Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

这项工作得到了以下赠款的支持：F31-DK113666（AWW）、K01-DK102868（AMZ）、K08-DK106478（KJW）和P30-DK050306（KJW试点赠款）。

所有涉及使用小鼠的方法都符合宾夕法尼亚大学宾夕法尼亚大学宾夕法尼亚大学动物福利办公室IACUC提供的指南。
1. 试剂制备
<ol><li>
赛克洛赫西米德
	<ol>
<li>要使500μL为0.1克/mL环氧西米，在500μL甲醇中悬浮50毫克环己酰胺。 警告：环己酰胺对环境毒性极强，可引起先天性畸形。所有含有环己酰胺的废物和缓冲液应收集，以便妥善处置。 注...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq是一种通过表位标记核糖体翻译mRNA的细胞类型特异性分离技术，它提供了FACS方法的替代方法，因为它规避了FACS9的时间要求等限制。相反，TRAP允许从散装组织中直接快速有效地分离RNA，帮助避免基因表达的任何改变。TRAP-seq特别适合用于重新填充Fah-/-小鼠肝脏，因为去除尼西酮后的肝细胞扩张是细胞自主的，并且通过集成功能使肝细胞子集的基因表达分析?...

肝脏作为脊椎动物的主要代谢器官，负责葡萄糖平衡、血清蛋白合成、胆汁酸分泌、异种生物代谢和排毒。肝脏具有非凡的能力，在接触毒素时再生受伤的帕伦奇马，以防止立即肝衰竭1。然而，再生失败可能发生在对乙酰氨基酚或酒精过量消费的设置，这可能导致急性肝衰竭2。此外，病毒性肝炎感染、脂肪肝、脂肪性肝炎引起的慢性肝损伤可引起肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌3。治疗终末期肝病的唯一治疗方法是移植，但受器官短缺的限制，无法对所有患者进行有效治疗。因此，更好地了解毒性肝损伤后的恢复过程对于开发治疗以刺激足以挽救患病器官功能的再生至关重要。
肝再生研究应用最广的模型系统是啮齿动物的局部肝切除术，其中大部分肝脏被切除以刺激肝细胞快速扩张5。然而，部分肝切除术不重述肝细胞扩张后，毒性肝损伤，由于缺乏免疫细胞渗透和肝细胞坏死经常观察到在急性肝损伤设置在人类6。一个更合适的系统来模拟这种形式的器官更新是Fah-/-小鼠，它缺乏功能性紫甲酸氢酶（FAH）所需的适当的酪氨酸代谢，并开发严重的肝脏损伤，导致死亡7。通过饮用水中的药物尼他酮治疗，这些小鼠可以无限期地保持健康状态。或者，FAH表达可以通过转基因递送到肝细胞的子集来恢复，在消除尼西酮8时，肝细胞将膨胀以重新填充肝脏。
为了分析重新填充肝细胞的基因表达变化，需要一种工具，专门分离Fah-/-小鼠中复制的肝细胞，而不受邻近受伤的肝细胞和其他细胞类型的污染。不幸的是，肝细胞的荧光辅助细胞分拣（FACS）很困难，因为（1）肝细胞再生的脆弱性导致肝灌注后恢复不良，（2）复制肝细胞的大小变化很大，使得隔离纯种群由FACS困难，和（3）从肝脏灌注到RNA分离的手术时间大于2小时，因此基因表达谱可能在采集样品之前发生重大人工变化。
或者，表位标记核糖体的表达，专门在重新填充肝细胞允许快速分离积极翻译mRNA结合核糖体结合在器官收获后立即亲和纯化，与散装肝脏组织莱沙。在这里，我们描述了一个协议，以执行翻译核糖体亲和纯化（TRAP）10，然后是高通量RNA测序（TRAP-seq），在Fah-/- 中特别分离和剖分mRNA，以重新填充肝细胞- /-鼠标9.绿色荧光蛋白标记核糖体蛋白（GFP：RPL10A）与FAH的共聚体蛋白（GFP：RPL10A）与FAH的共聚体结合，允许通过含有GFP：RPL10A的聚体结合的翻译mRNA进行亲和纯化。这种方法避免了任何细胞分离步骤，如肝脏灌注，以分离脆弱的再生肝细胞。相反，它利用整个器官组织和抗体的解毒，快速从靶细胞中快速提取RNA。最后，通过TRAP-seq分离大量、高质量的mRNA，使测序分析等下游应用能够分析基因表达在再填充过程中的动态变化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

受伤后肝脏重新填充是哺乳动物的一个关键特征，它可以防止在接触环境毒素后立即导致器官衰竭和死亡。更深入地了解重放期间发生的基因表达变化，有助于确定治疗目标，促进损伤环境中肝功能的恢复。然而，由于缺乏细胞标记、细胞数量有限以及这些细胞的脆弱性，特别分离重新造血肝细胞的方法受到抑制。结合Fah-/-小鼠模型，在肝损伤设置中重述再填充，使核糖体亲和纯化（TRAP）技术得以转化，从而允许重新填充的基因表达分析肝 细胞。使用TRAP，细胞类型特异性翻译mRNA被快速有效地分离。我们开发了一种方法，利用TRAP与基于亲和力的分离，从肝细胞翻译mRNA，选择性地表达绿色荧光蛋白（GFP）标记核糖体蛋白（RP），GFP：RPL10A。TRAP 绕用荧光激活细胞分类所需的长时间，可改变基因表达轮廓。此外，由于只有重新填充的肝细胞表达GFP：RPL10A融合蛋白，分离的mRNA没有来自周围受伤的肝细胞和肝脏中其他细胞类型的污染。亲和力纯化的mRNA是高质量的，允许下游PCR或高通量测序基于基因表达的分析。

为了在重新填充Fah-/-小鼠的肝细胞中分析基因表达，Gfp：Rpl10a融合和法赫转基因在含有质粒的转位子8（TRAP载体）中共同传递到肝脏，流体动力学注射 （图 1A）去除尼西酮诱导毒性肝损伤，为肝细胞产生选择压力，使其能稳稳地表达FAH，以重新填充受伤的帕伦奇马9。免疫?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

翻译核糖体亲和性纯化（TRAP）可实现细胞类型特异性翻译mRNA的快速和高效分离。在这里，我们演示了一种将水动力尾静脉注射与肝脏再填充小鼠模型和TRAP相结合的方法，以检查重新填充肝细胞的表达特征。

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达分析

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

使用 TRAP-seq，我们可以从特定的细胞类型中分离出RNA，例如在受伤肝脏中重新填充的肝细胞，以分析这些细胞中发生的基因表达变化。它不需要任何步骤来去除组织中不需要的细胞。细胞特异性RNA通过从整个器官的亲和纯化分离。这项技术帮助我们确定特定细胞对损伤的反应，这有助于确定对抗肝病的新策略或药物。这可以用来识别肝细胞对不同类型的肝损伤的反应。目前，有很少的选择，严重的急性肝损伤，这种方法将有助于线索，我们到新的治疗方法。这种方法起源于大脑。在肝脏中，我们设想它可以用来检查各种细胞类型的动态变化，肝细胞，胆道细胞，库普弗细胞和内皮细胞，举几例。演示程序将是琥珀王，一个研究生和我的门名。首先，通过温和的移液重新悬浮磁珠。将磁支架上的珠子收集超过一分钟，然后取出上经剂。然后，从磁性支架上取出微离心管，加入一毫升PBS，然后上下移液清洗珠子。将管子放回磁性支架上超过一分钟，收集磁珠并取出 PBS。要准备蛋白质L涂层珠子，在重新悬浮和洗涤的磁珠中加入16微升的生物素化蛋白L，如果使用1.5毫升微离心管，则加入1X PBS，使最终体积为1毫升，如果使用2毫升微离心管，或1.5毫升。在室温下，用生物素化蛋白L孵育磁珠35分钟。然后，将管子放在磁性支架上超过一分钟，取出上清液以收集蛋白质 L 涂层珠。从磁性支架上取出微离心管，用 3%BSA 缓冲液加入一毫升 PBS，然后轻轻移液至少五次，以清洗蛋白 L 涂层珠子。再次，将管子放在磁性支架上超过一分钟，取出上经剂以收集涂层珠子。再重复 BSA 洗涤四次。接下来，将50微克的GFP抗体19C8和GFP抗体19F7加入蛋白质L涂层珠，在4摄氏度的管旋转器上孵育1小时。要收集亲和力矩阵，请将管子放在磁性支架上超过一分钟，然后取出上经剂。将管子从磁性支架上拿开，加入一毫升低盐缓冲液。轻轻上下移液，清洗亲和力矩阵，再重复低盐缓冲液再洗两次。将珠子重新填充在200微升的低盐缓冲液中，使200微升的亲和力矩阵。首先，设置组织研磨机，使PTFE玻璃管在均质过程中可以放在冰上。将四毫升冷解液缓冲液填充到PTFE玻璃管中。将肝脏放在培养皿上。使用刀分离200至500毫克的肝脏碎片，并进入PTFE玻璃管。将剩余的肝脏组织放入预冷的微离心管中，并在液氮中闪冻。在电机驱动的均质器中均匀化样品，从 300 rpm 开始至少五次冲程，将肝细胞与肝脏结构分离。每次降低玻璃管。防止呼吸，这可能会导致蛋白质变性，保持溶液下面的害虫。然后，将转速提升至 900 rpm，使肝脏组织完全均匀，至少进行 12 次全冲程。将落酸转移到标签和预冷却管中，每个管不超过一毫升的落酸。为了开始核解解，将肝脏在4摄氏度下以2000次g离心，10分钟，然后将上流液转移到冰上一个新的预冷却微离心管。将10%NP-40的上半液体积的1/9加入冰上微离心管中，轻轻反转管，混合溶液。使用微型离心机快速旋转微离心管，加入 10% DOC 的 1/9 样品体积。通过轻轻反转微离心管混合，快速旋转微离心管并在冰上孵育五分钟。将2万次甘酸的核酸盐在4摄氏度下离心10分钟，然后将上流水液转移到新的冰上冷却前的微离心管上。对于每根管子，将上每根液的1%作为免疫前沉淀控制。将免疫前沉淀控制装置在四摄氏度的管旋转器上放置一夜。格外小心，通过移液轻轻重新暂停亲和矩阵，然后向每个样品添加 200 微升。在四摄氏度下孵育赖酸盐过夜，在管旋转器上轻轻混合。要分离RNA，请快速旋转微型离心机中含有裂酸的管，然后通过放置在磁架上至少放置一分钟来收集珠子。在额外的微离心管中收集上流液。在每个管中加入一毫升新鲜高盐缓冲液，然后轻轻移液至少五次，而不产生气泡。将磁性支架上的珠子收集超过一分钟，然后取出上一液。再重复四次洗涤步骤。然后，从磁性支架上取出微离心管，在室温下放置五分钟以预热。将珠子用0.7微升β-墨二甲醇在100微升的解解缓冲液中，从亲和力基质中释放结合RNA。以最高速度旋转管至少五秒钟，然后快速向下旋转。然后，在室温下孵育管子10分钟。将管子放在磁性支架上至少一分钟，然后收集上经剂，然后根据试剂盒中的RNA纯化方案立即进行RNA清理。为了达到分离RNA的最大质量，执行所有可选步骤，包括DNase消化和所有RNA洗脱步骤，包括建议将洗脱缓冲液预热至60摄氏度。在这项研究中，GFP-L10A融合和法赫转基因通过流体动力学注射在含有转波子质粒的诱捕载体中共同传递到肝脏。尼西诺酮的去除引起肝毒性损伤。免疫荧光染色证实了FAH和GFP-L10A融合蛋白的共表达，以及肝脏再填充两周后重新填充的肝细胞。由于所有肝细胞在AAV8-TBG-Cre注射后都表达GFP-L10A，因此该基质样品产生最高产量的融合蛋白。相反，在野生型对控中，几乎没有任何RNA被检测到，这些对控制没有GP-L10A转基因，这表明 TRAP程序非常具体，背景较低。当 TRAP 用于肝组织使用 GFP-L10A 转导肝细胞重新填充时，获得了丰富的高质量RNA。相比之下，没有通过生物分析器检测出对阴性对照样品的RNA微量。与静态肝细胞相比，Gsta1表达在重新填充肝细胞时诱导了十倍以上，而由于缺乏输入RNA，未检测到野生型小鼠的 TRAP 隔离 RNA 的阈值周期值。当组织均质时，确保缓慢移动害虫，以防止气化。隔离RNA后，可以进行高通量测序或qPCR分析基因表达。使用 TRAP-seq，我们现在有一种方法，专门分离RNA从重新填充的肝细胞，并分析在肝脏重新填充期间基因表达的变化。这使我们能够识别在这个过程中改变的基因和治疗肝损伤的潜在治疗目标。环氧胺和DTT，存在于几个缓冲液中，都是有毒的。应根据体制准则收集和丢弃废物。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

科研

生物学

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

在子宫内和前体内的基因表达在小鼠视网膜神经节细胞的电穿孔

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

脊髓电

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

使用基因脉冲MXcell电穿孔系统主细胞的转染效率高

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

激光显微切割的从细胞的一个子集基因表达分析中的应用果蝇永光盘

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

使用自动细胞计数器简化基因表达研究：在Namalwa细胞的IL - 4依赖的基因表达的siRNA击倒

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

调查组织和器官特定的光敏色素反应，使用流式细胞仪辅助细胞类型特定的表达谱拟南芥</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

异核技术的细胞类型特异性定位分析

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

在体外重组活跃T。谷盗端粒酶

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

监测细胞自主的生物钟节律基因表达，利用荧光素酶生物发光记者

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...