Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: F31-DK113666 (AWW)، K01-DK102868 (AMZ)، K08-DK106478 (KJW)، و P30-DK050306 (منحة تجريبية إلى KJW).

جميع الطرق التي تنطوي على استخدام الفئران تتفق مع المبادئ التوجيهية التي قدمتها IACUC من مكتب بن لرعاية الحيوان في جامعة بنسلفانيا.
1. إعداد الكاشف
<ol><li>
سيكلوهيكسميد
	<ol>
<li>لجعل 500 درجة مئوية من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، تعليق 50 ملغ من سيكلوهيكسميد في 500 ميكرولتر من ال?...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq هو تقنية لعزل نوع الخلية محددة من ترجمة mRNA عن طريق ريبوسوسومات ذات علامات النعت، ويقدم بديلا لنهج FACS، كما أنه يتحايل على القيود مثل متطلبات الوقت من FACS9. بدلا ً من ذلك، يسمح TRAP بعزل الحمض النووي الريبي بسرعة وكفاءة مباشرة من الأنسجة السائبة، مما يساعد على تجنب أي تغييرات ف...

كما الجهاز الأيضي الرئيسي في الفقاريات، والكبد هو المسؤول عن التوازن الجلوكوز، تخليق بروتين المصل، إفراز حمض الصفراء، والتمثيل الغذائي xenobiotic وإزالة السموم. الكبد يملك قدرة غير عادية لتجديد parenchyma المصابة عند التعرض للسموم لمنع فشل الكبد الفوري1. ومع ذلك، يمكن أن يحدث فشل التجديد في إعداد الأسيتامينوفين أو الكحول الإفراط في الاستهلاك، والتي يمكن أن تؤدي إلى فشل الكبد الحاد2. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسبب إصابة الكبد المزمنة الناجمة عن عدوى التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية، والتهاب الكبد الدهني تليف الكبد، وتليف الكبد، وسرطان الكبد الخلوي3. العلاج العلاجي الوحيد المتاح لمرض الكبد في المرحلة النهائية هو زرع ولكن محدودة بسبب نقص الأعضاء، ومنع العلاج الفعال لجميع المرضى4. وبالتالي فإن التوصل إلى فهم أفضل لعملية التعافي بعد إصابة الكبد السامة أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات لتحفيز التجدد الكافي لإنقاذ وظيفة في الجهاز المريض.
نظام النموذج الأكثر تطبيقا على نطاق واسع لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي في القوارض ، حيث يتم استئصال نسبة كبيرة من الكبد لتحفيز التوسع السريع في خلايا الكبد5. ومع ذلك، استئصال الكبد الجزئي لا يلخص توسع خلايا الكبد بعد إصابة الكبد السامة بسبب عدم وجود تسلل الخلايا المناعية ونخر الخلايا الكبدية غالبا ما لوحظ في وضع إصابة الكبد الحادفي البشر6. وهناك نظام أكثر ملاءمة لنمذجة هذا الشكل من تجديد الأعضاء هو فاه-/- الماوس، الذي يفتقر إلى fumarylacetoacetate الهيدرولاز الوظيفية (FAH) المطلوبة لعملية التمثيل الغذائي التيروزين السليم ويتطور تلف الكبد الشديد مما يؤدي إلى الموت7. ويمكن الحفاظ على هذه الفئران في حالة صحية إلى أجل غير مسمى عن طريق العلاج مع نيتيزينون المخدرات في مياه الشرب. بدلا من ذلك، يمكن استعادة التعبير FAH عن طريق تسليم transgene إلى مجموعة فرعية من خلايا الكبد، والتي سوف تتوسع لإعادة ملء الكبد عند إزالة نيتيسينون8.
لتوصيف التغيرات في التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد، هناك حاجة إلى أداة لعزل خلايا الكبد المتماثلة على وجه التحديد في فاه-/- الماوس دون تلوث من خلايا الكبد المصابة المجاورة وأنواع الخلايا الأخرى. لسوء الحظ، فرز الخلايا بمساعدة الفلورة (FACS) من خلايا الكبد من الصعب منذ (1) هشاشة إعادة ملء خلايا الكبد يؤدي إلى الانتعاش الفقراء بعد التسريب الكبد، (2) تكرار خلايا الكبد هي متغيرة للغاية في الحجم، مما يجعل العزلة من السكان نقية من قبل FACS صعبة، و (3) وقت الإجراء من التسريب الكبد لعزل الحمض النووي الريبي هو أكبر من 2 ح، وبالتالي ملامح التعبير الجيني قد تخضع لتغييرات اصطناعية كبيرة قبل الحصول على عينات9.
بدلا من ذلك، فإن التعبير عن ريبوسوسومات ذات علامات النعوت على وجه التحديد في إعادة ملء خلايا الكبد يسمح للعزل السريع من ترجمة بنشاط mRNA ملزمة الريبوسوسوم باستخدام تنقية التقارب مباشرة بعد حصاد الأعضاء، مع الكبد السائبة الأنسجة lysates. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتنفيذ ترجمة الريبوسوم تنقية التقارب (TRAP)10 تليها عالية الإنتاجية RNA-التسلسل (TRAP-seq)، لعزل على وجه التحديد والملف الشخصي mRNA في إعادة ملء خلايا الكبد في Fah-/- الماوس9. التعبير المشترك للبروتين الفلورسنت الأخضر الموسومة ريبوسومال (GFP: RPL10A) مع FAH يسمح تنقية تقارب ترجمة mRNA ملزمة polysomes التي تحتوي على GFP: RPL10A. يتفادى هذا الأسلوب أي خطوات تفكك الخلايا، مثل التسريب الكبد لعزل الخلايا الكبدية الهشة. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم lysis من أنسجة الأعضاء كلها والأجسام المضادة لاستخراج بسرعة الحمض النووي الريبي على وجه التحديد من الخلايا المستهدفة. وأخيراً، فإن عزل الميرنا الوفيرة وعالية الجودة عن طريق TRAP-seq يمكّن التطبيقات النهائية مثل تحليل التسلسل من تحديد التغير الديناميكي في التعبير الجيني أثناء عملية إعادة السكان.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

إعادة سكان الكبد بعد الإصابة هي سمة حاسمة من سمات الثدييات التي تمنع الفشل الفوري للأعضاء والوفاة بعد التعرض للسموم البيئية. ويمكن أن يساعد الفهم الأعمق للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إعادة التجمعات السكانية في تحديد الأهداف العلاجية لتعزيز استعادة وظيفة الكبد في تحديد الإصابات. ومع ذلك، فإن أساليب عزل خلايا الكبد المعاد إسكانها على وجه التحديد تمنعها عدم وجود علامات الخلايا، وأرقام الخلايا المحدودة، وهشاشة هذه الخلايا. تطوير ترجمة تكنولوجيا تنقية التقارب الريبوسوسوم (TRAP) جنبا إلى جنب مع نموذج فاه-/- الماوس لتلخيص إعادة السكان في وضع إصابة الكبد يسمح بتوصيف التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد. مع TRAP، يتم عزل mRNA ترجمة نوع الخلية بسرعة وكفاءة. قمنا بتطوير طريقة تستخدم TRAP مع العزلة القائمة على التقارب من ترجمة mRNA من خلايا الكبد التي تعبر بشكل انتقائي عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسومة بروتين ريبوسومال (RP)، GFP:RPL10A. TRAP يتحايل على الفترة الزمنية الطويلة المطلوبة لفرز الخلايا المنشطة الفلورية التي يمكن أن تغير ملف تعريف التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، منذ فقط إعادة ملء خلايا الكبد التعبير عن GFP: RPL10A بروتين الانصهار، وmRNA معزولة خالية من التلوث من خلايا الكبد المصابة المحيطة بها وأنواع الخلايا الأخرى في الكبد. وmRNA تنقية التقارب هي ذات جودة عالية ويسمح المصب PCR- أو عالية الإنتاجية تحليل التسلسل القائم على التعبير الجيني.

لتوصيف التعبير الجيني في إعادة ملء خلايا الكبد من Fah-/- الماوس، Gfp:Rpl10a الانصهار وFah transgenes يتم تسليمها بشكل مشترك داخل transposon التي تحتوي على بلازميد8 (ناقلات TRAP) إلى الكبد من قبل حقن الهيدروديناميك(الشكل 1ألف). إزالة ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

ترجمة تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP) تمكن العزل السريع والفعال للخلية نوع محدد ترجمة mRNA. هنا، نقوم بشرح طريقة تجمع بين حقن الوريد الخلفي الهيدروديناميكي في نموذج الماوس لإعادة السكان الكبد وTRAP لدراسة ملف تعريف التعبير عن إعادة ملء خلايا الكبد.

تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

مع TRAP-seq، يمكننا عزل الحمض النووي الريبي من أنواع خلايا محددة، مثل خلايا الكبد التي تُعاد اكتظاظها في الكبد المصاب لتحليل تغيرات التعبير الجيني التي تحدث في تلك الخلايا. لا يتطلب أي خطوات لإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من الأنسجة. يتم عزل الحمض النووي الريبي النوع من الخلية عن طريق تنقية تقارب من lysates الجهاز كله.تساعدنا هذه التقنية على تحديد كيفية استجابة خلايا محددة للإصابات، والتي يمكن أن تساعد في تحديد استراتيجيات أو أدوية جديدة لمكافحة أمراض الكبد. ويمكن استخدام هذا لتحديد كيفية استجابة خلايا الكبد لأنواع مختلفة من إصابات الكبد. حاليا, هناك عدد قليل من الخيارات لإصابات الكبد الحادة الحادة للغاية وهذه الطريقة سوف تساعد على دليل لنا في لعلاجات جديدة.هذه الطريقة نشأت في الدماغ. في الكبد، تصورنا أنه يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الديناميكية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، وخلايا الكبد، وخلايا القناة الصفراوية، وخلايا كوبفر، وخلايا البطانية على سبيل المثال لا الحصر. إثبات الإجراء سيكون العنبر وانغ، طالب الدراسات العليا وmentee بلدي.للبدء، resuspend الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب لطيف. جمع الخرز على موقف مغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة supernatant. ثم، إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، تليها الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل الخرز.وضع أنبوب مرة أخرى على موقف المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة لجمع الخرز وإزالة برنامج تلفزيوني. لإعداد الخرز المغلفة بالبروتين ، أضف 16 ميكرولتر من البروتين الحيوي L إلى الخرز المغناطيسي المغطى والمغسلة وأضف 1X PBS لجعل الحجم النهائي ملليلتر واحد ، إذا استخدم أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، أو 1.5 ملليلتر ، إذا باستخدام أنبوب microcentuge ذو ملليلتر. احتضان الخرز المغناطيسي مع البروتين الحيوي L لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار أنبوب.ثم، وضع أنبوب على موقف المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة افرنح لجمع البروتين L-المغلفة الخرز. إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مع 3٪ BSA العازلة، تليها الأنابيب لطيف خمس مرات على الأقل لغسل الخرز البروتين المغلفة L. مرة أخرى، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة ناظر لجمع الخرز المغلفة.كرر غسل BSA أربع مرات أخرى. بعد ذلك، إضافة 50 ميكروغرام من الأجسام المضادة للأجسام المضادة GFP 19C8 والأجسام المضادة GFP 19F7 لكل منهما في الخرز المغلفة L البروتين، واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية على دوار أنبوب. لجمع مصفوفة التقارب، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وأزالة المناط.اتخاذ أنبوب بعيدا عن موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من العازلة منخفضة الملح. بلطف الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل مصفوفة تقارب وتكرار غسل العازلة منخفضة الملح مرتين أخرى. Resuspend الخرز في 200 ميكرولترات من العازلة منخفضة الملح ، لجعل 200 ميكرولترات من مصفوفة تقارب.أولاً، قم بإعداد طاحونة الأنسجة بحيث يمكن وضع الأنابيب الزجاجية PTFE على الجليد أثناء التجانس. ملء أربعة ملليلتر من عازلة التحلل الباردة في أنابيب الزجاج PTFE. وضع الكبد على طبق بيتري.استخدم سكينا لعزل 200 إلى 500 ملليغرام من قطع الكبد والانتقال إلى أنابيب الزجاج PTFE. ضع أنسجة الكبد المتبقية في أنبوب microcentuge المبردة مسبقًا وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل. التجانس العينات في التجانس المحرك يحركها، بدءا من 300 دورة في الدقيقة لمدة خمس ضربات على الأقل لتفكك خلايا الكبد من بنية الكبد.خفض أنبوب الزجاج في كل مرة. منع التهيّم، الذي يمكن أن يسبب denaturation البروتين، عن طريق الحفاظ على الآفة تحت المحلول. ثم، رفع السرعة إلى 900 دورة في الدقيقة لتجانس أنسجة الكبد تماما لمدة 12 السكتات الدماغية الكاملة على الأقل.نقل lysate في أنابيب وصفت وpre-chilled مع ما لا يزيد عن ملليلتر واحد من lysate لكل من. للبدء في التحليل النووي، الطرد المركزي الكبد lysate في 2، 000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، ثم نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد متجمد قبل microcentuge على الجليد. إضافة 1/9th من حجم عظمى من 10٪ NP-40 في أنبوب microcentrifuge على الجليد وخلط الحل عن طريق عكس بلطف الأنبوب.تدور بسرعة أسفل أنابيب microcentrifuge مع جهاز طرد مركزي صغير وإضافة 1/9th من حجم العينة من 10٪ DOC. مزيج عن طريق عكس بلطف أنابيبrifuge microcents وتدور بسرعة أسفل أنابيب microcentrifuge واحتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي النووي في 20، 000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ونقل سوبرانت إلى أنابيب جديدة قبل المبردة microcentuge على الجليد.لكل أنبوب، أخرج 1٪ من الحجم الإجمالي للمرجح كتحكم قبل المناعي. ضع ضوابط ما قبل المناعي على دوار أنبوب عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. خذ المزيد من الحذر لإعادة تعليق بلطف مصفوفة التقارب عن طريق الأنابيب، ثم إضافة 200 ميكرولترات إلى كل عينة.احتضان ال ليسات في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع خلط لطيف على دوار أنبوب. لعزل الجيش الملكي النيبالي، تدور بسرعة أسفل الأنابيب التي تحتوي على lysates في جهاز الطرد المركزي مصغرة وجمع الخرز عن طريق وضع على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل. جمع المغرور في أنابيب microcentuge إضافية.إضافة ملليلتر واحد من العازلة الطازجة عالية الملح إلى كل أنبوب، تليها الأنابيب لطيف خمس مرات على الأقل دون إدخال فقاعات. جمع الخرز على موقف مغناطيسي على الجليد لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة ناظر. كرر خطوات الغسيل أربع مرات أخرى.ثم، إزالة أنابيب microcentrifuge من موقف المغناطيسي ومكان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لتسخين. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة تحلل مع 0.7 ميكرولترات من بيتا ميركوبتويثانول لإطلاق سراح الجيش الملكي النيبالي ملزمة من مصفوفة تقارب. دوامة الأنابيب لمدة خمس ثوان على الأقل في أعلى سرعة وتدور بسرعة إلى أسفل.ثم، احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم جمع افرنح والمضي قدما على الفور لتنظيف RNA وفقا لبروتوكول تنقية RNA في عدة. لتحقيق أقصى جودة للرنا المعزول، قم بتنفيذ جميع الخطوات الاختيارية، بما في ذلك هضم DNase وجميع خطوات الرنا، بما في ذلك التسخين المسبق الموصى به من عازلة elution إلى 60 درجة مئوية.في هذه الدراسة, GFP-L10A الانصهار وTransgenes FAH تم تسليمها المشتركة داخل ناقلة فخ بلازميد يحتوي على transposon إلى الكبد عن طريق حقن هيدرودينامي. إزالة النيتسينون تسبب إصابة الكبد السامة. وأكد تلطيخ المناعة coexpression من FAH وGFP-L10A البروتين الانصهار و الكبد إعادة إسكان بعد أسبوعين من إعادة السكان الكبد.أنتجت العينة هادئة أعلى عائد من البروتين الانصهار، منذ جميع الكبد التعبير عن GFP-L10A بعد حقن AAV8-TBG-Cre. وعلى العكس من ذلك، بالكاد كان أي RNA يمكن اكتشافه في الضوابط من النوع البري التي لم يكن لديها transgene GFP-L10A، مما يشير إلى الإجراء TRAP هو محدد للغاية ولديه خلفية منخفضة. عندما تم استخدام TRAP على أنسجة الكبد التي تمر باعادة الاكتظاظ مع GFP-L10A الخلايا الكبدية المستحثة، تم الحصول على RNA وفيرة عالية الجودة.وعلى النقيض من ذلك، لم يتم الكشف عن أي أثر للرنا عبر Bioanalyzer لعينة التحكم السلبية. تم تحريض تعبير Gsta1 بأكثر من عشرة أضعاف في إعادة اكتظاظ خلايا الكبد مقارنة بال hepatocytes هادئة، في حين تم الكشف عن أي قيم دورة العتبة مع RNA TRAP معزولة من الماوس نوع البرية بسبب عدم وجود RNA الإدخال. عند تجانس الأنسجة ، تأكد من تحريك الآفة ببطء لمنع التهيج.بعد عزل الحمض النووي الريبي، يمكن إجراء تسلسل عالي الإنتاجية أو qPCR لتحليل التعبير الجيني. مع TRAP-seq، لدينا الآن طريقة لعزل الجيش الملكي النيبالي على وجه التحديد من خلايا الكبد وإعادة اكتظاظ وتحليل التغير في التعبير الجيني أثناء إعادة السكان الكبد. وهذا يسمح لنا بتحديد الجينات التي يتم تغييرها خلال هذه العملية والأهداف العلاجية المحتملة لعلاج إصابات الكبد.Cycloheximide وDTT ، التي توجد في عدة مخازن ، على حد سواء سامة. وينبغي جمع النفايات والتخلص منها وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Electroporation في الجسم الحي وخارج الرحم للتعبير الجينات في خلايا الشبكية العقدة ماوس

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

متغايرة النوى وتقنيات لتحليل نوع من الترجمة الخاصة الخليوي

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...