask pelleten med ett milliter PBS i 15 minutter med mild risting.
Gjenta denne vaskeprosedyren to ganger. Legg deretter til sekundært antistoff i blokkeringsløsning, og inkuber over natten ved fire grader Celsius med mild risting. Etter inkubasjon, pellet organoidene, og vask pelleten for ytterligere to ganger.
Tilsett en milliliter på 30% sukrose i PBS med 1% Triton X-100 til pelleted organoider. Deretter inkuber i to timer ved romtemperatur med mild risting. Etter pelleting organoider igjen, tilsett en millimeter av 45% sukrose i PBS med 1% Triton X-100, og forsiktig riste i to timer ved romtemperatur.
Gjenta deretter prosedyren, bortsett fra å legge til en milliliter med 60% sukrose i PBS med 1% Triton X-100. Pellet organoidene ved sentrifugering ved 800 ganger G i tre minutter ved romtemperatur, og fjern 95% av supernatanten. Vær oppmerksom på pellet under UV-lys for å bekrefte at den ikke gikk tapt under fjerning av supernatanten.
Pelleten blir løsere etter hvert som konsentrasjonen av sukrose blir høyere. Overfør 10 til 20 mikroliter av gjenværende suspensjon til en kamret dekkslips, og fortsett til konfokal mikroskopi. Basale og armaturceller danner organoider med distinkte morfologier.
Mens de fleste basal-avledede organoider er like i størrelse etter syv dager i kultur, viser luminal-avledede organoider betydelig heterogenitet. Videre inneholder de fleste basalavledede organoider lumen omgitt av flerlags epitel, mens luminal-avledede organoider varierer i morfologi fra hul med enlags epitel til solid med flerlags ledninger av celler som ikke kanaliserer. Western blot analyse viste at basale og luminal-avledede organoider beholde funksjoner forbundet med basal og luminal primære celler.
Basal-avledede organoider uttrykker høyere nivåer av basalmarkøren cytokeratin 5, mens luminalavledede organoider uttrykker høyere nivåer av luminalmarkøren cytokeratin 8. Både basal- og luminale markører ble påvist i basale og luminale-avledede organoider i bulkpopulasjonen, kanskje noe som tyder på differensiering. Basal-avledede organoider inneholder flerlags epitel, med ytre lag som uttrykker høye nivåer av basalmarkør p63, og indre lag som ikke kan oppdages nivåer.
Ytre lag uttrykker også moderate nivåer av luminalmarkøren cytokeratin 8, og indre lag har høye nivåer. Mens alle celler i enkeltlags luminal-avledede organoider flekker positivt for cytokeratin 8, bare utvalgte celler inneholdt kjernefysisk p63. Forsiktighet må tas ved håndtering av matrisegel for å sikre at den ikke herdes før de plating celler inn i organoidkulturen.
DAPI som brukes til mikroskopi kan forårsake hudirritasjon. UV-lys kan også være skadelig. Tilstrekkelig personlig verneutstyr er viktig.
Vi kan samle RNA fra organoider for å utføre RNA-sekvensering, som vil fortelle oss om hvordan genuttrykksprofiler endres under organoiddannelse eller som svar på manipulasjon. Denne modellen har gjort det mulig for prostatafeltet å ha en reproduserbar ex vivo analyse for å studere grunnleggende aspekter ved epitelbiologi og identifisere regulatorer i utvikling og differensiering.