Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

ويشكر المؤلفان الدكتور ف. براين بيكيت والدكتور رودني دايل على استخدام معدات للحقن. تم تمويل هذا العمل من خلال تمويل البحوث من جامعة لويولا شيكاغو إلى دكتوراه في الد، D.T.، وJ.J.

1. جمع العينات
<ol><li>جمع الأجنة
	<ol><li>في كل قفص لجمع الأجنة، استخدم ما لا يقل عن 50 أنثى عذراء مع 20-25 ذكرًا للمجموعات. احتضان هذه الذبابات في زجاجة مع طعام الذرة أجار(جدول المواد)لمدة 1-2 أيام قبل بدء المجموعات23. ملاحظة: ويمكن استخدام المزيد من الذباب، و?...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

يقدم هذا البروتوكول وصفاً شاملاً للخطوات اللازمة للتدقيق في سلامة BBB خلال المراحل الجنينية المتأخرة والثالثة من تطور الميلانينوغاستر. وقد تم وصف نُهج مماثلة في أماكن أخرى للتحقق من سلامة BBB أثناء التنمية، وكذلك في مراحل البالغين5و7و29</su...

أثناء التنمية، والاتصالات الخلية والتفاعلات حاسمة لإنشاء هيكل الأنسجة والأعضاء والوظيفة. في بعض الحالات، هذه التفاعلات الخلية الخلية ختم الأجهزة من البيئة المحيطة لضمان وظيفة الجهاز السليم. هذا هو الحال بالنسبة للجهاز العصبي، الذي هو معزول عن طريق حاجز الدم في الدماغ (BBB). وقد تم ربط خلل في BBB في البشر إلى الاضطرابات العصبية بما في ذلك الصرع، وقد لوحظ انهيار الحاجز في الأمراض العصبية بما في ذلك التصلب المتعدد والتصلب الجانبي الضموري1. في الثدييات ، يتكون BBB من تقاطعات ضيقة بين الخلايا البطانية2،3. الحيوانات الأخرى، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، دروسوفيلا melanogaster، لديها BBB تتألف من الخلايا الغليفية. هذه الخلايا الغليظة تشكل حاجزا نفاذيا انتقائيا للسيطرة على حركة المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، والسموم، والجزيئات الكبيرة داخل وخارج الجهاز العصبي4. وهذا يسمح للحفاظ على التدرج الكهروكيميائي اللازم لإطلاق إمكانات العمل، مما يسمح للتنقل والتنسيق4. في D. melanogaster، وglia حماية الجهاز العصبي من الغنية بالبوتاسيوم ، مثل الدم الهيمولمف5.
في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والجهاز العصبي المحيطي (PNS) من D. melanogaster، طبقتين غليال الخارجي ، وglia subperineurial وglia العجان ، فضلا عن شبكة خارجية من المصفوفة خارج الخلية ، لاميلا العصبية ، تشكل الهيمولمفي الدماغ وحاجز العصب الهيمولمفي6, يشار إلى BBB في جميع أنحاء هذه المقالة. خلال التنمية subperineurial glia تصبح polyploidوتوسيع لتحيط الجهاز العصبي5،6،7،8،9،10،11 . وsubperineurial glia شكل تقاطعات الحاجز، والتي توفر حاجز الانتشار الرئيسي بين الهيمولمف والجهاز العصبي5،6،12. هذه التقاطعات هي مشابهة جزيئيا لتقاطعات تشبه الحاجز وجدت في paranodes من myelinating glia في الفقاريات، وأنها تؤدي نفس وظيفة تقاطعات ضيقة في BBB من الثدييات13،14، 15 , 16 سنة , 17.الفجوة غليا النجان، تنمو، والتفاف حول glia subperineurial لتنظيم انتشار الأيض والجزيئات الكبيرة6،10،18،19. اكتمال تشكيل BBB من قبل 18.5 ساعة بعد وضع البيض (AEL) في 25 درجة مئوية5،8. وقد حددت الدراسات السابقة الجينات التي هي المنظمين الحرجة لتشكيل BBB20،21،22. لفهم الأدوار الدقيقة لهذه الجينات بشكل أفضل، من المهم دراسة تأثير طفرة هذه المنظمين المحتملين على سلامة BBB. في حين حددت الدراسات السابقة نُهج اصالية في الأجنة واليرقات، إلا أن بروتوكولاً شاملاً لهذا الفحص لم يُوصف بعد5و7. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة طرق لـ "وصف سلامة BBB" أثناء مراحل اليرقات الجنينية والثالثة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

تطوير الجهاز العصبي السليم يشمل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وحاجز الانتشار الذي ينظم بإحكام الوصول إلى الجهاز العصبي ويحمي الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض. وقد ارتبطت العيوب في تشكيل هذا الحاجز مع الاعتلال العصبي، وقد لوحظ انهيار هذا الحاجز في العديد من الأمراض العصبية. ولذلك، من الأهمية بمكان تحديد الجينات التي تنظم تشكيل وصيانة حاجز الدم في الدماغ لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. من أجل فهم الأدوار الدقيقة التي تلعبها هذه الجينات في التنمية العصبية، فمن الضروري تقييم آثار التعبير الجيني المتغير على سلامة حاجز الدم في الدماغ. وقد تم العثور على العديد من الجزيئات التي تعمل في إنشاء حاجز الدم في الدماغ ليتم حفظها عبر الأنواع eukaryotic، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، Drosophila melanogaster. وقد ثبت أن ذباب الفاكهة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز العصبي ووظيفته. يصف هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة للتدقيق في سلامة حاجز الدم في الدماغ خلال المراحل الجنينية واليرقات من تطور D. melanogaster.

الطرق الموصوفة هنا تسمح بتصور سلامة BBB في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي في D. melanogaster الأجنة واليرقات(الشكل 1). عند الانتهاء من تشكيل BBB في وقت متأخر من تكوين الأجنة، يعمل BBB لاستبعاد جزيئات كبيرة من الدماغ وVNC5. يستفيد هذا البروتوكول من هذه الوظيفة لـ "تشكي?...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

سلامة حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز العصبي. في دروسوفيلا melanogaster، يتكون حاجز الدم في الدماغ من الخلايا الغليفية أثناء تكوين الجنين في وقت متأخر. يصف هذا البروتوكول طرق اختبار تكوين حاجز الدم في الدماغ وصيانته في أجنة D. melanogaster واليرقات النجمية الثالثة.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتنظيم الوراثي لتكوين وصيانة حاجز الدم في الدماغ خلال مراحل متعددة من تطور دروسوفيليا. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لدراسة نفاذية الحواجز الأخرى، مثل ظهارة المعوية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم وظيفة حاجز الدم في الدماغ في الأنسجة الحية.العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، حيث أن معالجة العينات قد تكون صعبة وتتطلب العديد من الخطوات الانتباه إلى التفاصيل. لجمع الأجنة مكان ما لا يقل عن 50 الإناث العذراء مع 20 إلى 25 الذكور في زجاجة مع الذرة وجبة أجار الغذاء واحتضان هذه الذباب لمدة يوم إلى يومين قبل بدء المجموعات. في اليوم السابق لجمع، وصحائح عصير التفاح الدافئة أجار في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي نقل الذباب المهذب ثاني أكسيد الكربون إلى قفص جمع ووضع قبل تسخين عصير التفاح أجار لوحة مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة على الطرف المفتوح من القفص. ثم تأمين لوحة إلى القفص مع الأكمام الحمراء. لمسح الأجنة القديمة، والسماح للذباب لوضع البيض على طبق عصير التفاح أجار لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، عكس الجانب شبكة قفص أسفل والاستفادة من الذباب إلى أسفل القفص. استبدال عصير التفاح أجار مع جديد قبل الدافئة عصير التفاح أجار لوحة مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة. السماح للذباب لوضع البيض على لوحة جديدة لمدة ساعة أخرى في 25 درجة مئوية.لجمع أواخر المرحلة 17 أجنة للحقن، استبدال لوحة عصير التفاح أجار مع لوحة جديدة قبل الدفء مع مسحة من معجون الخميرة. والسماح للذباب لوضع البيض على لوحة في 25 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، استبدل الطبق وعمره بالأجنة التي تم جمعها لمدة 19 ساعة عند 25 درجة مئوية بحيث يكون عمر الأجنة من 20 إلى 21 ساعة في وقت التصوير.في نهاية الحضانة لمدة 19 ساعة ، قم بإزالة لوحة جمع الأجنة من الحاضنة وتغطي سطح اللوحة بـ PbTx. استخدم فرشاة طلاء لتخفيف الأجنة من سطح اللوحة إلى مصفاة شبكة نايلون 70 ميكرومتر. ووضع المصفاة مع الأجنة في محلول تبييض 50٪في طبق بيتري 100 ملليمتر لمدة خمس دقائق مع الانفعالات في بعض الأحيان في درجة حرارة الغرفة لتقتيحها.في نهاية الحضانة ، شطف الأجنة ثلاث مرات عن طريق تدوير المصفاة في PbTx الطازجة ، وذلك باستخدام طبق بيتري جديد لكل غسل. غسل الأجنة إلى جانب واحد من مصفاة مع PbTx واستخدام ماصة زجاجية لنقل الأجنة على لوح جل agarose 2٪. إزالة السائل الزائد مع ورقة مرشح.محاذاة ستة إلى ثمانية أجنة على لوح مع الخلفيات إلى اليمين والجانبين الظهرية التي تواجه والضغط بحزم على قطعة من الشريط على الوجهين الملصقة على شريحة على رأس الأجنة. ثم اضاح الأجنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة قبل تغطية العينات بزيت الهالوكربون. لجمع اليرقات ، قم بإعداد صليب مع 5 إلى 10 ذباب أنثى عذراء من النوع الجيني المطلوب ونصف عدد الذكور من النمط الجيني المطلوب في قارورة مع طعام كورند اجار.بعد خمسة إلى سبعة أيام في 25 درجة مئوية ، اعتمادا على النمط الجيني ، واستخدام ملقط لجمع بلطف تجول اليرقات الثالثة من القارورة وشطف اليرقات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي طعام عالق. نقل اليرقات إلى طبق عصير التفاح agar لgenotyping حسب الضرورة قبل استخدام فرشاة الطلاء لتجفيف اليرقات على الأنسجة. ثم استخدم ملقط لنقل ست إلى ثماني يرقات إلى شريحة معدة بشريط مزدوج الوجه.قبل الحقن، استخدم جرة ميكروبيبيت لسحب أنابيب الشعيرات الدموية إلى شكل إبرة قياسية لحقن D.Melanogaster ورسو الإبر في الطين في طبق بيتري. لحقن الجنين، استخدم 20 ميكرولتر هلام تحميل ماصة تلميح لتحميل إبرة معدة مع 5 ميكرولترات من 10 كيلودالون dextran مترافق إلى sulforhodamine 101 كلوريد حمض وتحميل الإبرة في حامل إبرة. ضع الإبرة في ميكرو مانانيبولاتور مضمونة إلى قاعدة فولاذية وتعيين جهاز الحقن إلى 50 رطلًا في البوصة المربعة و5 إلى 10 مللي ثانية مع نطاق 10.ضع الشريحة على مرحلة micromanipulator وفرشاة حافة الإبرة ضد حافة الشريط على الوجهين في زاوية 45 درجة لخلق طرف زاوية قليلا مكسورة فقط بما يكفي للسماح تدفق dextran 10 كيلودالون من خلال فتح. ضخ دواسة القدم حتى الصبغة في طرف الإبرة. محاذاة الإبرة بحيث تكون متوازية مع الجنين وثقب الطرف الخلفي للعينة.ضخ دواسة القدم لحقن اثنين من نانولترات من صبغ في العينة. لاحظ وقت الحقن لأغراض الحضانة والاستمرار في أسفل الشريحة لحقن عينات إضافية. لحقن اليرقات، جعل فتحة الزاوية أكبر قليلا من تلك التي تستخدم لحقن الأجنة وزاوية الإبرة قليلا إلى أسفل نحو العينة قبل حقن اليرقات مع 220 نانولترات مماثلة لما هو موضح للعينات الجنينية.في نهاية حضانة الحقن لمدة 10 دقائق ، استخدم قضيبًا مقلوبًا من القطن لتطبيق الهلام البترولي على الجانبين الأيمن والأيسر للعينات على الشريحة كمسافة. ضع الغطاء على القمة وضعه على مرحلة المجهر confocal. حدد الهدف 20X وصورة العينات في جميع أنحاء عمق كل جنين.ثم حساب النسبة المئوية للعينات مع حاجز الدم في الدماغ للخطر وفقا للصيغة. قبل البدء في إجراء التشريح ، استخدم طلاء الأظافر لتركيب زلتين تغطيتين متباعدتين تقريبًا 0.5 سنتيمترًا على شريحة ووضع يرقة حقن في PBS على الشريحة في نهاية الحضانة لمدة 30 دقيقة. باستخدام زوج واحد من ملقط، فهم اليرقة في منتصف الطريق أسفل الجسم اليرقة واستخدام زوج ثان من ملقط لفصل النصفين الأمامي والخلفي من اليرقة.بعد ذلك، استخدم زوجاً واحداً من ملقط لقبضة المنطقة الأمامية على خطاطيف الفم واستخدم الزوج الثاني من ملقط لعكس جدار الجسم على طرف أول زوج من ملقط. المخ والحبل العصبي البطني سيُكشفان فصل الدماغ والحبل العصبي البطني من جدار الجسم عن طريق قطع الأعصاب إذا لزم الأمر وإزالة جدار الجسم من الشريحة.تغطية العينة مع 10 ميكرولترات من 80٪ الجلسرين. ثم ضع زلة غطاء فوق العينة للتصوير وصورة العينات لتحديد النسبة المئوية للعينات التي بها حاجز دموي مخترق كما هو موضح. عندما يتم حقن نوع البرية المرحلة المتأخرة 17 مع 10 كيلودالون ديكستران مترافق إلى sulforhodamine 101 حمض كلوريد صبغة الفلورسنت، يتم استبعاد جزيء ديكستران كبيرة من الحبل العصبي البطني، كما هو متوقع.هيتروزيجوس الخام 1 الأجنة متحولة يحمل حاجز الدم في الدماغ سليمة، على غرار تلك التي لوحظت في أنواع البرية السيطرة على الأجنة. في المقابل، تظهر الأجنة المتحولة المهووسة 1 عيوبًا في سلامة حاجز الدم في الدماغ، مع تدفق ديكستران 10 كيلودالتون في الحبل العصبي البطني، مما يشير إلى فشل حاجز الدم في الدماغ في التشكل. في عينات اليرقات من النوع البري ، يفشل 10 كيلودالون ديكستران في اختراق حاجز الدم في الدماغ ويتم استبعاده من الدماغ والحبل العصبي البطني.عند محاولة هذا الإجراء، الشيخوخة السليمة للأجنة أمر بالغ الأهمية لضمان فحص العينات في سن التي من المتوقع أن تكون كاملة تشكيل حاجز الدم في الدماغ. بعد هذا الإجراء، يمكن زيادة دراسة المسوخ الذين يظهرون حاجزًا دمويًا مخترقًا باستخدام علم الوراثة والكيمياء المناعية والمجهر لفهم وظيفة الجينات على المستوى الخلوي بشكل أفضل. وستتيح هذه التقنية للباحثين تحديد جينات إضافية تعتبر حاسمة لإنشاء وصيانة حاجز الدم في الدماغ.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...