Name: assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Ф. Брайана Пикетта и доктора Родни Дейла за использование оборудования для инъекций. Эта работа финансировалась за счет финансирования исследований от Университета Лойола Чикаго до M.D., D.T., и JJ.

1. Коллекция образцов
<ol><li>Коллекция эмбрионов
	<ol><li>В каждой клетке коллекции эмбрионов, используйте как минимум 50 девственных женщин с 20-25 самцов для коллекций. Инкубировать эти мухи в бутылке с кукурузной мукой-агар пищи (Таблица материалов) в течение 1'2 дней до нача?...

<ol>
	<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain.">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li><li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier.">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).</li><li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila.">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li><li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li><li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity.">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes &amp; Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier.">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115 (2018).</li><li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+origin,+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo.">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li><li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression.">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li><li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+IV,+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family:+encounters+of+axons+and+glia.">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li><li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function.">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li><li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila.">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li><li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV/Caspr/Paranodin.">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li><li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+contactin,+a+homolog+of+vertebrate+contactin,+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function.">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li><li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system.">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li><li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li><li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein.">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators.">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).</li><li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+surface+glia+transcriptome:+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes.">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).</li><li>. BDSC Cornmeal Food Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017)</li><li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker.">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li><li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li><li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li><li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li><li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development.">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).</li><li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila.">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li><li>Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+Model+to+Study+the+Blood-Brain+Barrier.">Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier.</a> Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).</li><li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers.">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).</li><li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis.">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li></ol>

Этот протокол содержит подробное описание шагов, необходимых для оценки целостности BBB во время поздних эмбриональных и третьих этапов личинок D. melanogaster развития. Аналогичные подходы были описаны в другом месте, чтобы рассказать о целостности BBB во время развития, а также на взросл?...

Во время развития, клеточная связь и взаимодействия имеют решающее значение для создания структуры и функции тканей и органов. В некоторых случаях эти клеточные взаимодействия блокировать органы из окружающей среды для обеспечения надлежащей функции органа. Это относится к нервной системе, которая изолирована гематоэнцефалический барьер (BBB). Дисфункция BBB у людей была связана с неврологическими расстройствами, включая эпилепсию, и разрушение барьера наблюдается при нейродегенеративных заболеваниях, включая рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз1. У млекопитающих BBB образуется тесными соединениями между эндотелиальными клетками2,3. Другие животные, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster, имеют BBB, состоящий из глиальных клеток. Эти глиальные клетки образуют выборочно проницаемый барьер для контроля движения питательных веществ, отходов, токсинов и крупных молекул в и из нервной системы4. Это позволяет для поддержания электрохимического градиента, необходимого для противопожарного действия потенциалов, что позволяет мобильность и координацию4. В D. melanogaster, глия защитить нервную систему от калия богатых, кровь, как гемолимфа5.
В центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (PNS) D. melanogaster, два внешних глиальных слоя, субпериневральная глия и периневиальная глия, а также внешняя сеть внеклеточной матрицы, нейронная ламелла, образуют гемолимф-мозг и гемолимф-нервбарьер6, называют BBB на протяжении всей этой статьи. Во время развития субпериневральная глия становится полиплоидной и увеличивается, чтобы окружить нервнуюсистему5,6,7,9,10,11 . Субпериневриальное глия образуют перекрестные соединения, которые обеспечивают основной диффузионный барьер между гемолимфой и нервной системой5,6,12. Эти соединения молекулярно похожи на перегородки, как соединения, найденные в паранодах миелинизирующей глии у позвоночных, и они выполняют ту же функцию, что и плотные соединения в BBB млекопитающих13,14, 15 лет , 16 Год , 17. Периневиальная глия разделить, расти, и обернуть вокруг subperineurial глии для регулирования диффузии метаболитов и больших молекул6,10,18,19. Формирование BBB завершается на 18,5 ч после откладки яиц (AEL) при 25 градусах по Цельсию5,8. Предыдущие исследования выявили гены, которые являются критическими регуляторами формирования BBB20,21,22. Чтобы лучше понять точную роль этих генов, важно изучить влияние мутации этих потенциальных регуляторов на целостность BBB. Хотя предыдущие исследования наметили подходы для наблюдения BBB целостности эмбрионов и личинок, всеобъемлющий протокол для этого исследования до сих пор не описано5,7. Этот пошаговой протокол описывает методы для оценки целостности BBB во время эмбриональных и третьих этапов личинок.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1863</td>
			<td>Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22351656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>11000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>DeWalt</td>
			<td>D55140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple Juice</td>
			<td>Mott&#39;s Natural Apple Juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Household Bleach</td>
			<td></td>
			<td>1-5% Hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>19-062614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape 1/2&#34;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot Pedal</td>
			<td>Treadlite II</td>
			<td>T-91-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Caster</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Tray</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated sugar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased from grocery store.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil</td>
			<td>Lab Scientific, Inc.</td>
			<td>FLY-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Ace I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator Stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Filter Sets</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-LFS-CY</td>
			<td>For visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td>For visualization of GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Simply Simmons</td>
			<td>Chisel Blender #6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Base Plate</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Used for tissue dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with transmitted light source</td>
			<td>Baytronix</td>
			<td></td>
			<td>Used for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for blood-brain barrier integrity in drosophila melanogaster

Правильное развитие нервной системы включает в себя образование гематоэнцефалического барьера, диффузионного барьера, который жестко регулирует доступ к нервной системе и защищает нервную ткань от токсинов и патогенов. Дефекты в формировании этого барьера были связаны с невропатиями, и разрушение этого барьера наблюдалось во многих нейродегенеративных заболеваний. Поэтому крайне важно определить гены, которые регулируют формирование и поддержание гематоэнцефалического барьера для выявления потенциальных терапевтических целей. Для того, чтобы понять точную роль этих генов в нервном развитии, необходимо проанализировать влияние измененной экспрессии генов на целостность гематоэнцефалического барьера. Многие из молекул, которые функционируют в создании гематоэнцефалический барьер были найдены, чтобы быть сохранены через эукариотических видов, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster. Фруктовые мухи оказались отличной модельной системой для изучения молекулярных механизмов, регулирующих развитие и функционирование нервной системы. Этот протокол описывает пошаговую процедуру анализа целостности гематоэнцефалического барьера во время эмбриональных и личинок стадии развития D. melanogaster.

Описанные здесь методы позволяют визуализировать целостность BBB по всей ЦНС в эмбрионах D. melanogaster и личинках(рисунок 1). По завершении формирования BBB в конце эмбриогенеза, BBB функции, чтобы исключить большие молекулы из мозга и VNC5. Этот протокол использу?...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Кроветно-мозговой барьер целостности имеет решающее значение для работы нервной системы. В Drosophila melanogaster, гематоэнцефалический барьер образуется глиальными клетками во время позднего эмбриогенеза. Этот протокол описывает методы анализа для формирования гематоэнцефалический барьер формирования и поддержания в D. melanogaster эмбрионов и третьих личинок instar.

Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в Drosophila меланогастер

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся генетической регуляции формирования и поддержания гемового барьера на нескольких стадиях развития дрозофилы. Этот метод также может быть адаптирован для изучения проницаемости других барьеров, таких как кишечный эпителий в различных организмах. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет оценку функции гемового барьера в живых тканях.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как манипуляции с образцами могут быть трудными, а многие шаги требуют пристального внимания к деталям. Для сбора эмбрионов место как минимум 50 девственных женщин с 20 до 25 мужчин на бутылку с кукурузной муки Агар пищи и инкубировать эти мухи в течение одного-двух дней до начала коллекции. За день до сбора, теплый яблочный сок агар тарелки при 25 градусов по Цельсию на ночь.На следующее утро перенесите углекислый газ анестезированные мухи в коллекционные клетки и поместите предварительно разогретую агарную тарелку яблочного сока с небольшим мазком дрожжевой пасты на открытом конце клетки. Затем закретив тарелку в клетку красным рукавом. Чтобы очистить старые эмбрионы, позвольте мухам откладывать яйца на тарелку яблочного сока агара в течение одного часа при 25 градусах по Цельсию.В конце инкубации, инвертировать клетку сетки стороной вниз и нажмите мух на дно клетки. Замените агар яблочного сока новой предварительно разогретой тарелкой яблочного сока с небольшим мазком дрожжевой пасты. Дайте мухам отложить яйца на новую тарелку еще на час при 25 градусах по Цельсию.Чтобы собрать поздние эмбрионы 17-й стадии для инъекций, замените агаровую тарелку яблочного сока новой предварительно разогретой пластиной с мазком дрожжевой пасты. И позволить мухам откладывать яйца на тарелку при 25 градусах по Цельсию. После одного часа, заменить пластину и возраст пластины с собранными эмбрионами в течение 19 часов при 25 градусах по Цельсию, так что эмбрионы будут от 20 до 21 часов на момент визуализации.В конце 19-часовой инкубации снимите пластину сбора эмбрионов с инкубатора и накройте поверхность пластины PbTx. Используйте кисть, чтобы ослабить эмбрионы с поверхности пластины в 70-метровый нейлоновый сетчатый ситечко. И поместите ситечко с эмбрионами в 50%bleach раствор в 100-миллиметровую чашку Петри в течение пяти минут с случайным возбуждением при комнатной температуре, чтобы дехорионировать их.В конце инкубации, промыть эмбрионы три раза, закрученного ситечко в свежем PbTx, используя новую чашку Петри для каждой стирки. Вымойте эмбрионы в одну сторону ситечко с PbTx и использовать стеклянную пипетку для передачи эмбрионов на 2%agarose гель плиты. Удалите излишки жидкости с помощью фильтровальной бумаги.Выровнять шесть-восемь эмбрионов на плите с задней справа и спинной стороны вверх и твердо нажмите кусок двусторонний ленты, прикрепленной к слайду на верхней части эмбрионов. Затем высасывание эмбрионов при комнатной температуре в течение примерно 25 минут, прежде чем покрыть образцы галоуглеродным маслом. Для сбора личинок, создать крест с 5 до 10 девственных самок мух желаемого генотипа и в два раза больше мужчин желаемого генотипа во флаконе с Cornmeal Агар пищи.После пяти-семи дней при 25 градусах по Цельсию, в зависимости от генотипа, используйте типсы, чтобы аккуратно собрать блуждающие личинки третьей звезды из флакона и промыть личинки PBS, чтобы удалить любую застрявшую пищу. Передача личинок в яблочный сок агар пластины для генотипирования по мере необходимости, прежде чем использовать кисть, чтобы высушить личинки на ткани. Затем используйте миппы для переноса шести-восьми личинок на слайд, приготовленный с помощью двойной ленты.Перед инъекцией используйте шкив micropipette для того чтобы вытянуть капиллярные пробки в стандартную форму иглы для впрысков D.Melanogaster и закрепить иглы в глине в чашке Petri. Для инъекций эмбриона используйте наконечник трубчатого геля с 20 микролитерами для загрузки подготовленной иглы с 5 микролитров 10 килодальтонного декстрана, конъюгированных для сульфододамина 101 хлорида кислоты, и загрузите иглу в держатель иглы. Распоимить иглу в микроманипуляторе, закрепленном на стальной основе, и установить инъекционный аппарат до 50 фунтов на квадратный дюйм и от 5 до 10 миллисекунд с диапазоном от 10.Поместите слайд на стадии микроманипулятора и кисть края иглы против края двусторонний ленты под углом 45 градусов, чтобы создать слегка угловой кончик сломанной достаточно, чтобы поток 10 килодальтон dextran через отверстие. Насос педаль ноги, пока краситель находится на кончике иглы. Выровняй иглу так, чтобы она была параллельно эмбриону и проколола задний конец образца.Насос педаль ноги, чтобы ввести два нанолитров красителя в образец. Обратите внимание на время инъекций для инкубации целей и продолжить вниз слайд для введения дополнительных образцов. Для инъекций личинок сделайте немного больше углового отверстия, чем то, что используется для инъекций эмбрионов, и угол иглы немного вниз к образцу, прежде чем вводить личинки с 220 нанолитров похож на как попродемонстрировано для эмбриональных образцов.В конце 10-минутной инкубации инъекций используйте хлопчатобумажный аппликатор для применения вазелина на правой и левой сторонах образцов на слайде в качестве промека. Поместите крышку скольжения на вершине и поместите слайд на конфокальный микроскоп этапе. Выберите цель 20X и изображения образцов по всей глубине каждого эмбриона.Затем вычислите процент образцов с скомпрометированным гемово-мозговых барьеров в соответствии с формулой. Перед началом процедуры вскрытия используйте лак для ногтей, чтобы смонтировать два крышки скольжения, размеченные примерно на 0,5 сантиметра друг от друга на слайде, и поместите впрыскиваемую личинку в PBS на слайде в конце 30-минутной инкубации. Используя одну пару типсов, схватить личинку на полпути вниз личинки тела и использовать вторую пару типсов, чтобы отделить передние и задние половинки личинки.Далее используйте одну пару типсов, чтобы схватить переднюю область на крючках рта и использовать вторую пару типсов, чтобы инвертировать стенку тела над кончиком первой пары типсов. Мозг и брюшной нервный шнур будут подвергаться воздействию. Отделить мозг и брюшной нервный шнур от стенки тела, отделив нервы, если это необходимо, и удалить стенку тела со слайда.Обложка образца с 10 микролитров 80%глицерол. Затем поместите крышку скольжения на верхней части образца для изображения и изображения образцов, чтобы определить процент образцов с скомпрометированным геммоуф мозговых барьеров, как попродемонстрировано. Когда дикий тип поздней стадии 17 эмбрионов вводят с 10 килодальтон декстран конъюгированных сульфородамин 101 кислотный хлорид флуоресцентный краситель, большая молекула декстрана исключается из брюшного нерва шнура, как и ожидалось.Гетерозиготные сырые 1 мутантные эмбрионы обладают нетронутым геммозным барьером, аналогичным тому, который наблюдается у эмбрионов контроля дикого типа. В отличие от этого, гомозиготные сырые 1 мутант эмбрионов проявляют дефекты в целостности геммозефалический барьер, с 10 килодальтон декстран наводнения в брюшной нервный шнур, что свидетельствует о неспособности гемового барьера в форме. В образцах личинок дикого типа 10 килодальтонный декстран не проникает в гемово-мозговой барьер и исключается из мозга и брюшного нерва.При попытке этой процедуры, правильное старение эмбрионов имеет решающее значение для обеспечения образцов рассматриваются в возрасте, в котором гемовно-мозговой барьер формирования, как ожидается, будет завершена. После этой процедуры мутанты, демонстрировали скомпрометированный гемово-мозговой барьер, можно продолжить с помощью генетики, иммуногистохимии и микроскопии, чтобы лучше понять функцию генов на клеточном уровне. Этот метод позволит исследователям определить дополнительные гены, которые имеют решающее значение для создания и поддержания гем blood-brain barrier.

assay-for-blood-brain-barrier-integrity-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Опробование клеток крови народам<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личинка

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Выращивание дрозофилы<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Под аксенический и гнотобионтных Условия

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em&gt; Дрозофилы</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Методы тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Поколение человека iPSC основе крови мозга барьер чип

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Визуализация живых эксплантов мозга личинок третьего возраста Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

В центре внимания автора: Исследование асимметричной динамики деления клеток: протокол для визуализации в реальном времени эксплантов мозга личинок дрозофилы 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Визуализация живых клеток личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...