Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. F. Bryan Pickett og Dr. Rodney Dale for bruk av utstyr til injeksjon. Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler fra Loyola University Chicago til MD, D.T., og JJ

1. samling av prøver
<ol><li>Embryo samling
	<ol><li>I hvert oppsamlings bur for embryo bruker du minimum 50 jomfru hunner med 20 − 25 hanner for kolleksjoner. Ruge disse fluer i en flaske med cornmeal-agar mat (tabell av materialer) for 1 − 2 dager før begynnelsen av samlingene23. Merk: Flere fluer kan brukes, men kvinne-til-mann forholdet bør holdes på 2:1.</li>
		<li>Pre-Warm eple juice agar plater (tabell 1) ved 2...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av trinnene som trengs for å analysen for BBB integritet i slutten av embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling. Lignende tilnærminger har blitt beskrevet andre steder for å analysen integriteten til BBB under utvikling, samt i voksen etapper5,7,29,30. Men beskrivelser av prosedyrer i materialer ...

Under utvikling, celle-celle kommunikasjon og interaksjoner er avgjørende for etablering av vev og organ struktur og funksjon. I noen tilfeller, disse celle-celle interaksjoner forsegle organer fra omgivelsene for å sikre riktig organfunksjon. Dette er tilfelle for nervesystemet, som er isolert av blod-hjerne barriere (BBB). Dysfunksjon av BBB hos mennesker har vært knyttet til nevrologiske lidelser, inkludert epilepsi, og sammenbrudd av barrieren har blitt observert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert multippel sklerose og amyotrofisk lateral sklerose1. I pattedyr, BBB er dannet av stramme veikryss mellom endothelial celler2,3. Andre dyr, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster, har en BBB sammensatt av gliacellene celler. Disse gliacellene cellene danner en selektivt gjennomtrengelig barriere for å kontrollere bevegelse av næringsstoffer, avfallsprodukter, toksiner, og store molekyler inn og ut av nervesystemet4. Dette gjør det mulig for vedlikehold av elektrokjemiske gradient nødvendig å brann handling potensialer, slik at for mobilitet og koordinering4. I D. melanogaster, glia beskytte nervesystemet fra kalium-rik, blod-lignende hemolymph5.
I det sentrale nervesystemet (CNS) og perifere nervesystemet (PNS) av D. melanogaster, to ytre gliacellene lag, subperineurial glia og perineurial glia, samt et ytre nettverk av ekstracellulære matrise, den nevrale lamella, danner hemolymph-hjerne og hemolymph-nerve barriere6, referert til som BBB gjennom denne artikkelen. Under utvikling subperineurial glia bli polyploid og forstørre å omgi nervesystemet5,6,7,8,9,10,11 . Den subperineurial glia form septate veikryss, som gir den viktigste diffusjon barriere mellom hemolymph og nervesystemet5,6,12. Disse knutepunktene er Molecularly lik den septate-lignende veikryss funnet på paranodes av myelinating glia i virveldyr, og de utfører samme funksjon som stramme veikryss i BBB av pattedyr13,14, 15 priser og , 16 flere , 17. perineurial glia dividere, vokse, og vikle rundt subperineurial glia å regulere spredningen av metabolitter og store molekyler6,10,18,19. BBB formasjon er fullført ved 18,5 h etter egglegging (AEL) ved 25 ° c5,8. Tidligere studier har identifisert gener som er kritiske regulatorer av BBB formasjon20,21,22. For bedre å forstå de eksakte rollene til disse genene, er det viktig å undersøke effekten av mutasjon av disse potensielle regulatorer på BBB integritet. Mens tidligere studier har skissert tilnærminger for assaying BBB integritet i embryo og larver, en omfattende protokoll for denne analysen har ennå ikke beskrevet5,7. Denne trinn-for-trinn protokollen beskriver metoder for assaying BBB integritet under D. melanogaster embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

Riktig nervesystemet utvikling omfatter dannelsen av blod-hjerne-barriere, diffusjon barriere som tett regulerer tilgang til nervesystemet og beskytter nevrale vev fra toksiner og patogener. Defekter i dannelsen av denne barrieren har blitt korrelert med nevropatier, og nedbryting av denne barrieren har blitt observert i mange nevrodegenerative sykdommer. Derfor er det avgjørende å identifisere gener som regulerer dannelse og vedlikehold av blod-hjerne barriere å identifisere potensielle terapeutiske mål. For å forstå den eksakte rollene disse genene spiller i neural utvikling, er det nødvendig å analysen effekten av endrede genuttrykk på integriteten av blod-hjerne barriere. Mange av molekylene som fungerer i etableringen av blod-hjerne-barrieren har blitt funnet å være bevart over eukaryote arter, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster. Frukt fluer har vist seg å være et utmerket modell system for å undersøke den molekylære mekanismer som regulerer nervesystemet utvikling og funksjon. Denne protokollen beskriver en trinnvis fremgangsmåte for å analysen for blod-hjerne barriere integritet under den embryonale og larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling.

Metodene som er beskrevet her tillate for visualisering av integriteten til BBB hele CNS i D. melanogaster embryo og larver (figur 1). Ved ferdigstillelse av BBB formasjon i slutten av embryogenesis, den BBB funksjoner for å utelukke store molekyler fra hjernen og VNC5. Denne protokollen utnytter denne funksjonen til analysen BBB formasjon. Når vill-type (Oregon R) sent stadium 17 (20 − 21 h gammel) embryo ble injisert med 10 kDa dextran som ble bøyd til...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blod-hjerne barriere integritet er avgjørende for nervesystemet funksjon. I Drosophila melanogasterdannes blod-hjerne-barrieren av gliacellene celler i løpet av sen embryogenesis. Denne protokollen beskriver metoder for å analysen for blod-hjerne barriere dannelse og vedlikehold i D. melanogaster embryo og tredje skikkelsen larver.

Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om genetisk regulering av dannelsen og vedlikeholdet av blod-hjernebarrieren under flere stadier av drosophila utvikling. Denne metoden kan også tilpasses for å undersøke permeabiliteten til andre barrierer, som tarmepitelet i en rekke organismer. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater evaluering av blod-hjernebarrierefunksjonen i levende vev.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da prøvemanipulasjonene kan være vanskelige og mange trinn krever nøye oppmerksomhet på detaljer. For embryosamling plasserer du minst 50 jomfrukvinner med 20 til 25 menn per flaske med Corn Meal Agar-mat og inkubere disse fluene i en til to dager før samlingene begynner. Dagen før kolleksjonen, varm eplejuice agar plater på 25 grader Celsius over natten.Neste morgen overfører karbondioksidbedøvelsesfluene til et samlingsbur og plasserer en forvarmet eplejuice agarplate med et lite smør av gjærpasta på den åpne enden av buret. Fest deretter platen til buret med den røde ermet. For å fjerne eldre embryoer, la fluene legge egg på en eplejuice agarplate i en time ved 25 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, inverter burnettsiden ned og trykk fluene til bunnen av buret. Erstatt eplejuicegaren med en ny forvarmet eplejuice agarplate med et lite smør av gjærpasta. La fluene legge egg på den nye platen i en time til ved 25 grader Celsius.For å samle sent stadium 17 embryoer til injeksjon, erstatt eplejuice agar plate med en ny forvarmet plate med et smør av gjærpasta. Og la fluene legge egg på tallerkenen ved 25 grader Celsius. Etter en time, erstatt platen og alder platen med innsamlede embryoer i 19 timer ved 25 grader Celsius slik at embryoene vil være 20 til 21 timer gammel på tidspunktet for avbildning.På slutten av den 19 timers inkubasjonen, fjern embryooppsamlingsplaten fra inkubatoren og dekk overflaten av platen med PbTx. Bruk en pensel til å løsne embryoene fra plateoverflaten til en 70 mikrometer nylonnettsil. Og legg silen med embryoer i 50% blekemiddelløsning i en 100 millimeter petriskål i fem minutter med sporadisk agitasjon ved romtemperatur for å dedikere dem.På slutten av inkubasjonen, skyll embryoene tre ganger ved å virvle silen i fersk PbTx, ved hjelp av en ny petriskål for hver vask. Vask embryoer til den ene siden av silen med PbTx og bruk en glasspipette til å overføre embryoene til en 2% agarose gel skive. Fjern overflødig væske med filterpapir.Juster seks til åtte embryoer på platen med posteriors til høyre og dorsale sider vendt opp og trykk fast på et stykke dobbeltsidig tape festet til et lysbilde på toppen av embryoene. Tørk deretter embryoene ved romtemperatur i ca. 25 minutter før de dekker prøvene med Halokarbonolje. For larvesamling, sett opp et kors med 5 til 10 jomfrukvinnelige fluer av ønsket genotype og halvparten så mange menn av ønsket genotype i et hetteglass med Cornmeal Agar mat.Etter fem til syv dager ved 25 grader Celsius, avhengig av genotypen, bruk tang til å forsiktig samle vandrende tredje instar larver fra hetteglasset og skyll larver med PBS for å fjerne fast mat. Overfør larver til en eplejuice agarplate for genotyping etter behov før du bruker en pensel for å tørke larver på et vev. Bruk deretter tang til å overføre seks til åtte larver til et lysbilde tilberedt med dobbeltsidig tape.Før injeksjonen, bruk en mikropipetteavtrekker til å trekke kapillære rør inn i en standard nålform for D.Melanogaster injeksjoner og forankre nålene i leire i en petriskål. For embryoinjeksjon, bruk en 20 mikroliter gel-lasting pipette tips for å laste en forberedt nål med 5 mikroliter på 10 kilodalton dextran konjugert til sulforhodamine 101 syreklorid og laste nålen i en nålholder. Plasser nålen i en mikromanipulator festet til en stålbase og sett injeksjonsapparatet til 50 pounds per kvadrattomme og 5 til 10 millisekunder med en rekkevidde på 10.Plasser lysbildet på mikromanipulatorstadiet og børst kanten av nålen mot kanten av det dobbeltsidige båndet i en 45 graders vinkel for å skape en litt vinklet spiss brutt akkurat nok til å tillate strømning av 10 kilodalton dextran gjennom åpningen. Pump fotpedalen til fargestoffet er på tuppen av nålen. Juster nålen slik at den er parallell med embryoet og punkter den bakre enden av prøven.Pump fotpedalen for å injisere to nanoliter fargestoff i prøven. Legg merke til injeksjonstiden for inkubasjonsformål og fortsett nedover lysbildet for å injisere flere prøver. For larveinjeksjon, lag en litt større vinklet åpning enn den som brukes til å injisere embryoer og vinkle nålen litt nedover mot prøven før du injiserer larver med 220 nanoliter som ligner på som demonstrert for embryonale prøver.På slutten av den 10 minutters injeksjonsinkubasjonen, bruk en bomullstippapplikator til å påføre petroleumjell på høyre og venstre side av prøvene på lysbildet som avstandsslyst. Plasser dekselet på toppen og plasser lysbildet på konokkal mikroskopstadiet. Velg 20X-målet og bilde prøvene gjennom dybden av hvert embryo.Beregn deretter prosentandelen av prøver med en kompromittert blod-hjernebarriere i henhold til formelen. Før du begynner disseksjonsprosedyren, bruk neglelakk til å montere to dekselslips fordelt ca. 0,5 centimeter fra hverandre på et lysbilde og plasser en injisert larve i PBS på lysbildet på slutten av den 30 minutters inkubasjonen. Bruk ett par tang, ta tak i larven halvveis ned i larvalkroppen og bruk et andre par tang for å skille de fremre og bakre halvdelene av larven.Deretter bruker du ett par tang til å gripe den fremre regionen på munnkrokene og bruke det andre paret tang til å invertere kroppsveggen over spissen av det første paret med tang. Hjernen og ventral nerveledning vil bli utsatt. Skill hjernen og ventral nerveledning fra kroppsveggen ved å kutte nerver om nødvendig og fjerne kroppsveggen fra lysbildet.Dekk prøven med 10 mikroliter på 80% glyserol. Plasser deretter en dekkseddel på toppen av prøven for bildebehandling og bilde prøvene for å bestemme prosentandelen av prøver med en kompromittert blod-hjernebarriere som vist. Når vill type sent stadium 17 embryoer injiseres med 10 kilodalton dextran konjugert til sulforhodamin 101 syre klorid fluorescerende fargestoff, er det store dextranmolekylet utelukket fra ventral nerveledning, som forventet.Heterozygous rå 1 muterte embryoer viser en intakt blod-hjerne barriere, lik den som observeres i vill type kontroll embryoer. I motsetning viser homozygous raw 1 muterte embryoer defekter i integriteten til blod-hjernebarrieren, med 10 kilodalton dextran flom inn i ventral nerveledning, noe som indikerer en svikt i blod-hjernebarrieren for å danne. I vill type kontroll larval prøver, 10 kilodalton dextran ikke klarer å trenge inn i blod-hjernebarrieren og er utelukket fra hjernen og ventral nerveledning.Når du prøver denne prosedyren, er riktig aldring av embryoene avgjørende for å sikre at prøvene undersøkes i en alder der blod-hjernebarrieredannelse forventes å være fullført. Etter denne prosedyren kan mutanter som viser en kompromittert blod-hjernebarriere videreutvikles ved hjelp av genetikk, immunohistokjemi og mikroskopi for å bedre forstå genfunksjonen på cellenivå. Denne teknikken vil tillate forskere å identifisere flere gener som er kritiske for etablering og vedlikehold av blod-hjernebarrieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse av blodcellepopulasjoner i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Oppdragelse bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axenic og gnotobiotiske betingelser

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller for Visualisering Steroidogenic organer og deres Interaktiv organer med Farging i bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generasjon av en human iPSC-basert blod-brain barriere chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Hele dyrets avbildning av Drosophila melanogaster ved hjelp av mikrocomputert tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Live-Cell Imaging av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...