Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

המחברים מודים לד ר פ. בריאן פיקט וד ר רודני דייל לשימוש בציוד להזרקה. עבודה זו ממומנת על ידי מימון מחקר מאוניברסיטת לויולה שיקגו ל-md, D.T., ו-ג'יג'י

1. אוסף דגימות
<ol><li>אוסף עובר
	<ol><li>בכל כלוב של אוסף העובר, השתמש במינימום של 50 נקבות בתולה עם 20-25 זכרים לגבייה. מודיית אלה זבובים בבקבוק עם אוכל תירס-אגר מזון (שולחן חומרים) עבור 1 על 2 ימים לפני תחילת אוספים23. הערה: ניתן להשתמש בזבובים נוספים, אך יש לש?...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של השלבים הדרושים לטיפול בשלמות BBB במהלך שלבי הזחל המאוחרים והשלישי של התפתחות D. מלאנוגסטר . גישות דומות תוארו במקום אחר כדי לקיים את שלמות bbb במהלך הפיתוח, כמו גם למבוגרים בשלבים5,7,29,30. ע?...

במהלך הפיתוח, תקשורת תא תא ואינטראקציות הן קריטיות להקמת מבנה רקמות ואיברים ותפקוד. במקרים מסוימים, אינטראקציות תא תא אלה ממקכבות איברים מהסביבה הסובבת כדי להבטיח את תפקוד האיברים התקין. זהו המקרה של מערכת העצבים, אשר מבודדת על ידי מכשול הדם-מוח (BBB). תפקוד של BBB בבני אדם נקשר הפרעות נוירולוגיות כולל אפילפסיה, ואת התמוטטות של המכשול נצפתה מחלות נוירוניווניות כולל טרשת נפוצה amyotrophic לרוחב1. ב יונקים, bbb נוצר על ידי הצמתים הדוקים בין תאים אנדותל2,3. בעלי חיים אחרים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוסטר, יש bbb מורכב מתאי גלאל. אלה תאים גליה טופס מכשול חדיר סלקטיבי לשלוט בתנועה של חומרים מזינים, פסולת מוצרים, רעלים, ומולקולות גדולות לתוך ומתוך מערכת העצבים4. הדבר מאפשר שמירה על מעבר אלקטרוכימי הנחוץ לירי בפוטנציאל הפעולה המאפשר ניידות ותיאום4. ב D. melanogaster, the glia להגן על מערכת העצבים מן האשלגן עשיר, כמו דם המוליקמ5.
במערכת העצבים המרכזית (cn) ומערכת העצבים ההיקפית (היקפית) של D. melanogaster, שתי שכבות גליה החיצוני, את subperineurial glia ואת perineurial glia, כמו גם רשת חיצונית של מטריצה החילוץ, הנוירולה העצבי, הטופס המוליקמ-המוח המוליש-מחסום העצב6, המכונה bbb לאורך מאמר זה. במהלך פיתוח subperineurial glia להיות פוליפואיד ולהגדיל כדי להקיף את מערכת העצבים5,6,7,8,9,10,11 . הצמתים subperineurial glia טופס septate, אשר מספקים את מכשול הדיפוזיה העיקרי בין המוליקמ ומערכת העצבים5,6,12. הצמתים הללו דומים מאוד לצמתים בעלי החוליות הדומות, שנמצאו בפרפודות של המייאלוציה של גליה, והוא מבצע את אותו התפקיד כצמתים הדוקים ב-bbb של יונקים13,14, מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. perineurial glia הפער, לגדול, ולעטוף סביב subperineurial glia כדי לווסת את הדיפוזיה של מטבוליטים ומולקולות גדולות6,10,18,19. היווצרות bbb הושלם על ידי 18.5 h לאחר הנחת ביצה (ח) ב -25 ° c5,8. מחקרים קודמים זיהו גנים כי הם הרגולטורים קריטיים של היווצרות bbb20,21,22. כדי להבין טוב יותר את התפקידים המדויקים של גנים אלה, חשוב לבחון את ההשפעה של מוטציה של הרגולטורים הפוטנציאליים האלה על שלמות BBB. בעוד שמחקרים קודמים מתארים גישות למתן שלמות bbb בעוברים ובזחלים, פרוטוקול מקיף לצורך שיטת מחקר זו טרם תואר5,7. פרוטוקול זה, שלב אחר שלב, מתאר שיטות לגבי שלמות BBB במהלך שלבי הזחל העובריים והשלישי של מלאנוגסטר .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

התפתחות מערכת העצבים הנכונה כוללת את היווצרות מכשול הדם-מוח, מכשול הדיפוזיה המסדיר את הגישה למערכת העצבים ומגן על רקמת העצבים מפני רעלים ופתוגנים. פגמים בהיווצרות מכשול זה היו מתואמים neuropathies, ואת התמוטטות של מכשול זה נצפתה במחלות ניווניות רבות. לכן, חיוני לזהות את הגנים המסדירים את היווצרות והאחזקה של מחסום הדם-מוח כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להבין את התפקידים המדויקים גנים אלה לשחק בהתפתחות העצבית, יש צורך לעבד את ההשפעות של ביטוי גנים שונה על השלמות של מכשול המוח בדם. רבים מהמולקולות הפועלות בהקמת המכשול ממוח הדם נמצאו להיות שמרו על פני מינים איקריוטית, כולל זבוב הפירות, drosophila ילה מלאנוגסטר. זבובי פירות הוכחו כמערכת מודל מצוינת לבדיקת המנגנונים המולקולריים המסדירים פיתוח ותפקוד של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר הליך צעד-אחר-צעד לצורך שלמות מכשול המוח בדם במהלך השלבים העובריים והזחל של ד. מלאנוגסטר פיתוח.

השיטות המתוארות כאן מאפשרות הדמיה של שלמות BBB ברחבי ה-CN ב D. מלאנוגסטר עוברים וזחלים (איור 1). עם השלמת היווצרות BBB בסוף embryogenesis, פונקציות BBB להוציא מולקולות גדולות מהמוח ו VNC5. פרוטוקול זה מנצל פונקציה זו כדי לאשר את היווצרות BBB. כאשר פראי סוג (אורגון R) בשלב מאוח...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הרגולציה הגנטית של היווצרות ותחזוקה של מחסום הדם - מוח במהלך שלבים מרובים של התפתחות דרוסופילה. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת כדי לבחון את החדרות של מחסומים אחרים, כמו אפיתל המעי במגוון אורגניזמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של תפקוד מחסום הדם - מוח ברקמות חיות.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו מניפולציות מדגם יכול להיות קשה צעדים רבים דורשים תשומת לב רבה לפרטים. עבור איסוף עוברים מקום מינימום של 50 נקבות בתולה עם 20 עד 25 זכרים לבקבוק עם מזון ארוחה תירס אגר דגירה זבובים אלה במשך יום עד יומיים לפני תחילת האוספים. יום לפני הקולקציה, מיץ תפוחים חם אגר צלחות ב 25 מעלות צלזיוס לילה.למחרת בבוקר להעביר את זבובים הרדמה פחמן דו חמצני לכלוב איסוף ולה מניחים צלחת אגר מיץ תפוחים מחומם מראש עם כתם קטן של משחת שמרים בקצה הפתוח של הכלוב. ואז לאבטח את הצלחת לכלוב עם השרוול האדום. כדי לנקות עוברים ישנים יותר, לאפשר זבובים להטיל ביצים על צלחת אגר מיץ תפוחים במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, הפוך את צד רשת הכלוב כלפי מטה והקש על הזבובים לתחתית הכלוב. החלף את אגר מיץ תפוחים עם צלחת חדשה מראש מיץ תפוחים אגר עם כתם קטן של משחת שמרים. אפשר לזבובים להטיל ביצים על הצלחת החדשה למשך שעה נוספת ב-25 מעלות צלזיוס.כדי לאסוף בשלב מאוחר 17 עוברים להזרקה, להחליף את צלחת אגר מיץ תפוחים עם צלחת חדשה מראש מחומם עם כתם של משחת שמרים. ולאפשר לזבובים להטיל ביצים על הצלחת ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, להחליף את הצלחת גיל הצלחת עם עוברים שנאספו במשך 19 שעות ב 25 מעלות צלזיוס, כך העוברים יהיו 20 עד 21 שעות בזמן ההדמיה.בסוף הדגירה של 19 שעות, להסיר את צלחת איסוף העובר מהאינקובטור ולכסות את פני השטח של הצלחת עם PbTx. השתמש במברשת צבע כדי לשחרר את העוברים מפני השטח של הלוח לתוך מסננת רשת ניילון 70 מיקרומטר. ומציבים את המסננת עם עוברים בתספורת אקונומיקה של 50% בצלחת פטרי של 100 מילימטר במשך חמש דקות עם תסיסה מזדמנת בטמפרטורת החדר כדי לפענח אותם.בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים שלוש פעמים על ידי מערבולת מסננת PbTx טרי, באמצעות צלחת פטרי חדשה עבור כל לשטוף. לשטוף עוברים לצד אחד של מסננת עם PbTx ולהשתמש פיפטה זכוכית להעביר את העוברים על לוח ג'ל 2% agarose. הסר את הנוזל העודף עם נייר סינון.יישר שישה עד שמונה עוברים על הלוח עם האחוריים מימין ואת הצדדים הגביים פונים כלפי מעלה ולחץ בחוזקה על פיסת קלטת דו צדדית מודבקת על שקופית על גבי העוברים. לאחר מכן לתעב את העוברים בטמפרטורת החדר במשך כ 25 דקות לפני כיסוי הדגימות עם שמן Halocarbon. עבור אוסף זחל, להקים צלב עם 5 עד 10 זבובים נקבה בתולה של הגנוטיפ הרצוי וחצי זכרים רבים של הגנוטיפ הרצוי בקבוקון עם מזון קמח תירס אגר.לאחר חמישה עד שבעה ימים ב 25 מעלות צלזיוס, בהתאם לגנוטיפ, להשתמש במקלפים כדי לאסוף בעדינות זחלים instar השלישי נודד מן הבקבוקון ולשטוף את הזחלים עם PBS כדי להסיר כל מזון תקוע. מעבירים את הזחלים לצלחת אגר מיץ תפוחים לגנוטיפינג לפי הצורך לפני השימוש במברשת צבע לייבוש הזחלים על רקמה. לאחר מכן השתמש במדפים כדי להעביר שישה עד שמונה זחלים לשקופית מוכנה עם קלטת דו צדדית.לפני ההזרקה, השתמשו במוציא מיקרופיפט כדי למשוך צינורות נימי לצורת מחט סטנדרטית לזריקות D.Melanogaster ועגנו את המחטים בחימר בצלחת פטרי. להזרקת עוברים, השתמשו בקצה פיפטה להעמסת ג'ל 20 מיקרוליטר כדי לטעון מחט מוכנה עם 5 מיקרוליטרים של 10 ק"ג דקסטרן מצומדים לסולפורהודאמין 101 חומצה כלוריד ולהעמיס את המחט לתוך מחזיק מחט. מקם את המחט במיקרומניפולטור מאובטח לבסיס פלדה והגדר את מנגנון ההזרקה ל-50 פאונד לאינץ' מרובע ו-5 עד 10 אלפיות שנייה עם טווח של 10.מניחים את השקופית על שלב micromanipulator ולהבריש את קצה המחט על קצה הסרט דו צדדי בזווית של 45 מעלות כדי ליצור קצה זוויתי מעט שבור רק מספיק כדי לאפשר זרימה של 10 דקסטרן קילודלטון דרך הפתח. לשאוב את דוושת הרגל עד הצבע הוא בקצה המחט. ליישר את המחט, כך שהוא מקביל עם העובר ולנקב את הקצה האחורי של הדגימה.לשאוב את דוושת הרגל כדי להזריק שני nanoliters של צבע לתוך הדגימה. שים לב לזמן ההזרקה למטרות דגירה והמשך במורד השקופית כדי להזריק דגימות נוספות. עבור הזרקת זחל, לעשות פתח זוויתי מעט גדול יותר מזה המשמש להזרקת עוברים זווית המחט מעט כלפי מטה לכיוון הדגימה לפני הזרקת הזחלים עם 220 nanoliters דומה כפי שהוכח עבור דגימות עובריות.בסוף הדגירה הזרקה 10 דקות, להשתמש במוליך כותנה הטה להחיל ג'לי נפט בצד ימין ושמאל של הדגימות על המחוון כמרחב. מקם את החלק העליון של המכסה והצב את השקופית על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. בחר את המטרה 20X ותמונה את הדגימות לאורך העומק של כל עובר.לאחר מכן לחשב את אחוז הדגימות עם מחסום דם - מוח בסכנה על פי הנוסחה. לפני תחילת הליך הניתוח, השתמש בלק כדי לטעון שתי תלושי כיסוי במים של כ- 0.5 ס"מ זה מזה על שקופית והצב זחל מוזרק ל- PBS במגלשה בסוף הדגירה של 30 דקות. באמצעות זוג אחד של ממטרות, לתפוס את הזחל באמצע הדרך במורד גוף הזחל ולהשתמש זוג שני של ממטרות להפריד את החצאים האחוריים של הזחל.לאחר מכן, השתמשו בזוג ממטרות אחד כדי לאחוז באזור האחורי של ווים בפה ולהשתמש בזוג המדפים השני כדי להפוך את קיר הגוף מעל קצה זוג המדפים הראשון. המוח וחוט העצב הגחון ייחשפו. הפרד את המוח ואת חוט העצב הגחון מקיר הגוף על ידי ניתוק העצבים במידת הצורך והסרה את קיר הגוף מהמגלשה.מכסים את הדגימה עם 10 מיקרוליטרים של 80% גליצרול. לאחר מכן מניחים תלוש כיסוי על גבי המדגם להדמיה ותמונה הדגימות כדי לקבוע את אחוז הדגימות עם מחסום דם - מוח בסכנה כפי שהוכח. כאשר סוג הבר בשלב מאוחר 17 עוברים מוזרקים עם 10 קילדלטון dextran מצומד סולפורהודאמין 101 חומצה כלוריד פלואורסצנטי צבע, מולקולת dextran גדולה נשללת חוט העצב הגחוני, כצפוי.עוברים מוטנטים גולמיים הטרוזיגים 1 מפגינים מחסום דם -מוח שלם, דומה לזה שנצפה בעוברים בקרת סוג בר. לעומת זאת, עוברים מוטנטים גולמיים הומוזגוגיים 1 מפגינים פגמים בשלמות מחסום הדם - מוח, כאשר 10 ק"ג דקסטרן מציף את חוט העצב הגחוני, מה שמצביע על כישלון מחסום הדם - מוח להיווצר. בדגימות זחל בקרת סוג בר, 10 קילדלטון dextran אינו מצליח לחדור את מחסום הדם - מוח והוא נשלל מן המוח ואת חוט העצב הגחוני.בעת ניסיון הליך זה, הזדקנות נאותה של העוברים היא קריטית כדי להבטיח את הדגימות נבדקות בגיל שבו היווצרות מחסום הדם - מוח צפוי להיות שלם. בעקבות הליך זה, ניתן לקדם מוטציות המציגות מחסום דם-מוח בסכנה באמצעות גנטיקה, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה כדי להבין טוב יותר את תפקוד הגנים ברמה התאית. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לזהות גנים נוספים הקריטיים להקמה ותחזוקה של מחסום הדם - מוח.

assay-for-blood-brain-barrier-integrity-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

הדמיה צמחי מוח חיים מזחלי Drosophila melanogaster זחלי Instar שלישי

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

מחבר Spotlight: Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila larval brain explants 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...