Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

저자는 주입을 위한 장비의 사용을 위한 박사 F. 브라이언 피켓 과 박사 로드니 데일 감사합니다. 이 작품은 로욜라 대학 시카고에서 M.D., D.T., J.J.에 연구 자금으로 지원되었다.

1. 견본의 수집
<ol><li>배아 수집
	<ol><li>각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23. 참고: 더 많은 파리를 사용할 수 있지만, 여성 대 남성 비율은 2:1로 유지되어야 합니다.</li>
		<li>미리 따뜻한...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

이 프로토콜은 D. 멜라노가스터 발달의 후기 배아 및 제3 의 유충 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적인 설명을 제공한다. 유사한 접근법은 성인5, 7,29,30뿐만아니라 개발 중에 BBB의 무결성을 분석하기 위해 다른 곳에서 기술되었다. 그러나 재료 및 방법 섹션의 절차에...

개발 하는 동안, 세포-세포 통신 및 상호 작용 조직 및 장기 구조 및 기능의 설립에 대 한 중요 한. 경우에 따라, 이러한 세포-세포 상호 작용 적절 한 장기 기능을 보장 하기 위해 주변 환경에서 장기를 밀봉. 이것은 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 절연된 신경계의 경우입니다. 인간에서 BBB의 기능 장애는 간질을 포함한 신경 질환에 연결되었으며, 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 관찰되었다1. 포유동물에서, BBB는 내피 세포2,3사이 단단한 접합에 의해 형성된다. 과일 플라이, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한 다른 동물들은 신경교 세포로 구성된 BBB를 갖는다. 이러한 신경교 세포는 영양분, 노폐물, 독소 및 신경계 안팎으로 큰 분자의 움직임을 제어하기 위해 선택적으로 투과성 장벽을 형성한다4. 이를 통해 동작 전위를 발사하는 데 필요한 전기 화학 그라데이션의 유지 보수가 가능하여 이동성 및 조정4. D. 멜라노가스터에서,glia는 칼륨이 풍부하고 혈액과 같은 혈림프5에서신경계를 보호합니다.
D. melanogaster의중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS), 2 개의 외부 신경교 층, subperineurial glia 및 perineurial glia, 외세포 질, 신경 라멜라의 외부 네트워크, 형성 hemolymph-뇌 및 hemolymph 신경 장벽6,이 문서 전반에 걸쳐 BBB라고. 개발 중 피각증 신경교는 polyploid되고 신경계를 둘러싸고 확대5,6,7,8,9,10,11 . 헤모 림프와 신경계 사이의 주요 확산 장벽을 제공하는 심층 신경 교향곡 형태5,6,12. 이러한 접합부는 척추동물에서 골수성 신경교의 파라노드에서 발견되는 격막과 유사한 접합부와 분자적으로 유사하며, 포유류13,14의BBB에서 단단한 접합부와 동일한 기능을 수행합니다. 15세 , 16세 , 17. 대사 산물과 큰 분자의 확산을 조절하기 위해 회음구 신경교를 나누고, 성장시키고, 감싸는6,10,18,19. BBB 형성은 25 °C5,8에서계란 누워 (AEL) 후 18.5 시간에 의해 완료된다. 이전 연구는 BBB형성20,21,22의중요한 조절자인 유전자를 확인했습니다. 이 유전자의 정확한 역할을 더 잘 이해하기 위하여는, BBB 무결성에 이 잠재적인 기계레이터의 돌연변이의 효력을 검토하는 것이 중요합니다. 이전 연구는 배아와 애벌레에 있는 BBB 무결성을 분석하기 위한 접근을 설명하는 동안, 이 분석법을 위한 포괄적인 프로토콜은 아직5,7을기술되지않았습니다. 이 단계별 프로토콜은 D. melanogaster 배아 및 제 3 instar 애벌레 단계 도중 BBB 무결성을 분석하는 방법을 기술합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

적절한 신경계 발달에는 혈액-뇌 장벽의 형성, 신경계에 대한 접근을 엄격하게 조절하고 신경 조직을 독소와 병원체로부터 보호하는 확산 장벽이 포함됩니다. 이 장벽의 형성에 있는 결점은 신경병증과 상관되었습니다, 이 방벽의 고장은 많은 신경 퇴행성 질병에서 관찰되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 혈액 두뇌 방벽의 대형 그리고 정비를 통제하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자가 신경 발달에서 하는 정확한 역할을 이해하기 위하여는, 혈액 두뇌 방벽의 무결성에 변경된 유전자 발현의 효력을 분석할 필요가 있습니다. 혈액-뇌 장벽의 확립에서 기능하는 많은 분자는 과일 파리, 초파리 멜라노가스터를포함한 진핵 종에 걸쳐 보존되는 것으로 밝혀졌다. 과일 파리는 신경계 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 검사하기위한 훌륭한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 발달의 배아 및 애벌레 단계 도중 혈액 두뇌 방벽 무결성을 위한 분석하는 단계별 절차를 기술합니다.

여기서 기재된 방법은 D. 멜라노가스터 배아 및 유충에서 CNS 전반에 걸쳐 BBB의 무결성의 가시화를 허용한다(도1). 늦은 배아 발생에서 BBB 형성이 완료되면, BBB는 뇌와 VNC5에서큰 분자를 배제하는 기능을 한다. 이 프로토콜은 BBB 형성을 분석하기 위해 이 기능을 활용합니다. 야생형(Oregon R) 후반기 17(20-21시간) 배아를 설포호다민 101산염료로 공액처리한 ...

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Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

이 방법은 drosophila 발달의 다중 단계 도중 혈액 두뇌 장벽의 형성 그리고 유지의 유전 규칙에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 또한 다양한 유기체에서 장 상피와 같은 다른 장벽의 투과성을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직에서 혈액 뇌 장벽 기능의 평가를 허용한다는 것입니다.샘플 조작이 어려울 수 있으며 많은 단계에서 세부 사항에 주의를 기울여야 하기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 배아 수집의 경우 옥수수 식사 Agar 음식과 병 당 20 ~ 25 수컷과 최소 50 처녀 여성을 배치하고 컬렉션을 시작하기 전에 1 ~ 2 일 동안이 파리를 배양. 컬렉션 전날, 따뜻한 사과 주스 한천 접시는 하룻밤 사이에 섭씨 25도입니다.다음 날 아침, 마취된 이산화탄소를 컬렉션 케이지로 옮기고 케이지의 열린 끝에 효모 페이스트의 작은 얼룩이 있는 미리 따뜻진 사과 주스 한천 접시를 놓습니다. 그런 다음 빨간색 소매로 케이지에 접시를 고정합니다. 오래된 배아를 지우려면 파리가 섭씨 25도에서 1시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 놓도록 하십시오.인큐베이션이 끝나면 케이지 메쉬 측면을 거꾸로 뒤집어 파리를 케이지 바닥으로 누릅니다. 사과 주스 한고를 새로운 미리 데운 사과 주스 한천 접시에 작은 효모 페이스트 얼룩으로 바꿉니다. 파리가 섭씨 25도에서 새로운 접시에 알을 낳을 수 있도록 하십시오.주사를 위해 늦은 단계 17 배아를 수집하려면 사과 주스 한천 판을 효모 페이스트 얼룩으로 새로운 미리 데운 접시로 교체하십시오. 그리고 파리가 섭씨 25도에서 접시에 알을 낳을 수 있도록 하십시오. 1 시간 후에, 배아가 화상 진찰시 20-21 시간 오래 될 수 있도록 25섭씨에서 19 시간 동안 수집된 배아로 접시와 나이를 대체하십시오.19시간 배양끝에 인큐베이터에서 배아 수집 판을 제거하고 PbTx로 플레이트 표면을 덮습니다. 그리고 배아를 가진 여과기를 100mm 페트리 접시에 5분간 놓고 실온에서 가끔 동요하여 비틀거림을 합니다.인큐베이션이 끝나면 신선한 PbTx에서 여과기를 소용돌이치며 각 세척에 새로운 페트리 접시를 사용하여 배아를 세 번 헹구십시오. 배아를 PbTx로 여과기의 한쪽으로 씻고 유리 파이펫을 사용하여 배아를 2% 아가로즈 젤 슬래브로 옮겨 보세요. 필터 용지로 여분의 액체를 제거합니다.슬래브에 6~8개의 배아를 오른쪽에 후방과 등쪽면이 위로 향하고 배아 위에 있는 슬라이드에 부착된 양면 테이프 조각을 단단히 누릅니다. 그런 다음 할로탄소 오일로 표본을 덮기 전에 약 25 분 동안 실온에서 배아를 담가합니다. 애벌레 컬렉션의 경우, 원하는 유전자형의 5~10처녀 암컷 파리와 콘밀 아가 음식과 유리병에 원하는 유전자형의 절반의 수컷으로 십자가를 설치합니다.유전자형에 따라 섭씨 25도에서 5~7일 후에는 집게를 사용하여 바이알에서 방황하는 세 번째 인스타 애벌레를 부드럽게 수집하고 PBS로 애벌레를 헹구어 붙어있는 음식을 제거하십시오. 애벌레를 사과 주스 한천 접시에 옮겨 필요에 따라 지노티핑을 한 후 페인트 브러시를 사용하여 조직에 유충을 말리십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 6-8 개의 애벌레를 양면 테이프로 준비된 슬라이드로 옮길 수 있습니다.주입 하기 전에, 마이크로 피펫 풀러를 사용 하 여 D.Melanogaster 주사에 대 한 표준 바늘 모양으로 모세관 튜브를 당기 고 페트리 접시에 점토에 바늘을 고정. 배아 주입의 경우 20 마이크로리터 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 10킬로달톤 디엑스트라5마이크로리터가 있는 준비된 바늘을 적재하여 설포호다민 101산 염화산염화물을 바늘 홀더에 적재하십시오. 바늘을 강철 베이스에 고정된 미세 조작기에 배치하고 주입 장치를 평방 인치당 50 파운드, 10의 범위로 5 ~ 10 밀리초로 설정합니다.마이크로 조작기 단계에 슬라이드를 놓고 바늘가장자리를 45도 각도로 양면 테이프의 가장자리에 브러시하여 개구부를 통해 10 킬로달톤의 흐름을 허용할 만큼 약간 각진 팁을 만듭니다. 염료가 바늘 끝에 놓일 때까지 발 페달을 펌프합니다. 바늘을 정렬하여 배아와 평행하게 하고 시편의 후면 끝을 뚫는다.발 페달을 펌핑하여 두 나노리터의 염료를 시편에 주입합니다. 인큐베이션 을 위해 주입 시간을 기록하고 슬라이드를 계속 하여 추가 표본을 주입하십시오. 애벌레 주사의 경우, 배아 시편에 입증된 것과 유사한 220 나노리터로 유충을 주입하기 전에 배아를 주입하고 바늘을 시편쪽으로 약간 아래쪽으로 각도로 사용하는 것보다 약간 더 큰 각개 구각을 한다.10분 주입 배비치가 끝나면 면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 슬라이드의 시료의 오른쪽과 왼쪽에 페트롤젤리를 스페이서로 적용합니다. 커버 슬립을 위에 놓고 슬라이드를 공초점 현미경 단계에 놓습니다. 20X 목표를 선택하고 각 배아의 깊이에 걸쳐 샘플을 이미지합니다.그런 다음 공식에 따라 손상된 혈액 뇌 장벽으로 샘플의 백분율을 계산합니다. 해부 절차를 시작하기 전에 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 약 0.5센티미터 간격의 두 개의 커버 슬립을 장착하고 주입 된 유충을 30 분 배큐베이션 끝에 슬라이드에 PBS에 넣습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레 몸의 중간쪽을 잡고 두 번째 포셉을 사용하여 애벌레의 앞쪽과 후방 반쪽을 분리합니다.다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 입 후크에서 전방 영역을 잡고 두 번째 봉구를 사용하여 첫 번째 집게 의 끝 위에 바디 벽을 반전시면 됩니다. 뇌와 복부 신경 코드가 노출됩니다. 필요한 경우 신경을 분리하여 뇌와 복부 신경 코드를 신체 벽에서 분리하고 슬라이드에서 신체 벽을 제거하십시오.80%의 글리세롤10마이크로리터로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 이미징을 위한 샘플 위에 커버 슬립을 배치하고 시료를 이미지하여 손상된 혈액-뇌 장벽이 있는 샘플의 백분율을 입증합니다. 야생형 후기 단계 17배아가 설포호다민 101산 염화형염으로 10킬로달톤 드엑스트라넨을 주입하면, 큰 단부 분자는 복부 신경코드에서 제외된다.이테로지구스 원시 1 돌연변이 배아는 야생 형 대조군 배아에서 관찰된 것과 유사한 온전한 혈액-뇌 장벽을 나타낸다. 대조적으로, homozygous 원시 1 돌연변이 태아는 혈액-뇌 장벽의 무결성에 결함을 전시, 와 함께 10 킬로달톤 dextran 복부 신경 코드에 홍수, 형성 하는 혈액-뇌 장벽의 실패를 나타내는. 야생 형 대조군 애벌레 샘플에서, 10 킬로달톤 dextran는 혈액 뇌 장벽을 관통하는 데 실패하고 뇌와 복부 신경 코드에서 제외됩니다.이 절차를 시도할 때, 태아의 적당한 노화는 혈액 두뇌 장벽 형성이 완료될 것으로 예상되는 나이에 견본이 검토되는지 확인하기 위하여 중요합니다. 이 절차에 따라, 손상된 혈액-뇌 장벽을 전시 하는 돌연변이 는 세포 수준에서 유전자 기능을 더 잘 이해 하기 위해 유전학을 사용 하 여 공부할 수 있습니다., 면역 조직 화학, 그리고 현미경 검사. 이 기술은 연구원이 혈액-두뇌 장벽의 설치 그리고 유지 를 위해 중요한 추가 유전자를 확인하는 것을 허용할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...