Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. F. Bryan Pickett og Dr. Rodney dale for brug af udstyr til injektion. Dette arbejde blev finansieret af forskningsmidler fra Loyola University Chicago til M.D., D.T. og J.J.

1. indsamling af prøver
<ol><li>Embryo indsamling
	<ol><li>I hvert embryoopsamlings bur skal du bruge mindst 50 jomfru hunner med 20 − 25 hanner til samlinger. Inkuber disse fluer i en flaske med cornmeal-agar-mad (tabel over materialer) i 1 − 2 dage før påbegyndelse af samlinger23. Bemærk: Flere fluer kan bruges, men forholdet mellem kvinder og mænd skal holdes på 2:1.</li>
		<li>Varm æblesaft agar plader (tabel 1...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

Denne protokol giver en omfattende beskrivelse af de nødvendige skridt til at assay for BBB integritet under de sene embryonale og tredje INSTAR larvestadier af D. melanogaster udvikling. Lignende tilgange er blevet beskrevet andetsteds for at assay integriteten af BBB under udvikling, samt i voksne etaper5,7,29,30. Men beskrivelser af procedurer i materialer og metoder sektioner er o...

Under udvikling, celle-celle kommunikation og interaktioner er afgørende for etableringen af væv og organ struktur og funktion. I nogle tilfælde, disse celle-celle interaktioner forsegle organer fra det omgivende miljø for at sikre korrekt organfunktion. Dette er tilfældet for nervesystemet, som er isoleret af blod-hjerne barrieren (BBB). Dysfunktion af BBB i mennesker har været forbundet med neurologiske lidelser, herunder epilepsi, og nedbrydning af barrieren er blevet observeret i neurodegenerative sygdomme, herunder multipel sklerose og Amyotrofisk lateral sklerose1. I pattedyr dannes BBB af stramme kryds mellem endotelceller2,3. Andre dyr, herunder frugtflue, Drosophila melanogaster, har en BBB sammensat af gliale celler. Disse gliale celler danner en selektivt gennemtrængelig barriere for at kontrollere bevægelser af næringsstoffer, affaldsprodukter, toksiner og store molekyler ind og ud af nervesystemet4. Dette giver mulighed for vedligeholdelse af den elektrokemiske gradient er nødvendig for brand aktionspotentialer, giver mulighed for mobilitet og koordination4. I D. melanogaster, den glia beskytte nervesystemet fra den kalium-rige, blod-lignende hemolymph5.
I centralnervesystemet (CNS) og perifere nervesystem (PNS) af D. melanogaster, to udvendige gliale lag, subperineurial glia og perineurial glia, samt et ydre netværk af ekstracellulære matrix, neurale lamella, danner hemolymph-hjerne og hemolymph-nerve barriere6, benævnt BBB i hele denne artikel. Under udvikling subperineurial glia bliver polyploide og forstørre at omgive nervesystemet5,6,7,8,9,10,11 . Den subperineurial glia form septate knude, som giver den vigtigste diffusions barriere mellem hemolymph og nervesystemet5,6,12. Disse vejkryds ligner i molekylært de septat-lignende vejkryds, der findes ved paranoderne af myelinating glia hos hvirveldyr, og de udfører samme funktion som stramme kryds i BBB af pattedyr13,14, 15 , 16 , 17. perineurial glia dividerer, vokser og ombrydes omkring subperineurial glia for at regulere spredningen af metabolitter og store molekyler6,10,18,19. BBB formation er færdig med 18,5 h efter æglægning (AEL) ved 25 °c5,5. Tidligere undersøgelser har identificeret gener, der er kritiske regulatorer af BBB formation20,21,22. For bedre at forstå de nøjagtige roller af disse gener, er det vigtigt at undersøge effekten af mutation af disse potentielle lovgivere på BBB integritet. Mens tidligere undersøgelser har skitseret tilgange til bestemmelse BBB integritet i embryoner og larver, en omfattende protokol for denne analyse er endnu ikke beskrevet5,7. Denne trin-for-trin protokol beskriver metoder til at bestemmelse BBB integritet under D. melanogaster embryonale og tredje INSTAR larvestadier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

Korrekt nervesystem udvikling omfatter dannelsen af blod-hjerne barrieren, diffusions barriere, der stramt regulerer adgangen til nervesystemet og beskytter neurale væv fra toksiner og patogener. Defekter i dannelsen af denne barriere er blevet korreleret med neuropatier, og nedbrydningen af denne barriere er blevet observeret i mange neurodegenerative sygdomme. Derfor er det afgørende at identificere de gener, der regulerer dannelsen og vedligeholdelsen af blod-hjerne barrieren for at identificere potentielle terapeutiske mål. For at forstå de nøjagtige roller disse gener spiller i neurale udvikling, er det nødvendigt at assay virkningerne af ændret Gen ekspression på integriteten af blod-hjerne barrieren. Mange af de molekyler, der fungerer i etableringen af blod-hjerne barrieren er blevet fundet at være bevaret på tværs af eukaryote arter, herunder frugtflue, Drosophila melanogaster. Frugt fluer har vist sig at være et glimrende model system til at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer nervesystemets udvikling og funktion. Denne protokol beskriver en trin-for-trin procedure til assay for blod-hjerne barriere integritet under embryonale og larvestadier af D. melanogaster udvikling.

Metoderne beskrevet her giver mulighed for visualisering af integriteten af BBB i hele CNS i D. melanogaster embryoner og larver (figur 1). Ved afslutningen af BBB dannelse i slutningen af embryogenese, BBB funktioner til at udelukke store molekyler fra hjernen og VNC5. Denne protokol udnytter denne funktion til at assay BBB formation. Når Wild-type (Oregon R) sent stadie 17 (20 − 21 h gamle) embryoner blev injiceret med 10 kDa dextran konjugeret til sulfo...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blod-hjerne barrieren integritet er afgørende for nervesystemet funktion. I Drosophila melanogasterdannes blod-hjerne barrieren af gliale celler under den sene embryogenesis. Denne protokol beskriver metoder til analyse af dannelse og vedligeholdelse af blod-hjerne barrieren i D. melanogaster embryoner og tredje INSTAR larver.

Assay for blod-hjerne barriere integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål vedrørende den genetiske regulering af dannelsen og vedligeholdelsen af blod - hjerne barrieren i flere faser af drosophila udvikling. Denne metode kan også tilpasses til at undersøge permeabilitet af andre barrierer, ligesom tarmepitel i en række forskellige organismer. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for evaluering af blod - hjerne barrieren funktion i levende væv.Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da prøvemanipulationerne kan være vanskelige, og mange trin kræver stor opmærksomhed på detaljer. For embryo indsamling sted mindst 50 jomfru hunner med 20 til 25 hanner per flaske med Corn Meal Agar mad og inkubere disse fluer i en til to dage før du begynder samlingerne. Dagen før samlingen, varm æblejuice agar plader ved 25 grader Celsius natten over.Den næste morgen overføre kuldioxid bedøvet fluer til en samling bur og placere en forvaryret æblesaft agar plade med en lille udstrygning af gær pasta på den åbne ende af buret. Fastgør derefter pladen til buret med det røde ærme. For at rydde ældre embryoner, lad fluerne at lægge æg på en æblesaft agar plade i en time ved 25 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen vendes burmasken nedad, og fluerne bankes ned til bunden af buret. Udskift æblesaft agar med en ny forvard æblesaft agar plade med en lille smøre af gær pasta. Lad fluerne lægge æg på den nye tallerken i endnu en time ved 25 grader Celsius.For at indsamle sene fase 17 embryoner til injektion, erstatte æblesaft agar plade med en ny forvarmet plade med en udstrygning af gær pasta. Og lad fluerne lægge æg på tallerkenen ved 25 grader Celsius. Efter en time, erstatte pladen og alder pladen med indsamlede embryoner i 19 timer ved 25 grader Celsius, således at embryonerne vil være 20 til 21 timer gammel på tidspunktet for billeddannelse.Ved udgangen af 19 timers inkubation fjernes embryosamlingspladen fra inkubatoren og dække pladens overflade med PbTx. Brug en pensel til at løsne embryonerne fra pladeoverfladen til en 70 mikrometer nylonnets si. Og læg sien med embryoner i 50% blegemiddel opløsning i en 100 millimeter petriskål i fem minutter med lejlighedsvis omrøring ved stuetemperatur for at dechorionate dem.Ved inkubationens afslutning skylles embryonerne tre gange ved at hvirvle siven i frisk PbTx ved hjælp af en ny petriskål til hver vask. Pust embryonerne til den ene side af sivetten med PbTx, og brug en glaspipette til at overføre embryonerne til en 2% agarosegelplade. Fjern den overskydende væske med filterpapir.Juster seks til otte embryoner på pladen med de bageste til højre og dorsale sider vender opad og fast tryk et stykke dobbeltsidet tape fastgjort til et dias på toppen af embryoner. Derefter udtørre embryonerne ved stuetemperatur i ca 25 minutter, før de dækker prøverne med Halocarbon olie. For larve samling, oprette et kors med 5 til 10 jomfru kvindelige fluer af den ønskede genotype og halvt så mange mænd af den ønskede genotype i et hætteglas med Cornmeal Agar mad.Efter fem til syv dage ved 25 grader Celsius, afhængigt af genotype, bruge anrektrene til forsigtigt at indsamle vandrende tredje instar larver fra hætteglasset og skyl larverne med PBS at fjerne eventuelle fast mad. Overfør larverne til en æblesaft agar plade til genotypebestemmelse efter behov, før du bruger en pensel til at tørre larverne på et væv. Brug derefter antævnt til at overføre seks til otte larver til et dias forberedt med dobbeltsidet tape.Før injektionen, skal du bruge en mikropipette puller til at trække kapillær rør i en standard nål form for D.Melanogaster injektioner og forankre nåle i ler i en petriskål. Til embryo injektion, bruge en 20 mikroliter gel-loading pipette spids til at indlæse en forberedt nål med 5 mikroliter af 10 kilodalton dextran konjugeret til sulforhodamin 101 syre chlorid og indlæse nålen i en nål holder. Placer nålen i en mikromanipulator fastgjort til en stålbase og sæt indsprøjteapparatet til 50 pund pr. kvadrattomme og 5 til 10 millisekunder med en rækkevidde på 10.Placer diaset på mikromanipulatorfasen, og børst nålens kant mod kanten af det dobbeltsidede bånd i en vinkel på 45 grader for at skabe en let vinklet spids, der er brudt lige nok til at tillade strøm af de 10 kilodalton dextran gennem åbningen. Pump fodpedalen, indtil farvestoffet er på spidsen af nålen. Juster nålen, så den er parallel med embryonet, og punkter den bageste ende af prøven.Pump fodpedalen for at indsprøjte to nanoliter af farvestof i prøven. Bemærk injektionstidstidssætningen til inkubationsformål, og fortsæt ned ad rutsjebanen for at injicere yderligere prøver. Ved injektion af larve foretages en lidt større vinklet åbning end den, der anvendes til injektion af embryoner, og nålen vinkles lidt nedad mod prøven, før larverne indsprøjtes med 220 nanoliter svarende til det, der er påvist for embryonale prøver.I slutningen af 10 minutters injektion inkubation, bruge en bomuld tippet applikator til at anvende vaseline på højre og venstre side af prøverne på diaset som en spacer. Placer dækslet øverst, og placer slidet på konfokale mikroskoptrin. Vælg 20X mål og billede prøverne i hele dybden af hvert foster.Derefter beregne procentdelen af prøver med en kompromitteret blod - hjerne barriere i henhold til formlen. Før dissektionsproceduren påbegyndes, skal du bruge neglelak til at montere to dækslider med ca. 0,5 centimeter fra hinanden på et dias og placere en injiceret larve i PBS på diaset i slutningen af 30 minutters inkubation. Brug et par fortætninger, tag fat i larven halvvejs ned i larvekroppen og brug et andet par kraftvipper til at adskille larvernes forreste og bageste halvdele.Brug derefter et par kraftbefæstet til at gribe den forreste region ved mundkrogene og bruge det andet par kraftbefæstet til at vende kroppens væg over spidsen af det første par kraftvænbåndser. Hjernen og ventrale nerve ledning vil blive udsat. Adskære hjernen og ventrale nerveledning fra kroppen væggen ved at afskære nerver, hvis det er nødvendigt, og fjern kroppen væggen fra diaset.Prøven dækkes med 10 mikroliter på 80% glycerol. Derefter placere et dæksel slip på toppen af prøven for billeddannelse og billede prøverne til at bestemme procentdelen af prøver med en kompromitteret blod - hjerne barriere som påvist. Når vilde type sene fase 17 embryoner injiceres med 10 kilodalton dextran konjugeret til sulforhodamin 101 syrechlorid fluorescerende farvestof, den store dextran molekyle er udelukket fra ventrale nerve ledning, som forventet.Heterozygode rå 1 mutant embryoner udviser en intakt blod - hjerne barriere, svarende til den, der observeres i vilde type kontrol embryoner. I modsætning hertil udviser homozygot rå 1 mutant embryoner defekter i integriteten af blod - hjerne barrieren, med 10 kilodalton dextran oversvømmelser i ventrale nerveledning, hvilket indikerer en svigt af blod - hjerne barrieren til at danne. I vilde type kontrol larve prøver, 10 kilodalton dextran undlader at trænge ind i blod - hjerne barrieren og er udelukket fra hjernen og ventrale nerveledning.Ved forsøg på denne procedure, korrekt ældning af embryoner er afgørende for at sikre prøverne undersøges i en alder, hvor blod - hjerne barrieren dannelse forventes at være komplet. Efter denne procedure, mutanter udviser en kompromitteret blod - hjerne barriere kan fremmes undersøgt ved hjælp af genetik, immunohistokæmi, og mikroskopi til bedre at forstå genfunktion på celleniveau. Denne teknik vil gøre det muligt for forskere at identificere yderligere gener, der er afgørende for etablering og vedligeholdelse af blod - hjerne barrieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse blodlegemer befolkninger i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Opdræt bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axeniske og gnotobiotiske Betingelser

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generation af en menneskelig iPSC-baseret blod-hjerne barrierchip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Hele Animal Imaging af Drosophila melanogaster ved hjælp af microcomputed tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Live-celle billeddannelse af Drosophila melanogaster tredje stjerne larvehjerner

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...